CN117050158B - 一种红嘴鸥IFN-γ基因及其编码的重组蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种红嘴鸥IFN‑γ基因及其编码的重组蛋白的应用，属于生物学领域。首先发现红嘴鸥IFN‑γ基因，然后将红嘴鸥IFN‑γ基因与pET32a(+)载体重组得到原核表达质粒，将重组原核表达质粒转化至Transetta(DE3)表达菌，加入IPTG诱导剂诱导蛋白表达，通过纯化得到重组蛋白，用重组蛋白，新城疫病毒分别与红嘴鸥淋巴细胞共孵育后检测相关基因转录水平，再用重组蛋白和新城疫病毒（NDV)共同与红嘴鸥淋巴细胞共孵育后检测相关基因转录水平，说明NDV孵育红嘴鸥淋巴细胞后激活了红嘴鸥免疫系统，重组蛋白IFN‑γ起到抗NDV作用。

Description

一种红嘴鸥IFN-γ基因及其编码的重组蛋白的应用

技术领域

本发明涉及一种红嘴鸥IFN-γ基因及其编码的重组蛋白的应用，属于生物学领域。

背景技术

干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）具有较强的免疫调节功能，对淋巴细胞具有激活作用，提高抗体依赖的细胞毒反应，增强免疫细胞的免疫活性。

IFN-γ的功能已在多种物种中得到验证，其积极的抗病毒及免疫调节能力备受关注。然而，关于野生鸟类红嘴鸥IFN-γ的功能还未被报道。红嘴鸥是鸥科鸥属的一种野生且具有迁徙行为的鸟类，然而野生鸟类自身以及在迁徙过程中容易感染和携带病毒，其迁徙距离长、种群数量多和个体差异性大等特征，极易导致病毒的传播与流行。天然免疫系统是宿主抵御病毒感染的第一道防线，对急性病毒感染和疾病的预后意义重大，对适应性免疫的激活有着极为关键的作用。为此本发明通过克隆红嘴鸥IFN-γ基因CDS序列，为研究红嘴鸥免疫系统功能提供重要的技术资料与科学依据。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种红嘴鸥IFN-γ基因的核苷酸序列，所述基因序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

本发明的目的之二是提供表达红嘴鸥IFN-γ基因的重组蛋白，将红嘴鸥IFN-γ基因与pET32a(+)双酶切后连接，构建重组表达质粒pET32a-IFN-γ，将重组原核表达质粒pET32a-IFN-γ转化至Transetta(DE3)表达菌，用IPTG对重组菌株进行诱导，采用包涵体洗涤的方法对重组蛋白进行初步纯化，为进一步获得较为单一的重组蛋白，将包涵体蛋白通过Ni柱进行纯化得到重组蛋白，该重组蛋白具有如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明目的之三是提供所述所述表达红嘴鸥IFN-γ基因的重组蛋白在制备抗新城疫病毒药物中的应用。

重组蛋白与新城疫病毒孵育淋巴细胞后，检测相关基因的表达量，检测结果提示IFN-γ参与Ⅰ型干扰素通路中共同的干扰素刺激基因Mx基因的调控，从而发挥免疫调节功能而产生抗病毒作用。重组蛋白可以提高红嘴鸥IFN-γ与Mx基因的转录水平，因此，IFN-γ可提前对宿主提供免疫保护，并参与一个放大循环，迅速预警邻近细胞以及先天免疫系统中的其他效应细胞可能发生的感染，从而建立免疫系统对抗感染的预备状态。

本发明的有益效果

本发明首次发现了红嘴鸥IFN-γ基因，并通过PCR扩增红嘴鸥IFN-γ基因的CDS区域，体外探究红嘴鸥IFN-γ在免疫应答过程中对干扰素激活通路中相关基因的调控和抗NDV作用。

附图说明

图1为实施例2中红嘴鸥外周血淋巴细胞的RNA琼脂糖凝胶电泳结果（M:DL2000DNA Maker；1-3:外周血淋巴细胞总RNA）；

图2为实施例3中PCR扩增红嘴鸥IFN-γ基因CDS琼脂糖凝胶电泳结果（M:DL2000DNA Maker；1-3:红嘴鸥IFN-γ基因的CDS区PCR扩增）；

图3为实施例4中pMD18-T-IFN-γ-EX的PCR扩增验证琼脂糖凝胶电泳结果（M:DL2000 DNA Maker；1:pMD18-T-IFN-γ-EX的PCR扩增验证）；

图4为实施例4中pMD18-T-IFN-γ-EX的双酶切验证琼脂糖凝胶电泳结果（M:DL2000 DNA Maker；1:pMD18-T-IFN-γ-EX的双酶切验证）；

图5为实施例5中重组原核表达质粒pET32a-IFN-γ的PCR扩增验证琼脂糖凝胶电泳结（M:DL2000 DNA Maker；1:pET32a-IFN-γ的PCR扩增验证）；

图6为实施例5中组原核表达质粒pET32a-IFN-γ的双酶切验证琼脂糖凝胶电泳结果（M:DL2000 DNA Maker；1-2:pET32a-IFN-γ的双酶切验证）；

图7为实施例6重组蛋白的诱导表达结果（A：M:蛋白质分子质量标准；1:pET32a-IFN-γ诱导；2:pET32a-IFN-γ未诱导；3:pET32（+）诱导；4:pET32（+）未诱导；B：M:蛋白质分子质量标准；1:pET32a-IFN-γ诱导；2:pET32a-IFN-γ未诱导；5:无质粒诱导；6:无质粒未诱导）；

图8为实施例7重组蛋白可溶性分析结果（M:蛋白质分子质量标准；1:超声破碎菌体后沉淀；2:超声破碎后菌体上清液）；

图9为实施例7包涵体洗涤方法对重组蛋白进行初步纯化结果（A：M:蛋白质分子质量标准；1:包涵体溶解液（上样液）；2-8:洗杂缓冲液）；

图10为实施例7Ni柱进行纯化后重组蛋白（M:蛋白质分子质量标准；1:镍柱洗脱液）；

图11为实施例7Bradford法蛋白定量标准曲线；

图12为实施例9中不同剂量蛋白组中IFN-γ基因的转录量变化；

图13为实施例9中不同剂量蛋白组中Mx基因的转录量变化 ；

图14为实施例10攻毒后DF-1细胞后PCR扩增NDV NP基因（M:DL2000 DNA Maker；1-3:NDV NP基因PCR扩增片段）；

图15为实施例10中不同剂量NDV组中IFN-γ基因的转录量变化；

图16为实施例10中不同剂量NDV组中Mx基因的转录量变化；

图17为实施例10中剂量NDV组中NDV NP基因的转录量变化；

图18为实施例11中中剂量重组蛋白+中剂量NDV组中Mx基因的转录量变化；

图19为实施例11中中剂量重组蛋白+中剂量NDV组中NDV NP基因的转录量变化；

图20 为实施例11中中剂量重组蛋白+中剂量NDV组中IFN-γ基因的转录量变化；

图21为实施例11中中剂量病毒组中NDV NP基因与中剂量重组蛋白+中剂量NDV组中NDV NP基因的转录量变化对比 。

图22为Ni(TED 6FF)离子柱（His标签纯化树脂）的填装流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，在具体实施例中用到的细胞分离液，稀释液和细胞洗涤液均来自外周血淋巴细胞分离液试剂盒，该试剂盒购买于北京索莱宝科技有限公司；其他实验试剂均为常规市售试剂。

实施例1：红嘴鸥外周血淋巴细胞分离、培养、诱导

第1部分实验：PBMC（外周血单核细胞）高效离心管法分离红嘴鸥外周血淋巴细胞

（1）于一无菌15 mL EP管内加入4 mL细胞分离液，1500 rpm/min离心1 min，待离心结束后取出备用。

（2）于另一无菌15 mL EP管内加入3 mL红嘴鸥外周血和3 mL稀释液，用移液器缓慢混匀，将混合液缓慢加入步骤（1）离心好的细胞分离液中，1500 rpm/min离心25 min。

（3）待离心结束，小心将云雾状细胞层吸出（即淋巴细胞层）。

（4）将收集的云雾状细胞层转移至含1.5 mL细胞洗涤液的5 mL无菌EP管内，1500rpm/min离心10 min，小心弃去上清液。

（5）加入1 mL RPMI 1640 medium用枪吹匀数次充分混匀，分离得到淋巴细胞。

第2部分实验：红嘴鸥外周血淋巴细胞的原代培养、诱导

（1）细胞培养液各组分占比：胎牛血清12%、双抗（青链霉素混合液）2%、RPMI 1640medium 86%。

（2）将配制好的细胞培养液平均分装到六孔盘，每孔1 175 μL。

（3）向步骤（2）含有细胞培养液的六孔盘内每孔加入160 μL第1部分实验中已经分离到的淋巴细胞、再加入15 μL 0.5mg/ml Con A，缓慢摇匀。

（4）将六孔盘置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24h。

实施例2：提取淋巴细胞RNA并获得cDNA

第1部分实验：淋巴细胞Total RNA的提取

（1）将实施例1第2部分实验中培养了24h的六孔盘中的培养液收集到1.5mL无酶离心管内，4000rpm/min离心3min，去上清。

（2）用1mL Trizol直接加入六孔盘中将残留的淋巴细胞吹打裂解，然后将Trizol加到步骤（1）中的1.5mL无酶离心管内，缓慢吹打将细胞沉淀充分裂解。

（3）将装有细胞的1.5mL无酶离心管剧烈震荡5min，冰浴5min。

（4）接着加入总体积1/5的三氯甲烷240μL，颠倒离心管混合数次，剧烈震荡2min直至液体呈现乳化状，冰浴5min，4℃ 12000rpm/min离心20min。

（5）小心吸取400μL上层水相于新的1.5mL无酶离心管中，再加入800μL异丙醇，-20℃放置6h。

（6）然后4℃ 12000rpm/min离心20min，小心弃去全部上清，加入1mL无RNase水配置的75%乙醇溶液，轻轻吹打将沉淀溶解。

（7）4℃ 12000rpm/min离心15min弃去全部上清，风干4min，用35μL无RNase水将沉淀溶解，得到红嘴鸥淋巴细胞RNA，取5μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测后结果如图1所示，可见清晰的28S、18S、5S三个条带，表明RNA完整性良好可用于后续试验。

第2部分实验：cDNA第一链的合成

按照全式金反转录试剂盒说明书步骤合成cDNA第一链，反应体系与反应条件如表1与表2所示，Total RNA为本实施例第1部分实验获得的红嘴鸥淋巴细胞RNA，反应结束后获得cDNA。

表1 反转录合成cDNA反应体系

表2 反转录合成cDNA条件

。

实施例3：红嘴鸥IFN-γ基因的克隆及序列分析

第1部分实验：引物设计

根据已获得的红嘴鸥IFN-γ基因全序列，利用软件DNASTAR 11.0找到序列中CDS序列，用软件Primer Premier 6.0设计一对特异性引物，在上下游引物的5′端添加EcoR Ⅰ与Xho Ⅰ的酶切位点，预扩增片段长度为498bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如下（下划线为酶切位点序列）：

IFN-γ-F：CGG AAT TCA TG ACT TGC CAG ACC TAC AGC TTC T

IFN-γ-R：ATC TCG AGT TAG CAT CTG CAC CTC CAC TGA

第2部分实验：红嘴鸥IFN-γ基因的PCR扩增及测序分析

引物IFN-γ-F与IFN-γ-R以实施例2第2部分实验中获得的cDNA为模板通过PCR扩增获得红嘴鸥IFN-γ基因，反应体系与条件见表3与表4，PCR扩增结束后，将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示琼脂糖凝胶结果显示出一条498bp的片段，按照天根胶回收试剂盒说明书操作对IFN-γ基因进行胶回收，胶回收产物部分保存于-20℃冰箱，部分送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果经比对，与预期相符，表明成功扩增了红嘴鸥IFN-γ基因的CDS序列。

表3 扩增红嘴鸥IFN-γ基因PCR反应体系

表4扩增红嘴鸥IFN-γ基因PCR反应条件

实施例4：红嘴鸥IFN-γ基因的TA克隆与鉴定

第1部分实验：红嘴鸥IFN-γ基因的连接与转化

（1）将实施例3第2部分实验中胶回收得到的红嘴鸥IFN-γ基因和pMD18-T质粒按表5所述反应体系，加入到PCR管中，16℃连接6h，得到连接产物。

表5 连接的反应体系

（2）取步骤（1）中得到的连接产物10μL加入到DH5α感受态细胞中，冰盒内冰浴30min，立即恒温水浴42℃热激90s，接着小心迅速取出，冰盒内冰浴3min。

（3）加入800μL的LB液体培养基，以120rpm/min于37℃恒温水浴摇床中震荡培养1h，得到的菌液。

第2部分实验：蓝白斑筛选菌落鉴定

（1）蓝-白斑筛选：在准备好的LB固体培养基（含150μg/mL Amp+）上，用涂布棒均匀涂抹40μL X-gal、16μL IPTG，用移液枪吸取本实施例第1部分实验中的菌液50μL，涂抹在含X-gal、IPTG的LB固体培养基（含150μg/mL Amp+）中，37℃恒温培养箱中正放培养30min，待菌液渗透至培养基中后，倒置培养过夜。

（2）用接种环挑取阳性白色克隆单菌落，于5mL LB液体培养基（含150μg/mL Amp+）内，37℃，摇床140r/min过夜培养12h-16h，培养得到含有重组质粒的菌液，部分菌液用于后续质粒提取，部分菌液保存于-80℃冰箱。

第3部分实验：对TA克隆重组质粒进行鉴定

（1）质粒抽提：吸取本实施例第2部分实验中过夜培养的菌液，按菌液与培养液体积比1：100进行接种，37℃，摇床140r/min进行培养，待OD_600nm值达到1.0左右时取出菌液，按照天根小提质粒试剂盒说明书步骤抽提质粒，抽提好的质粒保存于-20℃备用。

（2）对重组质粒进行PCR鉴定：以步骤（1）中抽提的质粒为模板，实施例3第1部分实验设计的引物IFN-γ-F与IFN-γ-R，进行PCR鉴定，PCR反应结束取5μL产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，在498bp处可见清晰条带。

（3）双酶切及鉴定：将步骤（1）中提好的质粒的用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，酶切反应体系见表6，于37℃水浴酶切3h，酶切结束取5μL产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，在2692bp处和498处均有条带。

表6 双酶切反应体系

（4）经过PCR、双酶切验证后将步骤（1）中得到的重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序；将测序结果比对本实验室已有的参考序列，测序结果与实验室参考序列相似性100%，即成功构建了红嘴鸥IFN-γ基因的TA克隆质粒，将其命名为pMD18-T-IFN-γ-EX。

实施例5：红嘴鸥IFN-γ基因的原核表达质粒

第1部分实验：目的片段的酶切与回收

（1）复苏实施例4中构建成功的pMD18-T-IFN-γ-EX和pET32a(+)的菌液，根据天根质粒小提试剂盒说明书抽提质粒，得到pMD18-T-IFN-γ-EX和pET32a(+)质粒，提好的质粒-20℃保存备用。

（2）对步骤（1）中提取的pMD18-T-IFN-γ-EX和pET32a(+)质粒进行酶切，得到目的基因IFN-γ和pET32a(+)质粒片段，双酶切体系见表7，酶切结束取5μL产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表7 双酶切反应体系

（3）用天根的胶回收试剂盒分别对酶切后的目的基因片段IFN-γ及pET32a(+)质粒片段进行胶回收，胶回收产物-20℃保存备用。

第2部分实验：构建重组原核表达质粒

（1）连接：将本实施例第1部分实验胶回收得到的pET32a(+)质粒片段与目的基因片段IFN-γ连接，反应体系见表8，加样结束后于16℃条件下连接12h，得到连接产物。

表8 连接的反应体系

（2）转化：参照实施例4第1部分实验步骤（2）~（3）中的转化步骤将步骤（1）中得到的连接产物转化至感受态DH5α中（培养基中含150µg/mL Amp+），得到的菌液。

第3部分实验：对原核重组质粒鉴定

（1）质粒抽提：将本实施例第2部分实验过夜培养的菌液，按菌液与培养液体积比1：100进行接种，37℃，摇床140r/min进行培养，待D₆₀₀nm值达到1.0左右时取出菌液，按照天根小提质粒试剂盒说明书步骤抽提质粒，得到重组质粒，重组质粒保存于-20℃冰箱备用。

（2）对重组质粒进行PCR鉴定：以步骤（1）中抽提的质粒为模板，进行PCR鉴定，PCR反应结束取5μL产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图5所示在498bp处有条带。

（3）双酶切鉴定：将步骤（1）中抽提得到的重组质粒用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，酶切反应体系见表6，于37℃水浴酶切3h，酶切结束取5μL产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示在5900bp和498bp处均有条带。

（4）经过PCR、双酶切验证后步骤（1）中的重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序；将测序结果比对本实验室已有的参考序列，且测序结果与实验室参考序列相似性100%，即成功构建了红嘴鸥IFN-γ的原核表达质粒将其命名为pET32a-IFN-γ并将克隆细菌保种。

实施例6：红嘴鸥IFN-γ重组蛋白的表达与鉴定

第1部分实验：重组表达质粒的转化

将测序成功的重组表达质粒pET32a-IFN-γ和pET32a(+)质粒，按照实施例4第1部分实验步骤（2）~（3）的方法分别转化至Transetta(DE3)（含150μg/mL Amp⁺与50µg/mL Chi⁺），其中pET32a(+)质粒作为空质粒对照，将菌液保存于-80℃备用

第2部分实验：表达菌的培养、诱导、表达、鉴定

（1）分别挑取成功转化pET32a-IFN-γ与pET32a(+)的Transetta(DE3)表达菌的单菌落于37℃水浴震荡培养，待培养菌液D _600nm值达到1.1后取出。

（2）取步骤（1）中培养得到菌液200μL接种于4.8mL LB液体培养基（含150μg/mLAmp+与50 µg/mL Chi+）中，于37℃震荡培养菌液待其D_600nm值达到约0.6-0.8后，加入终浓度0.6mmol/L的IPTG，37℃诱导培养5h。并设置未加IPTG诱导组、Transetta(DE3) pET32a(+)未加IPTG诱导组与Transetta(DE3) pET32a(+)加IPTG诱导组、Transetta(DE3)无表达质粒未加IPTG诱导组与Transetta(DE3)无表达质粒IPTG加诱导组（培养Transetta(DE3)的培养基仅含50µg/mL Chi+）。

（3）于1.5mL无菌EP管中吸取步骤（2）中所得菌液1mL，12000rpm/min离心10min用80μL ddH₂O重悬菌液，加入20μL 5×蛋白上样缓冲液（含DTT），轻轻吹打混匀封口膜封口，沸水煮10min，12000rpm/min离心10min，得到处理好的蛋白样品。

（4）按照表9方法制备12%分离胶、5%压缩胶，吸取10μL处理好的蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳。

表9 SDS-PAGE电泳凝胶配制

（5）染色：将取下的蛋白胶放置于染色盘内，加入能没过蛋白胶的考马斯亮蓝染液，于摇床上染色2h，直至可在胶上观察到明显的蓝色条带后终止染色。

（6）脱色：将染色盘内的染色液进行回收，并向其内加入事先配置好的脱色液，每隔0.5h更换一次脱色液，直至蛋白条带清晰、蛋白胶背景透明终止脱色，结果如图7所示未加IPTG组未表达出特异性目标蛋白条带，加IPTG组表达出大小约为35ku的特异性蛋白条带，与预期结果大小相符；而pET32a(+)诱导组表达出大小约为20ku的特异性蛋白条带；无质粒诱导组未表达出特异性条带。

（7）质谱鉴定：蛋白胶脱色后分析重组蛋白表达的情况，将带有目的蛋白的蛋白胶切下并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行蛋白质质谱测定。原始质谱数据由Proteome Discovery软件和Mascot搜索引擎直接搜索并进行本地数据库检索，有5个肽段肽段与数据库中的氨基酸序列相匹配，LVETSTSHKR、NSLPDSSK、FGNSSFLAQLQNDIDQLK、ADFNSSHSDVADGGPIFTEKLSNWTER、KAVNELFIVLQK，对应的序列覆盖率为78%，表明成功重组蛋白表达成功。

实施例7：红嘴鸥IFN-γ重组蛋白的纯化

第1部分实验：红嘴鸥IFN-γ重组蛋白的可溶性分析

（1）复苏实施例6第1部分实验中的菌液，并取2mL，加入198mL LB液体培养基（含150μg/mL Amp+与50µg/mL Chi+）中，于37 ℃震荡培养2-3h ，待细菌D_600nm值达到约0.7时，参照实施例6第2部分实验步骤（2）中的条件对表达菌进行诱导表达。

（2）用50mL离心管分装菌液，16℃ 8000rpm/min离心5min，离心结束弃去上清，并将沉淀两管合成一管。

（3）用22.5mL的50mmol/L Tris-HCL（pH=8.0）重悬沉淀。

（4）加入2.5mL溶菌酶（10mg/mL）使其终浓度为1mg/mL，放在摇床缓慢摇动30min后放置于-80℃条件下反复冻融三次。

（5）冻融结束后，使用超声波低温破碎菌体沉淀，参数为：超声3s、间隔5s，超声300次。

（6）收集破碎菌体；4℃ 12000rpm/min离心30min，分别收集上清和沉淀-20℃保存备用，按照施例6第2部分实验中步骤（4）~步骤（6）所述方法进行SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的可溶性，结果如图8所示，上清液中无目的重组蛋白条带；沉淀中有目的重组蛋白条带，并且有较多杂蛋白存在，因此表达的重组蛋白以包涵体形式存在于细菌沉淀里。

第2部分实验：包涵体洗涤

（1）确定表达蛋白的存在形式后，复苏实施例6第1部分实验中的菌液，并取10mL，加入990mL LB液体培养基（含150μg/mL Amp+与50 µg/mL Chi+）中，于37℃震荡培养5h，待细菌OD_600nm值达到约0.7时，参照实施例6第2部分实验步骤（2）条件对表达菌进行诱导表达。

（2）按照本实施例第1部分实验方法分离菌体沉淀，加入溶菌酶后并将菌体沉淀反复冻融后低温超声破碎；离心后收集菌体破碎沉淀。

（3）加入30ml的2mol/L的尿素包涵体洗涤液洗涤菌体破碎沉淀，将菌体破碎沉淀吹散，室温静置10min，12000r/min，4℃离心5min，洗涤数次4-5次，用4mol/L的尿素洗涤液按照同样方法洗涤2-3次，用6mol/L的尿素洗涤液洗涤液按照同样方法洗涤1-2次（根据洗涤后样品SDS-PAGE电泳结果决定是否继续洗涤）。

（4）用包涵体洗涤液洗涤完成后，再用0.9%生理盐水洗涤菌体破碎沉淀3次，除去残留的在沉淀中的TritonX-100，加入10mL 8mmol/L尿素溶解菌体破碎沉淀；4℃12000rpm/min离心10min，收集并吸取80μL上清，得到包涵体蛋白，按照施例6第2部分实验中步骤（4）~步骤（6）所述方法进行SDS-PAGE电泳检测包涵体洗涤结果，结果如图9所示仍有较多杂蛋白条带。

第3部分实验：重组蛋白的纯化

为进一步获得较为单一的重组蛋白，将包涵体蛋白通过Ni柱进行纯化。

（1）Ni(TED 6FF)离子柱的填装流程，如图22所示，具体包括如下步骤：

①摇匀树脂，吸取一定体积的混合树脂于管内；

②垂直静置，直至有明显分层；

③打开控制器，放出液体层；

④将上垫片放入管内，推至固体层；

⑤加入5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子；

（2）静置5min后，打开柱管下端控制器弃去液体。

（3）关紧控制器，用注射器缓慢往柱内加样，静置5min，收集流出液。

（4）用15个柱体积的洗杂缓冲液分多次冲洗柱子，分别收集流出液。

（5）用5倍柱体积的洗脱缓冲液分多次冲洗柱子，分别收集流出液。

（6）按照实施例6第2部分实验中步骤（4）~步骤（6）所述方法进行SDS-PAGE电泳检测各步收集的流出液，结果如图10所示蛋白浓度降低，但纯度较高。

第4部分实验：重组蛋白浓度的测定

（1）将标准品按Bradford试剂盒说明书稀释为8个浓度梯度，蛋白稀释液选用0.9%生理盐水。

（2）取5μL不同浓度蛋白标准加到96孔板的蛋白标准孔中；每个标准品做三个复孔，取5μL纯化得到重组蛋白样品到96孔板的样品孔中；每个纯化得到重组蛋白样品做三个复孔。

（3）往各孔中加入250μL G250染色液；室温放置5min后；用酶标仪测定A595的吸光度将各孔吸光度值导入GraphPad Prism 9.0软件中，绘制标准曲线，如图11根据标准曲线得到计算蛋白质浓度的关系式：y=0.001359*X+0.07306；其中X为蛋白浓度、y为595nm下的蛋白质吸光度值、相关系数R2为0.9925，通过标准曲线中得到的关系式，测得蛋白样品浓度为384.21μg/mL。

实施例8：荧光定量PCR引物设计及验证

第1部分实验：荧光定量PCR引物设计与合成

（1）根据实验室已经获得的红嘴鸥IFN-γ基因序列，利用Primer Premier 6.0设计一对荧光定量PCR引物，预期扩增片段为155bp，引物序列如下：

IFN-γ F：CAG CTC CAA GAA AGT AAA AGA C

IFN-γ R：ACT GAG ACT GGC TCC TTT TC

（2）根据实验室已经获得的红嘴鸥Mx基因序列，利用Primer Premier 6.0设计一对荧光定量PCR引物，预期扩增片段为236bp，引物序列如下：

Mx F：TTA TCG CCT ACA AAG AGA GAC ACT CAA

Mx R：CTG CCC ACG ACA CTT CAC A

（3）根据鹌鹑β-Actin基因序列设计内参基因荧光定量PCR引物，预期扩增片段为394bp，引物序列如下：

β-Actin F：ACT ACC TCA TGA AGA TCC TGA CA

β-Actin R：TCT CCT TCT GCA TCC TGT C

（4）根据NCBI登记的NDV NP基因序列，利用Primer Premier 6.0设计一对荧光定量PCR引物，预期扩增片段为189bp，引物序列如下：

NDV NP F：AAC AAA CCA CTC AGG CAA G

NDV NP R：CTG TGC TCT CTC TTC AGA CAC

第2部分实验：荧光引物特异性检测

（1）复苏实验室之前已保种的克隆菌株pMD18-T-IFN-γ-EX、pMD18-T-Mx、pMD18-T-ACTIN、pMD18-T-NDV-NP并按质粒小提试剂盒说明书抽提质粒。

（2）将步骤（1）中获得的质粒作为模板，用普通PCR检测荧光定量PCR引物的特异性，反应体系见表10；反应条件见表11；所有基因的退火温度均是50℃：

表10 验证荧光引物特异性反应体系

表11 验证荧光引物特异性反应条件

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示PCR扩增产物条带单一，没有产生引物二聚体和非特异性扩增条带，说明这八对引物特异性较好，可用于荧光定量PCR。

实施例9：重组蛋白孵育淋巴细胞后相关基因转录水平的测定

（1）参照实施例1第1部分实验分离，培养淋巴细胞后使用细胞计数板计数，用1mLRPMI 1640 medium将稀释好的细胞悬液加1μL到细胞计数板上于显微镜下进行细胞计数，将RPMI 1640 medium作为稀释液将细胞数量调整至5x10⁶/mL后加入六孔盘中。

（2）设置低剂量、中剂量、高剂量三个组，并将细胞按分组于六孔盘中培养；低剂量组加入终浓度为50μg/mL的重组蛋白；中剂量组加入终浓度为200μg/mL的重组蛋白；高剂量组加入终浓度为350μg/mL的重组蛋白；以每组0h时间点为该组对照。

（3）将不同条件下的三个组的淋巴细胞分别培养0h、12h、24h、48h、60h、72h；将对应时间点的红嘴鸥淋巴细胞按照步骤实施例2第1部分实验中的方法提取淋巴细胞的总RNA；按照步骤实施例2第2部分实验中的方法反转录合成cDNA。

（4）荧光定量PCR的反应体系和条件如表12与表13，以不同培养时间下红嘴鸥淋巴细胞RNA反转录cDNA为模板，检测红嘴鸥IFN-γ和Mx基因的表达量；每组样本模板做三个重复，设置无样本阴性对照、阳性质粒对照。

表12 荧光定量PCR反应体系

表13 荧光定量PCR反应程序

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（5）记录Ct值并导入后Microsoft Excel 2019整理数据，将数据导入GraphPadPrism 9.0进行数据统计与分析。

各组中IFN-γ基因的转录量变化如图12所示：低剂量蛋白组的统计学分析结果表明，24h-72h的转录量相对于0h增加；关于中剂量蛋白组的柱状图，24h-72h的转录量相对于0h增加；关于高剂量蛋白组的柱状图，12h-72h的转录量相对于0h增加。

各组中Mx基因的转录量变化如图13所示：低剂量蛋白组的统计学分析结果表明，24h-72h的转录量相对于0h增加；关于中剂量蛋白组的柱状图，12h-72h的转录量相对于0h增加；关于高剂量蛋白组的柱状图，48h-72h的转录量相对于0h增加。

实施例10：NDV孵育淋巴细胞后相关基因转录水平的测定

第1部分实验：NDV NP基因普通PCR引物的设计与合成

根据NCBI中登陆的NDV NP基因全序列（登录号：JX524203），用软件PrimerPremier 6.0设计一对特异性引物，预扩增片段长度为824bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如下：

NP-1：ATC CCT CTT ATG CTC CCA TTC

NP-2：GGT ACT TGC CAG TTC CCT TAT C

第2部分实验：NDV的增殖与鉴定

（1）将NDV感染死亡鸡的内脏剪碎、研磨，经反复冻融后离心取上清用作第一代组织源的病毒感染DF-1细胞，待细胞出现明显病变后，反复冻融三次，作为第一代细胞毒，以此方法盲传多代病毒并拍照记录。

（2）将第三代毒按实施例2第1部分实验的方法提取RNA，按实施例 2第2部分实验的方法反转录为cDNA，使用引物NP-1/NP-2 PCR扩增NDV NP基因片段，PCR反应条件与反应体系见表14和表15。攻毒后DF-1细胞PCR扩增NDV NP基因结果如图14所示：824bp有特异性条带，将其回收后送测序后经NCBI中BLAST程序比对后，结果显示为NDV NP基因的片段。

表14 NDV NP基因PCR反应体系

表15 NDV NP基因PCR反应条件

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第3部分实验：Reed-Muench法测定NDV的TCID₅₀

将已验证的NDV病毒液于离心管中用DMEM稀释，从10^-1稀释至10^-10，将DF-1细胞传代接种于96孔细胞培养板，调整细胞密度至每孔约1x10⁴个细胞，待细胞贴壁长满且形态良好后，去除培养液，每孔加入100μL梯度稀释的病毒液，每个稀释梯度病毒液重复8孔，病毒对照组加入100μL病毒原液，空白对照组加入等体积的DMEM，封盘后置于细胞培养箱，每天观察细胞病变情况至第七天。记录各梯度发生病变的数量，采用Reed-Muench法计算NDV的TCID₅₀。表16所示为NDV的TCID₅₀，根据Reed-Muench法公式计算得出NDV的TCID50为10^-3.5/0.1 mL，即将NDV稀释10^-3.5接种100 μL可使50%的DF-1细胞发生病变。

表16 Reed-Muench法测定NDV的TCID₅₀

第4部分实验：NDV孵育淋巴细胞后的相关基因转录水平检测

（1）按照实施例9方法中步骤（1）操作稀释细胞。

（2）按照实施例9方法中步骤（2）操作对细胞分组；低剂量组加入250μL TCID₅₀的NDV上清液；中剂量组加入500μL TCID₅₀的NDV上清液；高剂量组加入750μL TCID₅₀的NDV上清液。

（3）将不同条件下的三个组的淋巴细胞分别培养1h、12h、24h、48h、60h、72h；将对应时间点的红嘴鸥淋巴细胞按照实施例2第1部分实验中的方法提取淋巴细胞的总RNA；按照实施例2中第2部分实验的方法反转录合成cDNA。

（4）按照荧光定量PCR的反应体系和条件表11与表12，以不同培养时间下红嘴鸥淋巴细胞RNA反转录cDNA为模板，检测NDV NP和红嘴鸥IFN-γ、Mx基因的表达量；每组样本模板做三个重复，设置无样本阴性对照、阳性质粒对照。

（5）记录Ct值并导入后Microsoft Excel 2019整理数据，将数据导入GraphPadPrism 9.0进行数据统计与分析。

各组中IFN-γ基因的转录量变化如图15所示：所示低剂量NDV组的统计学分析结果表明，48h-72h的转录量相对于1h增加；关于中剂量NDV组的柱状图，24h-72h的转录量相对于1h增加；关于高剂量病毒组的柱状图，12h-48h转录量相对于1h增加。

各组中Mx基因的转录量变化如图16所示：所示低剂量NDV组的统计学分析结果表明，24h-72h的转录量相对于1h增加；关于中剂量NDV组的柱状图，12h-72h的转录量相对于1h增加；关于高剂量病毒组的柱状图，12h-48h转录量相对于1h增加。

在中剂量NDV中，NDV NP基因的转录量变化如图17所示，随着时间的增加，NDV NP基因的表达量也增加。

实施例11：重组蛋白与NDV孵育淋巴细胞后NDV NP和红嘴鸥相关基因转录水平的测定

通过组间统计学分析，低剂量蛋白与高剂量蛋白孵育后细胞中IFN-γ、Mx基因的在所选时间点无统计学差异（P＞0.05），此外根据其他基因的统计学分析结果选择中剂量的重组蛋白做后续蛋白抗病毒作用实验。

（1）按照实施例9方法中步骤（1）操作稀释细胞。

（2）在细胞培养盘中加入中（200μg/mL）剂量重组蛋白后再加入中（500μL TCID₅₀）剂量NDV上清液；培养1h、12h、24h、48h、60h、72h；以培养1h为该组对照。

（3）将对应时间点的红嘴鸥淋巴细胞按照步骤实施例2第1部分实验中的方法提取淋巴细胞的总RNA；按照实施例2第2部分实验中的方法反转录合成cDNA。

（4）按照荧光定量PCR的反应体系和条件表11与12，以不同培养时间下红嘴鸥淋巴细胞RNA反转录cDNA为模板，检测NDV NP和红嘴鸥IFN-γ、Mx基因的表达量；每组样本模板做三个重复，设置无样本阴性对照、阳性质粒对照。

（5）记录Ct值并导入后Microsoft Excel 2019整理数据，将数据导入GraphPadPrism 9.0进行数据统计与分析。

Mx基因的转录量变化如图18所示：12h-72h的转录量相对于1h增加；

NDV NP基因转录量变化如图19所示：12h-72h的转录量相对于1h增加；将中剂量病毒孵育的细胞中的NDV NP基因与中剂量蛋白+中剂量病毒孵育的细胞中的NDV NP基因表达量进行比对，结果如图21所示，加入蛋白后NDV NP基因的表达量显著降低，说明重组蛋白对NDV病毒有抑制作用。

IFN-γ基因表达量变化如图20所示：12h-72h的转录量相对于1h增加。

经过以上实施例发现：将不同浓度的重组蛋白孵育淋巴细胞后经过数据统计及分析，可以很明显的看到，IFN-γ、Mx基因的转录水平都比0h提升，其中IFN-γ提升最大，这可能是该基因在淋巴细胞的一种正反馈现象，通过不断的正反馈使得该蛋白可迅速大量表达从而激活淋巴细胞，为机体后续的免疫环境提供有力的支撑。

本发明中三种剂量的重组蛋白均上调了红嘴鸥IFN-γ基因的转录水平，尤其在48h后该基因的转录水平较0h提升极其非常显著（P<0.0001），在经过IFN-γ孵育淋巴细胞后，淋巴细胞对IFN-γ产生的一种正向响应，IFN-γ通过活化淋巴细胞的免疫能力，产生较多的干扰素激活蛋白以建立免疫细胞的抗感染状态。

本发明中三种剂量的重组蛋白均上调了红嘴鸥Mx的转录水平，尤其在48h-72h后该基因的转录水平较0h提升极其非常显著（P<0.0001），Mx蛋白是由IFN激活后产生的抗黏病毒蛋白。

将中浓度的重组蛋白与病毒结合孵育淋巴细胞后经过数据统计及分析，可以很明显看到，IFN-γ、Mx基因的转录水平比0h提升，其中IFN-γ在48h的转录水平提升最大（P<0.0001），呈现先高后低的趋势，Mx基因在72h的转录水平提升最大（P<0.0001），呈现逐渐提升的趋势，这两个基因的表达而发挥抗病毒作用；而检测NDV NP基因的转录水平呈现先升高后降低的趋势，且转录水平远低于不加蛋白组（P<0.05）。提示IFN-γ参与Ⅰ型干扰素通路中共同的干扰素刺激基因Mx基因的调控，从而发挥免疫调节功能而产生抗病毒作用。

由此可见虽然各组淋巴细胞给予重组蛋白的初始剂量不同，但三种剂量的重组蛋白均可以提高红嘴鸥IFN-γ与Mx基因的转录水平，因此，IFN-γ可提前对宿主提供免疫保护，并参与一个放大循环，迅速预警邻近细胞以及先天免疫系统中的其他效应细胞可能发生的感染，从而建立免疫系统对抗感染的预备状态。

Claims (1)

1.一种表达红嘴鸥IFN-γ基因编码的重组蛋白在制备抗新城疫病毒药物中的应用；

所述红嘴鸥IFN-γ基因为如序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

所述红嘴鸥IFN-γ基因编码的重组蛋白为如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。