CN116082469A - 一种CCHFV tecVLP及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CCHFV tecVLP及其制备方法和应用。通过pCAGGS载体分别构建带有NanoLuc的微基因组质粒及能够表达L基因、M基因和S基因的辅助质粒，以及pCAGGS‑T7，共转染Huh7细胞，培养2‑3天，收集细胞培养上清，得CCHFV tecVLP，利用其感染细胞和动物，可以替代活病毒进行疫苗评价和药物筛选，生物安全等级要求低，将会为CCHFV疫苗研发及药物筛选的广泛开展奠定坚实的基础，并最终服务于CCHF的防控和治疗。

Description

一种CCHFV tecVLP及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CCHFV tecVLP及其制备方法和应用。
背景技术
克里米亚刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic feve rvirus，CCHFV)的传染性高、致命性强。从ICTV的分类中得知，CCHFV隶属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)、内罗病毒科(Nairoviridae)、正内罗病毒属(Orthonairovirus)。该病毒会引起一种急性的传染病—克里米亚刚果出血热(Crimean-Congohemorrhagicfever，CCHF)，非洲、东欧、中东等地此病流行较为广泛，是一种以蜱为媒介的自然疫源性疾病。该病临床上以发热、胃肠道出血、呕血、低血压、休克为主要特征，病死率高，可达3-30％。
目前，针对CCHFV的预防和治疗还没有特异性的疫苗和药物。在疫苗研发方面，主要包括传统疫苗—灭活疫苗以及新型疫苗的开发。在药物使用方面，目前用于CCHF临床治疗的药物主要为广谱性药物，如利巴韦林等，一般的支持性治疗也无法特异且有力的发挥最佳疗效。
造成如此境况的一个重要原因是因为CCHFV安全等级较高，要求BSL-4级生物安全条件下才可进行活病毒研究，但全球大多数实验室不具备高等级生物安全条件。因此本发明想通过实验技术手段寻找一个安全可靠的替代者，将其视作“病毒”进行疫苗研发和药物筛选等相关研究。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种CCHFV tecVLP及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种CCHFV tecVLP的制备方法，包括以下步骤：
1)以CCHFV菌株IbAr10200的L基因为骨架，敲除掉其编码基因，保留其非结构基因序列，同时插入NanoLuc荧光素酶基因序列，得到SEQ ID NO.1所示序列的片段，通过同源重组的方式将其克隆到pSMART-LCK载体中，得到重组微基因组质粒pSMART-LCKvL-NanoLuc；
2)扩增CCHFV菌株IbAr10200的L基因、M基因和S基因；
3)通过同源重组的方式将L基因克隆到哺乳动物表达载体pCAGGS-LCK，得到重组质粒pCAGGS-LCK-L；将M基因克隆到pCAGGS载体中，得到重组质粒pCAGGS-M；将S基因克隆到pCAGGS载体，得到重组质粒pCAGGS-S；
4)将pSMART-LCKvL-NanoLuc、pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-M、pCAGGS-S以及pCAGGS-T7共转染Huh7细胞，培养2-3天，收集细胞培养上清，即得CCHFV tecVLP。
进一步的，所述NanoLuc荧光素酶基因、L基因、M基因和S基因的序列依次如SEQ IDNO.1-4所示。
第二方面，本发明提供所述方法制备得到的CCHFV tecVLP。
第三方面，本发明提供所述CCHFV tecVLP在建立Huh7细胞感染模型中的应用。
第四方面，本发明提供所述CCHFV tecVLP在建立C57BL/6小鼠感染模型中的应用。
第五方面，本发明提供所述CCHFV tecVLP在建立抗CCHFV药物筛选平台中的应用。
第六方面，本发明提供所述CCHFV tecVLP在建立CCHFV疫苗评价平台中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次成功大量表达了CCHFV病毒样颗粒(transcription and entry-competent virus-like particle，tecVLP)，并对其行了滴度测定，在此基础上建立了用于替代野生病毒CCHFV参与抗CCHFV药物筛选以及疫苗评价系统。此外建立的CCHFV tecVLP细胞和动物感染平台相当于从体外和体内两个部分对实验对象进行了评价。此外该平台的用途也进行了充分的探索，具备两大功能。1、既可以用于药物筛选(既可以筛选具有预防作用的药物，也可以筛选具有治疗作用的药物)。2、也可以用于疫苗评价(不光可以评价疫苗免疫后动物血清中的中和抗体的滴度，也可以评价CCHFV攻击动物后的疫苗保护作用)。
含报告基因的重组病毒，面临着极大的生物安全风险，不宜与广泛开展，限制相关研究进展，本发明的CCHFV tecVLP更安全，生物安全等级要求低，更适合广泛开展研究。
附图说明
图1为pSMART-LCK-vL-NanoLuc(a)、PCAGGS-LCK-L(b)、pCAGGS-M(c)、pCAGGS-S(d)的质粒图谱。
图2为CCHFV微基因组报告系统功能性验证(上清)。
图3为CCHFV微基因组报告系统功能性验证(裂解液)。
图4中，a、c、e、g、i、k依次为0h、12h、24h、36h、48h、72h所收上清在不同时间点下通过不同方式感染后的评价效果，b、d、f、h、j、l依次为0h、12h、24h、36h、48h、72h所收裂解液在不同时间点下通过不同方式感染后的评价效果。
图5为CCHFV tecVLP感染Huh7细胞后活细胞成像结果，左列为对照—正常细胞；右列为实验组。
图6为CCHFV tecVLP感染细胞后试剂盒检测结果(a)和q-PCR检测结果(b)。
图7为CCHFV tecVLP感染动物后q-PCR结果—通过腹腔注射感染。
图8为CCHFV tecVLP感染动物后q-PCR结果—通过皮下注射感染。
图9为CCHFV tecVLP感染动物后q-PCR结果—通过肌肉注射感染。
图10中，a、c、e、g依次为索拉菲尼、伊曲康唑、氯丙嗪、氯喹作用4h的细胞毒性作用，b、d、f、h依次为索拉菲尼、伊曲康唑、氯丙嗪、氯喹作用24h的细胞毒性作用。
图11为四种药物对小鼠体重(a)与体温(b)的影响。
图12中，a-d依次为索拉菲尼、伊曲康唑、氯丙嗪、氯喹抑制tecVLP入胞作用研究—试剂盒检测，e-h依次为索拉菲尼、伊曲康唑、氯丙嗪、氯喹抑制tecVLP入胞作用研究—q-PCR检测，i-l依次为索拉菲尼、伊曲康唑、氯丙嗪、氯喹抑制tecVLP转录作用研究—试剂盒检测，m-p依次为索拉菲尼、伊曲康唑、氯丙嗪、氯喹抑制tecVLP转录作用研究—q-PCR检测。
图13中，a-c依次为药物抑制tecVLP入肝脏、脾脏、肾脏作用研究—试剂盒检测，d-f依次为药物在肝脏、脾脏、肾脏中抑制tecVLP转录作用研究—试剂盒检测，g-i依次为药物抑制tecVLP入肝脏、脾脏、肾脏作用研究—q-PCR检测，j-l依次为药物在肝脏、脾脏、肾脏中抑制tecVLP转录作用研究—q-PCR检测。
图14为各免疫组小鼠血清不同稀释度下对tecVLP的中和效果—q-PCR检测结果。
图15为各免疫组小鼠血清不同稀释度下对tecVLP的中和效果-试剂盒检测结果。
图16为体外中和实验结果。
图17为tecVLP攻击免疫后小鼠的q-PCR结果。
图18为tecVLP攻击免疫后小鼠的试剂盒结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下涉及的pCAGGS载体、pCAGGS-LCK载体、pSMART-LCK均购自丰晖生物。
实施例1：CCHFV基因组质粒和辅助质粒的构建及鉴定
1、微基因组质粒的构建
以CCHFV菌株IbAr10200的L基因为骨架，敲除掉其编码基因，保留其非结构基因序列，同时插入NanoLuc荧光素酶基因序列，得到SEQ ID NO.1所示序列的片段，通过同源重组的方式将其克隆到pSMART-LCK载体中，从而得到重组微基因组质粒pSMART-LCKvL-NanoLuc(图1a)。该质粒表达含有CCHFV识别信号的病毒非编码重组RNA片段，并由一个T7启动子控制启动。
利用连接酶将PCR获得的NanoLuc荧光素酶基因序列与pSMART-LCK载体连接。将重组质粒转化E.coli Stbl3并涂布Kana+平板，将恒温培养箱调至30℃。隔天挑取菌落，置于2×YT培养液中，将摇床调至30℃-190r/min。隔天提取质粒并鉴定，如果观察到PCR后的目的条带大小正确，即可将质粒送公司测序验证。
2、辅助质粒的构建及鉴定
将CCHFV菌株IbAr10200的L基因(SEQ ID NO.2)片段与哺乳动物表达载体pCAGGS-LCK连接，从而构建重组辅助质粒pCAGGS-LCK-L(图1b)。用T4连接酶16℃过夜连接，取连接产物转化E.coliStbl3，涂布Kana+平板，置于恒温培养箱(30℃)中。过夜培养后挑取单个菌落，置于培养液中，通过摇床(30℃-190r/min)再次过夜培养。隔天提取质粒并鉴定。利用DNA限制性内切酶EcoRI和SacI双酶切pCAGGS-LCK-L，置于37℃水浴锅，酶切4h后进行琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。如果观察到双酶切后的线性化载体和目的条带大小正确，送公司测序验证。
将CCHFV菌株IbAr10200的M基因(SEQ ID NO.3)片段克隆到pCAGGS载体中，从而构建重组质粒pCAGGS-M(图1c)。将载体与片段在37℃水浴锅反应30分钟进行连接。准备冰盒备用，取一支E.coli DH5α置于冰中用于转化，超净工作台提前紫外照射15分钟。待感受态液化，取25ul感受态与连接产物混合均匀。混合物冰浴30分钟，42℃水浴2分钟，然后再次冰浴。向EP管中补充1ml 2×YT培养液，将pCAGGS-M置于37℃-220r/min的摇床中1h。涂布含有Amp+的平板，置于37℃培养箱恒温培养。第二天挑取菌落置于培养液中，过夜摇菌，所得菌液提取质粒。所得质粒利用EcoRI/BglII两个酶切位点进行双酶切鉴定，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。如果双酶切后的片段大小正确，送公司测序验证。
同样，将S基因(SEQ ID NO.4)片段与pCAGGS载体连接，以制备重组质粒pCAGGS-S(图1d)。利用EcoRI和NheI双酶切pCAGGS-S，酶切4h后进行鉴定并测序。
最后，通过PCR对编码T7启动子的质粒pCAGGS-T7进行鉴定，PCR反应结束后，同样进行琼脂糖凝胶电泳验证。
实施例2：CCHFV微基因组报告系统的功能性验证
将Huh7细胞用10％DMEM培养液进行培养，并接种于24孔板，37℃CO2细胞孵箱中进行培养，至细胞汇合度约80％时，转染实施例1测序正确的质粒。质粒转染体系如下：质粒总量为1μg，脂质体转染试剂2μl，分别各自置于50μlopti-MEM中，用枪头反复吹吸混合均匀。室温静置5min；然后将两管混合物混合，用枪头反复吹吸以保证混合均匀，室温静置20min。将24孔板孔内10％DMEM培养液替换为双无培养液，将混匀的混合物加入孔中，37℃CO2细胞孵箱中进行培养。转染4-6h后，吸弃转染液，换回2％DMEM培养液，37℃CO2细胞孵箱进行培养。本实验根据转染质粒的不同，共设置了以下6组，
①pSMART-LCK-vL-NanoLuc：pCAGGS-LCK-L：pCAGGS-S：pCAGGS-T7＝vL-Luc：L：S：T7＝1：10：4：2。
②pSMART-LCK-vL-NanoLuc：pCAGGS-S：pCAGGS-T7＝vL-Luc：S：T7＝1：4：2。
③pSMART-LCK-vL-NanoLuc：pCAGGS-LCK-L：pCAGGS-T7＝vL-Luc：L：T7＝vL-Luc：L：T7＝1：10：2。
④pSMART-LCK-vL-NanoLuc：pCAGGS-LCK-L：pCAGGS-S＝vL-Luc：L：S＝1：10：4。
⑤PCAGGS-LCK-CCHFV-L：PCAGGS-CCHFV-S：PCAGGS-T7＝L：S：T7＝10：4：2。
⑥正常细胞对照组。
各组细胞经过不同质粒共转染后，换回2％DMEM培养液继续培养，并在分别培养12h、24h、36h、48h、72h时，分别收取上清及细胞沉淀进行NanoLuc表达量的检测。具体步骤如下：收集各孔上清至1.5ml EP管，4℃，13000r/min离心3min；离心结束后，遗弃沉淀，保留上清待检。准备好1×PLB裂解液，将裂解液以100μl/孔加入各孔，期间可持续晃动，使裂解液充分作用孔内细胞，作用15min后，待细胞裂解充分，吹吸细胞裂解液至1.5ml EP管，4℃，13000r/min离心15min；离心结束后，弃掉细胞沉淀，保留上清待检。配制NanoLuc检测底物液，底物与缓冲液以1：50的比例配制，配制全程注意避光。将配制好的底物液10μl和各组样本10μl分别加入到1.5ml EP管，混合均匀，室温反应3min。打开EP管盖，上机操作检测NanoLuc的表达量。
结果：六个组别分别在12h、24h、36h、48h、72h后收集样品检测。空细胞组是细胞的本底值，无论在哪一个时间段，荧光值均处于200左右。在检测上清样品时，12h的数据中除①组的数值略高，处于万级之外，其余组别数值均在千位数。同样，在24h时，其余五组数值几乎不变，只有①组的数值有了略微升高。随着时间延长，①组数值持续升高，在48h和72h达到了十几万，而其余对照组数值依然在千位(图2)。在检测细胞裂解液样品时，①组样品12h得到的值处于万级，24h升至十万级，在48h时达到了百万级，而其余组别的数值没有显著变化(图3)。
实施例3：CCHFV tecVLP的构建及鉴定
将微基因组质粒pSMART-LCK-vL-NanoLuc与辅助质粒pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-S、pCAGGS-M、pCAGGS-T7共转染Huh7细胞，用于构建CCHFV tecVLP。以24孔板为例，提前一天准备好细胞培养板并铺设Huh7细胞，第二天至细胞汇合度约70％-80％时，共转染上述质粒。质粒总量为1μg，pSMART-LCK-vL-NanoLuc：pCAGGS-LCK-L：pCAGGS-S：pCAGGSM：pCAGGS-T7质粒比例为1：10：4：4：2，即pSMART-LCK-vL-NanoLuc 0.04μg，pCAGGS-LCK-L 0.48μg，pCAGGS-S 0.19μg，pCAGGS-M 0.19μg，pCAGGS-T 70.1μg。依据说明书要求配制转染试剂，转染16-18h后，用真空泵吸弃孔内液体，加入DPBS轻柔地洗一遍孔内细胞，再吸弃；加入2％DMEM培养液，37℃CO2细胞孵箱进行培养。
分别在培养的第0h、12h、24h、36h、48h、72h开始收样，具体收样步骤如下，用1ml枪头分别吸取各孔培养上清以及细胞至1.5ml离心管，4℃，13000r/min离心3min。离心结束后，遗弃碎片沉淀，上清溶液即为CCHFV tecVLP，分装，-80℃保存。
接下来对前期不同时期收取的CCHFV tecVLP感染Huh7细胞进行鉴定。以24孔板为例，提前准备好细胞培养板并铺板Huh7细胞，至细胞汇合度约70％-80％时，设立2个实验组，一组不做任何处理，直接感染前期收取的CCHFV tecVLP，100μl/孔(直接感染组)；另外一组提前预转染辅助质粒pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-S，比例为10：4，质粒总量为1μg；转染辅助质粒后，4h之后换回2％DMEM培养液继续培养；待37℃CO2细胞孵箱培养24h后，感染前期收取的CCHFV tecVLP，100μl/孔(预转辅助质粒组)。
各组细胞经过CCHFV tecVLP感染2h后，吸弃孔内培养液，换回2％DMEM培养液继续培养，并在分别培养1d、2d、3d时，分别收取上清及细胞进行NanoLuc表达量的检测。具体步骤如下：收集各孔上清至1.5mlEP管，4℃，13000r/min离心3min；离心结束后，遗弃沉淀，保留上清待检。准备好1×PLB裂解液，将裂解液以100μl/孔加入各孔，期间可持续晃动，使裂解液充分作用孔内细胞，作用15min后，待细胞裂解充分，吹吸细胞裂解液至1.5ml EP管，4℃，13000r/min离心15min；离心结束后，弃掉沉淀，保留上清待检。
配制NanoLuc检测底物液，底物与缓冲液以1：50的比例配制，配制全程注意避光。将配制好的底物液10μl和各组样本10μl分别加入到1.5ml EP管，混合均匀，室温反应3min。打开EP管盖，上机操作检测NanoLuc的表达量。
结果：在对0h所收样品鉴定时，无论是培养液上清还是细胞裂解液，无论是直接感染还是预转之后再感染，不同时间的检测值均很低(图4a，图4b)。在对12h所收样品鉴定时，细胞裂解液中的检测数值整体高于培养基上清，其中预转组数值比直接感染组有着更明显的升高趋势(图4c，图4d)。同样，在对24h和36h所收样品鉴定时也是如此，并且可以发现在tecVLP感染后的第二天和第三天荧光值明显升高(图4e-h)。随着收样时间的延长，将48h和72h时所收tecVLP进行感染鉴定，结果显示，细胞裂解液样品中直接感染组的数值在感染后的第二天和第三天只能达到十万级别，而预转染组数值在感染后的第二天和第三天达到了二百万(图4i-l)。根据实验结果，显示质粒共转染3天后收取CCHFV tecVLP，细胞经转染后感染，并在感染48h后通过裂解细胞检测荧光值，从而鉴定。
实施例4：CCHFV tecVLP细胞感染平台的建立
将6孔细胞培养板接种Huh7细胞，至细胞汇合度约70％-80％时，预转染辅助质粒pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-S，比例为10：4，质粒总量为3μg；转染辅助质粒后，4h之后换回2％DMEM培养液继续培养；待37℃CO2细胞孵箱培养24h后，分别感染100TCID50 CCHFV tecVLP，500μl/孔，感染2h后，吸弃孔内培养液，换回2％DMEM培养液继续培养，并于培养后48h时，进行活细胞成像。
将24孔细胞培养板接种Huh7细胞，至细胞汇合度约70％-80％时，预转染辅助质粒pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-S，比例为10：4，质粒总量为1μg；转染辅助质粒后，4h之后换回2％DMEM培养液继续培养；待37℃CO2细胞孵箱培养24h后，分别感染100TCID50 CCHFV tecVLP，100μl/孔，感染2h后，吸弃孔内培养液，换回2％DMEM培养液继续培养，并于培养后48h时，裂解细胞，收集裂解液体将其4℃，13000r/min离心3min；离心结束后，遗弃细胞沉淀，保留上清待检。配制NanoLuc检测底物液，底物与缓冲液以1：50的比例配制，配制全程注意避光。将配制好的底物液10μl和各组样本10μl分别加入到1.5ml EP管，混合均匀，室温反应3min。打开EP管盖，上机操作检测NanoLuc的表达量。将6孔细胞培养板接种Huh7细胞，至细胞汇合度约70％-80％时，预转染辅助质粒pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-S，比例为10：4，质粒总量为3μg；转染辅助质粒后，4h之后换回2％DMEM培养液继续培养；待37℃CO2细胞孵箱培养24h后，分别感染100TCID50 CCHFV tecVLP，500μl/孔，感染2h后，吸弃孔内培养液，换回2％DMEM培养液继续培养，并于培养后48h时，弃掉培养上清，加入DPBS洗涤，再吸弃，将培养板置于冰盒上。吸取100μlTRK裂解液均匀地将其滴入培养板中，保证孔中央的细胞也可以浸润在裂解液当中，放置室温作用5min，中途可反复摇晃培养板几次；裂解结束后，用1m1枪头反复吹吸板底细胞，然后转移至1.5mlEP管中，12000r/min离心1min。离心结束后，吸取裂解产物至新离心柱中，并加入等体积70％无水乙醇混合均匀，12000r/min离心1min。离心结束后，向柱中加入300μl wash buffer I，通过真空泵吸弃；再加入两次500μl wash buffer II，打开真空泵吸弃柱内液体；从真空泵上取下离心柱移至新管中，放入离心机空转，12000r/min离心1min。最后，将30μlRNase-Free Water垂直滴入离心柱中央，静置2min后，12000r/min离心1min，所集液体即为RNA。分别以NanoLucForward/Reverse为上下游引物，通过q-PCR技术检测目的基因。NanoLucForward/Reverse序列如下：
Forward(SEQ ID NO.5)：5’-GTCGCCGCTCAGACCTTCATAC-3’；
Reverse(SEQ ID NO.6)：5’-GGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAG-3’。
结果：细胞成像较为成功(图5)，且试剂盒检测得到的数值达已经高于五百万。不仅如此，q-PCR结果表明tecVLP感染细胞后，荧光基因的载量与对照组相比有着显著差异(图6)。
实施例4：CCHFV tecVLP动物感染平台的建立
将辅助质粒pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-S，比例为10：4，质粒总量为30μg，提前24h注射至C57小鼠体内。然后分别通过皮下，腹腔和肌肉注射的方式感染TCID50 CCHFV tecVLP，剂量为：皮下，100μl/只，腹腔，500μl/只，肌肉，200μl/只。
分别感染1d、2d、3d后，首先分别在第1d、2d、3d处死小鼠(3只/组)，每只小鼠均取其心、肝、脾、肺、肾和脑六个脏器组织。其次部分小鼠在第3d进行活体成像，检测NanoLuc的表达水平。
将小鼠各个脏器组织加入RIPA强裂解液和蛋白酶抑制剂后破碎，制成组织悬液。然后利用超声破碎仪超声处理，每个样品总共超声20s，超声10s，停止10s。超声结束后的样品变得清亮，遗弃沉淀，吸取上清进行离心，12000r/min，4℃离心30min，收集上清定量待检；配制NanoLuc检测底物液，底物与缓冲液以1：50的比例配制，配制全程注意避光。将配制好的底物液10μl和各组样本10μl分别加入到500μl EP管，混合均匀，室温反应3min。打开EP管盖，上机操作检测NanoLuc的表达量。
将小鼠各个脏器组织放入RNA保存液中，通过试剂盒以及说明书指导提取组织的RNA，同样通过q-PCR技术检测目的基因。
结果：三种注射方式的效果不同，六个脏器组织中荧光蛋白的表达水平也不同。相比之下，在腹腔注射后荧光蛋白的检测值比其余两种注射方式得到的数值高。此外，肝、脾中试剂盒检测结果可达万级，肾脏中在千级，而其余组织与对照组的值均在千级以下。在q-PCR实验中，得到的结果与试剂盒检测结果相一致。肝、脾、肾三个组织中检测到的值与对照组相比具有差异，其余三个组织中基因载量与对照组几乎没有差异。根据两方面的实验，我们可以得到以下结果：腹腔注射的效果相对其他两种方式较具优势，且在tecVLP攻击后第三天检测时，肝、脾、肾三个组织中检测到了CCHFV tecVLP攻击小鼠的指标(图7-9)。
实施例5：CCHFV tecVLP在疫苗评价及抗病毒药物筛选中的应用
1、四种药物对于对于Huh7细胞和C57小鼠的毒性影响
1)首先对索拉菲尼、伊曲康唑、氯丙嗪、氯喹四种药物进行细胞毒性检测。将药物分别溶于DMSO，使母液浓度为100mM。将Huh7细胞铺设96孔板，1×104细胞/孔，37℃的CO2细胞孵箱进行培养24h。然后用细胞培养液对四种药物的母液进行稀释，索拉菲尼和伊曲康唑的药物浓度分别稀释到1μM、5μM、10μM、20μM、40μM，氯喹和氯丙嗪的药物浓度分别稀释到1μM、10μM、20μM、40μM、80μM。将稀释好的药物分别各自添加到96孔板中的Huh7细胞，然后设置两个实验组：一组药物作用4h后加入CCK8；另一组药物作用24h后加入CCK8，最后通过酶标仪检测450nm下各孔细胞的吸光度来评估不同药物在不同时间内对细胞活性的影响。
2)其次对索拉菲尼、伊曲康唑、氯丙嗪、氯喹四种药物进行动物毒性检测。提前3d开始检测C57小鼠的体温和体重变化，以及小鼠状态(精神倦怠，不喜进食，皮毛皱缩等)和有无死亡情况。将药物分别溶于DMSO，使母液浓度为100mM。然后将四种药物的母液进行稀释，索拉菲尼和伊曲康唑的药物浓度分别稀释到10μM、10μM，氯喹和氯丙嗪的药物浓度分别稀释到20μM和10μM。将稀释好的药物分别通过腹腔注射C57小鼠，500μL/只，然后连续3d继续观察和检测小鼠的体温和体重变化，以及小鼠状态(精神倦怠，不喜活动，毛发皱缩等)和有无死亡情况，以此来评估不同药物在不同时间内对C57小鼠健康的影响。
结果：索拉菲尼的药物浓度在10μM较为合适，伊曲康唑为10μM，氯丙嗪为10μM，氯喹则为20μM(图10)；通过对小鼠给药前后体温与体重的监测发现，药物不会给小鼠带来消极作用(图11)。
2、CCHFV tecVLP在抗病毒药物筛选中的应用
将24孔细胞培养板接种Huh7细胞，至细胞汇合度约70％-80％时，预转染辅助质粒pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-S，比例为10：4，质粒总量为1μg；转染辅助质粒后，4h之后换回2％DMEM培养液继续培养；待37℃的CO2细胞孵箱培养24h后，接下来将实验分为两组：①将四种药物分别稀释到10μM、10μM、10μM、20μM的浓度后与100TCID50 CCHFV tecVLP混合，在37℃生化培养箱下共孵育1h，随后加入到培养板中，200μl/孔，37℃CO2细胞孵箱2h后，吸弃孔内培养液，换回2％DMEM培养液继续培养48h，收取裂解液体，4℃，13000r/min离心3min；离心结束后，保留上清待检；②100TCID50 CCHFV tecVLP感染各孔细胞，100μl/孔，37℃CO2细胞孵箱培育2h后，吸弃孔内培养液，分别各自添加四种药物，37℃CO2细胞孵箱持续作用24h后，吸弃孔内药物，换回2％DMEM培养液继续培养48h，收取裂解后液体，4℃，13000r/min离心3min；离心结束后，保留上清待检。配制NanoLuc检测底物液，底物与缓冲液以1：50的比例配制，配制全程注意避光。将配制好的底物液10μl和各组样本10μl分别加入到500μl EP管，混合均匀，室温反应3min。打开EP管盖，上机操作检测NanoLuc的表达量。
将12孔细胞培养板接种Huh7细胞，至细胞汇合度70％-80％时，预转染辅助质粒pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-S，比例为10：4，质粒总量为2μg；转染辅助质粒后，4h之后换回2％DMEM培养液继续培养；待37℃CO2细胞孵箱培养24h后，接下来将实验分为两组：①将四种药物索拉菲尼、伊曲康唑、氯丙嗪、氯喹分别按照10μM、10μM、10μM、20μM的浓度与100TCID50CCHFV tecVLP混合，在37℃生化培养箱下共孵育1h，随后加入到培养板中，200μl/孔，37℃CO2细胞孵箱2h后，吸弃孔内培养液，换回2％DMEM培养液继续培养48h，弃掉培养上清，保留细胞待检；②100TCID50 CCHFV tecVLP感染各孔细胞，100μl/孔，37℃CO2细胞孵箱培育2h后，吸弃孔内培养液，分别各自添加索拉菲尼10μM、伊曲康唑10μM、氯丙嗪10μM、氯喹20μM四种药物，37℃CO2细胞孵箱作用24h后，吸弃孔内药物，换回2％DMEM培养液继续培养48h，弃掉培养上清，保留细胞待检。在各孔细胞中加入DPBS洗涤，再吸弃，将培养板置于冰盒上。通过试剂盒提取上清中的RNA，利用q-PCR实验手段检测目的基因。
将辅助质粒pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-S，比例为10：4，质粒总量为30μg，提前24h预转至C57小鼠体内。接下来将实验分为两组：①将四种药物分别按照10μM、10μM、10μM、20μM与100TCID50 CCHFV tecVLP 1：1混合，在37℃生化培养箱下共孵育1h，随后经腹腔感染C57小鼠，1ml/只，连续感染3d，然后处死小鼠，取小鼠的肝、脾、肾三个脏器组织。②100TCID50CCHFV tecVLP感染小鼠，500μl/只，感染2h后，分别经腹腔注射四种药物，500μl/只，连续感染3d，同样处死小鼠并取其三个组织。
将小鼠各个脏器组织研磨制成组织悬液并超声，12000r/min，4℃离心30min，收集上清定量待检；配制NanoLuc检测底物液，底物与缓冲液以1：50的比例配制，配制全程注意避光。将配制好的底物液10μl和各组样本10μl分别加入到1.5ml EP管，混合均匀，室温反应3min。打开EP管盖，上机操作检测NanoLuc的表达量。
将小鼠的脏器组织放入RNA保存液中，提取RNA后通过实时荧光定量PCR检测目的基因。
结果：如图12所示，在第一组中，索拉菲尼和氯喹的抑制作用最为显著，伊曲康唑次之。氯丙嗪虽然也表现出了抑制作用，但与其他三种药物相比，抑制作用稍弱。在第二组中，伊曲康唑和氯喹能够显著抑制tecVLP转录翻译，而索拉菲尼的抑制作用稍弱，氯丙嗪则不具备该作用。
如图13所示，肝脾肾三个组织均可以检测到四种药物对动物的保护作用，但各有差异，肝脏中的结果最为明显，其次是脾脏和肾脏。在检测药物是否抑制tecVLP入胞这一组实验当中，索拉菲尼和氯喹的作用较为突出，尤其是在肝脏中。在检测药物是否抑制tecVLP转录翻译这一组中，氯喹依然具备明显的保护作用，但索拉菲尼较伊曲康唑而言，保护效力较弱，氯丙嗪几乎没有发挥有效作用。
3、CCHFV tecVLP在疫苗评价中的应用研究
以pVAX为载体，分别构建了pVAX-Gn、pVAX-Gc、pVAX-NP DNA疫苗以及对照组pVAX空载体组和PBS溶媒对照组共五组免疫MHC(HLA-A11)小鼠。在第三次免疫后第十天，将辅助质粒pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-S，比例为10：4，质粒总量为30μg，提前24h预转至MHC(HLAA11)小鼠体内。将100TCID50CCHFV tecVLP感染小鼠，500μl/只，感染3d，然后脱颈处死小鼠，取各只小鼠的肝、脾、肾脏器组织备检。接下来将实验分为两组：①提取每只小鼠不同脏器组织的蛋白；配制NanoLuc检测底物液。将配制好的底物液10μl和各组样本10μl分别加入到1.5mlEP管，混合均匀，室温反应3min。打开EP管盖，上机操作检测NanoLuc的表达量；②将小鼠的脏器组织放入RNA保存液中，提取RNA后，以该RNA为模板并通过实时荧光定量PCR检测目的基因。通过试剂盒检测和RT-PCR方法，分析各免疫小鼠被CCHFV tecVLP感染情况，以此来评判各组疫苗对小鼠的保护情况。
此外，第三次免疫后鼠尾取血，室温静置2h，4℃过夜静置，然后3000r/min，4℃离心30min分离血清待检，通过中和实验检测各免疫组小鼠血清中的中和抗体。将48孔细胞培养板接种Huh7细胞，至细胞汇合度约70％-80％时，预转染辅助质粒pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-S，比例为10：4，质粒总量为0.5μg；转染辅助质粒后，4h之后换回2％DMEM培养液继续培养；24h后，血清提前过滤除菌并稀释：1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320；分别与100TCID50CCHFV tecVLP混合，在37℃生化培养箱下共孵育1h，随后加入到培养板中，200μl/孔，37℃CO2细胞孵箱2h后，吸弃孔内培养液，换回2％DMEM培养液继续培养48h。弃掉上清，裂解孔内细胞并离心，上清用于检测；配制NanoLuc检测底物液，分别加入到各孔中，上机检测NanoLuc的表达量。最后，通过Karber法获取不同组别小鼠中和抗体的GMT。
结果：通过试剂盒的检测和q-PCR的检测，显示在血清1：10稀释时，pVAX-GC组中无论是荧光蛋白的表达还是基因的相对表达量均比较低，pVAX-GN和pVAX-GC组中只有个别个体产生了中和作用。当血清1：40稀释时，pVAX-GC组中依然有小鼠体内检测到了中和效力，但其余两组没有。结果显示，pVAX-GC组血清稀释比为1:40时有中和作用；pVAX-GN和pVAX-NP两组只在1:10时有中和作用(图14-16)。
五组免疫后小鼠经tecVLP攻击后处理，q-PCR检测结果显示，在肝、脾两个组织中，pVAX-GC组中两只小鼠的荧光基因相对表达量与其余的组差异最为明显，而PpAX-GN和pVAX-NP两组小鼠有三只在脏器组织中检测到的荧光基因相对表达量高于pVAX-GC组。在肾脏中，同样是pAX-GC组的差异最为明显(图17)。
组织提取蛋白后检测后，在肝、脾、肾三个组织中，pVAX-GC组中两只小鼠的荧光值在千级，而pVAX-GN和pVAX-NP两组中只有一只的荧光值在千级，其余小鼠在三个组织中所得数值与对照组相差不大(图18)。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种CCHFV tecVLP的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以CCHFV菌株IbAr10200的L基因为骨架，敲除掉其编码基因，保留其非结构基因序列，同时插入NanoLuc荧光素酶基因序列，得到SEQ ID NO.1所示序列的片段，通过同源重组的方式将其克隆到pSMART-LCK载体中，得到重组微基因组质粒pSMART-LCKvL-NanoLuc；
2)扩增CCHFV菌株IbAr10200的L基因、M基因和S基因；
3)通过同源重组的方式将L基因克隆到哺乳动物表达载体pCAGGS-LCK，得到重组质粒pCAGGS-LCK-L；将M基因克隆到pCAGGS载体中，得到重组质粒pCAGGS-M；将S基因克隆到pCAGGS载体，得到重组质粒pCAGGS-S；
4)将pSMART-LCKvL-NanoLuc、pCAGGS-LCK-L、pCAGGS-M、pCAGGS-S以及pCAGGS-T7共转染Huh7细胞，培养2-3天，收集细胞培养上清，即得CCHFV tecVLP。
2.根据权利要求1所述的一种CCHFV tecVLP的制备方法，其特征在于，所述L基因、M基因和S基因的序列依次如SEQ ID NO.2-4所示。
3.权利要求2所述方法制备得到的CCHFV tecVLP。
4.权利要求3所述CCHFV tecVLP在建立Huh7细胞感染模型中的应用。
5.权利要求3所述CCHFV tecVLP在建立C57BL/6小鼠感染模型中的应用。
6.权利要求3所述CCHFV tecVLP在建立抗CCHFV药物筛选平台中的应用。
7.权利要求3所述CCHFV tecVLP在建立CCHFV疫苗评价平台中的应用。
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