CN108478601B - 弓形虫基因缺失虫株在制备抗肿瘤生物制剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了弓形虫基因缺失虫株在制备抗肿瘤生物制剂中的应用，所述弓形虫基因缺失虫株为同时缺少了LDH1与LDH2基因，或者同时缺少了LDH1与OMPDC基因的弓形虫突变虫株。本发明旨在提供一种用减毒弓形虫生物制剂治疗动物黑色素瘤等实体瘤的方法，确立了其剂型，探明了虫株的接种程序及接种剂量，通过小鼠实验证明其具有较好的抗动物黑色素瘤等实体瘤作用，有良好的应用前景。

Description

弓形虫基因缺失虫株在制备抗肿瘤生物制剂中的用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及弓形虫基因缺失虫株在制备抗肿瘤生物制剂中的用途，本发明还涉及一种抗肿瘤生物制剂。

背景技术

随着社会的飞速进步和人民物质生活水平的提高，宠物的饲养量快速增多且宠物与人的关系也愈加密切，犬猫等宠物已然成为人们非常重要的伴侣。与此相对应的是人们对于宠物的健康和它们的福利也越来越重视。伴随宠物寿命的延长，它们发生疾病的频率也逐渐增加。犬猫肿瘤病为，近年来呈上升趋势。随着宠物年龄的增长，肿瘤疾病，如皮肤瘤、淋巴瘤等是犬猫等宠物的常见多发病，是危害宠物健康的主要杀手之一，年龄在10年以上的犬与猫，一半以上最终死于癌症。目前肿瘤疾病治疗费用昂贵且效果不理想，因此开发新的治疗手段仍十分重要。

弓形虫是一种可以进行体外培养的单细胞原虫，在全世界范围内广泛流行，感染人、猫和猪等几乎所有温血动物，呈机会性致病。目前的研究表明减毒活疫苗是弓形虫疫苗设计最为有效的途径。突变弓形虫虫株在免疫后能够引起免疫反应特征，因而具有抗动物肿瘤的潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种弓形虫基因缺失虫株在制备抗肿瘤生物制剂中的新用途，本发明的另一个目的是提供一种抗肿瘤生物制剂。

所述的弓形虫基因缺失虫株，是同时缺少了弓形虫LDH1与LDH2基因，或者同时缺少了LDH1与OMPDC基因的弓形虫虫株。

其中，所述缺少了LDH1与LDH2基因的弓形虫虫株，申请人已于2017年3月15日申请了中国发明专利，专利号为201710153753.X，该申请已于2017年9月22日公开，公开号为CN107190025 A。

其中，所述缺少了LDH1与OMPDC基因的弓形虫虫株，申请人已于本申请的同日向国家知识产权局递交了发明专利申请，专利名称为“缺失OMPDC和LDH1基因的弓形虫减毒活疫苗”。

申请人通过向小鼠皮内接种黑色素瘤B16F1细胞，然后瘤内接种弓形虫基因缺失虫株的速殖子混悬液，验证弓形虫基因缺失虫株的抗肿瘤效果，结果发现：接种虫株的治疗组瘤体重量显著小于对照组，说明弓形虫基因缺失虫株有抑制肿瘤的生长、降低瘤体重量的效果；20天内，治疗组小鼠均存活，而对照组小鼠均死亡，脾脏重量分析结果显示：治疗组小鼠脾脏平均重量大于对照组，并且治疗组的IFN-γ和IFN-a水平显著升高，提示弓形虫基因缺失虫株可刺激机体产生较强的细胞免疫应答。因此，本发明提供的两种弓形虫基因缺失虫株有制备抗肿瘤生物制剂的潜力，尤其是抗黑色素瘤生物制剂的潜力。

申请人提供的一种抗肿瘤生物制剂，它是弓形虫基因缺失虫株的速殖子混悬液，所述弓形虫基因缺失虫株是同时缺少了LDH1与LDH2基因，或者同时缺少了LDH1与OMPDC基因的弓形虫虫株。

优选地，所述肿瘤为黑色素瘤。

优选地，所述速殖子混悬液的溶剂为无血清的DMEM溶液或者PBS。

进一步优选地，所述的抗肿瘤生物制剂，为瘤体内注射生物制剂。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种用减毒弓形虫生物制剂治疗动物黑色素瘤等实体瘤的方法，确立了其剂型，探明了虫株的接种程序及接种剂量，通过小鼠实验发现其对于黑色素瘤有较好的治疗作用，具有很好的应用价值。按照其治疗黑色素瘤的原理，该方法同样具有治疗其它实体瘤的潜力。

附图说明

图1为乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(ompdc)基因的敲除示意图；

图2为Δompdc::DHFR虫株的PCR鉴定条带图；

图3为Δompdc::DHFR虫株DHFR药筛标签切除的鉴定条带图；

图4为乳酸脱氢酶1(ldh1)基因敲除示意图；

图5为ΔompdcΔldh1::DHFR虫株的PCR鉴定条带图；

图6为ΔompdcΔldh1::DHFR虫株药物筛选标签DHFR切除鉴定；

图7为弓形虫ME49Δldh1Δldh1虫株治疗接种程序；

图8为弓形虫ME49ΔompdcΔldh1虫株治疗接种程序；

图9为ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1虫株治疗的小鼠20天内肿瘤体积变化；

图10为经ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1虫株治疗后第20天小鼠肿瘤重量比较；

图11为经ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1虫株治疗后小鼠的存活情况；

图12为经ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1虫株治疗后第20天小鼠脾脏重量比较；

图13为经ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1虫株治疗后第20天小鼠血清中IFN-γ水平比较；

图14为经ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1虫株治疗后第20天小鼠血清中IFN-a水平比较。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1弓形虫△ldh1△ldh2和△ompdc△ldh1虫株的功能验证

(1)实验动物

7周龄雌性C57BL/6小鼠购自华中农业大学实验动物中心。

(2)细胞

小鼠黑色素瘤细胞B16F1购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；

人包皮成纤维细胞HFF购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)；

(3)主要试剂

①含10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基：在超净台中取45ml RPMI培养基于50ml离心管中，加入5ml用直径0.22μm的滤器过滤的FBS，混匀，于4℃保存备用。

②含10％FBS的DMEM培养基：在超净台中取45ml含青链霉素(青霉素浓度为100U/ml，链霉素浓度为0.1mg/ml)的DMEM培养基于50ml离心管中，加入5ml用直径0.22μm的滤器过滤的FBS，混匀，于4℃保存备用。

③含2％FBS的DMEM培养基：在超净台中取490ml含青链霉素的DMEM培养基于灭菌玻璃瓶中，加入10ml用直径0.22μm的滤器过滤的FBS，混匀，于4℃保存备用。

(4)B16F1细胞传代

①弃去已经长满B16F1细胞的T25瓶内的培养基，加入约3ml PBS平缓晃动洗涤残余的培养基，弃PBS。

②加入700μl 0.05％胰酶于洗涤后的T25瓶内，平缓晃动使之均匀覆盖底壁，将T25瓶置于37℃温箱消化30s。

③立即加入5ml含10％FBS的RPMI培养基终止消化，混匀后取500μl加入到装有4.5ml10％FBS/RPMI培养基的新T25瓶内，混匀后将T25放入含5％CO₂ 37℃的细胞培养箱内培养48h。

(5)HFF细胞传代

①弃去已经长满HFF细胞的T25瓶内的培养基，加入约3ml PBS平缓晃动洗涤残余的培养基，弃PBS。

②加入700μl 0.05％胰酶于T25瓶内，平缓晃动使之均匀覆盖底壁，将T25瓶置于37℃温箱消化1min。

③立即加入20ml含10％FBS的DMEM培养基终止消化，混匀后分装到4个新的T25瓶内，放入含5％CO₂ 37℃细胞培养箱内培养3天以上。

(6)弓形虫虫株传代

取已经长满的HFF细胞，弃去原有培养基，每瓶加入5ml含2％FBS的DMEM培养基。用无菌巴氏吸管刮下待传虫株培养瓶中的所有细胞，混匀后取100μl至上述新的HFF细胞培养瓶T25中，混匀后放入含5％CO₂ 37℃培养箱内培养72-96h。

(7)C57BL/6小鼠皮内接种B16F1细胞

①取培养于T75中的B16F1细胞，弃去瓶内培养基，加入约8ml PBS平缓晃动洗涤残余的培养基，弃去洗涤液。

②加入2ml0.05％胰酶于T75瓶内，平缓晃动使之均匀覆盖底壁，将T75瓶置于37℃温箱消化45s。

③立即加入8ml含10％FBS的RPMI培养基终止消化，混匀，将细胞悬液移入到50ml离心管中，混匀，用细胞计数板在显微镜下计数。

④按照1.25*10⁵个B16F1细胞每只小鼠的剂量皮内接种7周龄雌性C57BL/6小鼠，设置注射RPMI培养基组做对照。

⑤每天观察记录小鼠的精神状态，每两天称量体重、用数显卡尺测量肿瘤长和宽，肿瘤体积计算公式为：体积(mm³)＝(长*宽²)/2，当小鼠瘤体直径大于1.5cm濒临死亡时，对小鼠进行安乐死。

(8)小鼠瘤内接种弓形虫

①将ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1虫株培养至10％左右溢出的状态(接种后约60h)，弃去原有培养基，加入约3ml不含FBS的DMEM培养液平缓晃动洗涤3次。然后加5ml不含FBS的DMEM培养液，用细胞刮刮下贴壁的细胞，用5ml注射器/22G针头吹打细胞4-5次将虫体从HFF细胞中挤出，用孔径3.0μm的滤器过滤到15ml离心管中。

②用细胞计数板对过滤的虫体进行计数。

③按照治疗程序中每只小鼠瘤内接种1.0*10⁴或1.0*10⁵个速殖子的剂量瘤内注射弓形虫悬液(悬液为DMEM培养液或者PBS)，对照组小鼠瘤内注射不含FBS的DMEM培养液或者PBS。

④每天观察记录小鼠的精神状态，每两天称量体重、用数显卡尺测量肿瘤长和宽，肿瘤体积计算公式为：体积(mm³)＝(长*宽²)/2。

(9)血液样品的收集

至治疗程序中第20天，经眼球采集小鼠血液，室温静置凝血1h后，5000rpm离心10min，收集血清移入新的1.5ml离心管中，放于-20℃保存备用。

(10)肿瘤样品的收集

在实验设计的时间点麻醉小鼠并处死，手术取出小鼠肿瘤，置于离心管中，每个肿瘤样品称重并记录。

(11)小鼠脾脏样品的处理

每一组小鼠随机取三只，麻醉并处死后解剖，观察内脏器官的形态颜色，并取出脾脏，称重并记录。

(12)血清中细胞因子IFN-γ和IFN-a检测

将小鼠γ干扰素(IFN-γ)和IFN-a酶联免疫吸附测定试剂盒提前30min从4℃冰箱取出，平衡至室温。将小鼠血清样品从-20℃拿出，室温融化。

将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)，根据用量，即取4ml浓缩洗涤液于洁净烧杯中，加入100ml双蒸水稀释混匀，备用。

将血清用PBS作1:1稀释，即取100ul血清样品于新的1.5ml离心管中，加入100ulPBS混匀，备用。

将冻干标准品于10000×g离心1min，加入1ml标准品稀释液，旋紧管盖，静置10min，待其充分溶解后混匀，按照1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、0pg/ml的浓度倍比稀释。

加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，稀释后的标准液和样品每孔100ul。用封板胶纸封住反应孔，包上锡纸，37℃孵育90min。孵育完成前5min将浓缩生物素化抗体用生物素化抗体稀释液稀释(1:100)，配置生物素抗体工作液。根据用量，即取30ul浓缩生物素化抗体于一新的15ml离心管中，加入3ml生物素化抗体稀释液，用微量振荡器混匀。

弃去孔中液体，拍干，每孔加入生物素化抗体工作液100ul，用封板胶纸封住反应孔，包上锡纸，37℃孵育60min。孵育完成前5min将浓缩酶结合物用酶结合稀释液稀释(1:100)，配置酶结合工作液,。根据用量，即取30ul浓缩酶结合物于一新的15ml离心管中，加入3ml酶结合物稀释液，用微量振荡器混匀。

弃去孔中液体，拍干，每孔加入350ul洗涤液，浸泡1-2min后弃去液体，拍干，洗板3次。每孔加入100ul酶结合工作液，用封板胶纸封住反应孔，包上锡纸，37℃孵育30min。

弃去孔中液体，拍干，每孔加入350ul洗涤液，浸泡1-2min后弃去液体，拍干，洗板5次。每孔加入显色液90ul，用封板胶纸封住反应孔，包上锡纸避光，37℃孵育15min至标准孔出现明显剃度为止。

每孔加入终止液50ul，终止反应，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。

本发明的有益效果将通过以下数据说明：

1)ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1虫株治疗20天内小鼠肿瘤体积比较实验

各试验组取6只小鼠，分别皮下接种黑色素瘤细胞1.25*10⁵/只。接种8天后瘤体直径大于5mm，接种ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1进行治疗，与未治疗注射PBS的B16F1对照组比较，结果如图9和图10所示：治疗组瘤体不再增大，而对照组小鼠瘤体体积不断增大，且第20天时治疗组瘤体重量显著小于对照组。

2)ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1虫株治疗20天内小鼠存活实验

如图7和8所示接种程序接种瘤细胞和进行治疗，如图11所示结果：20天内，对照组小鼠瘤体直径均大于15mm死亡，而治疗组小鼠均存活。

3)ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1虫株治疗引起的免疫反应

第20天时剖杀小鼠，进行脾脏重量分析，如图12所示结果：ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1治疗组小鼠脾脏平均重量大于未治疗B16F1对照组，并且如图13和图14所示，ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1可以显著升高IFN-γ和IFN-a水平，提示ME49Δldh1Δldh2、ΔompdcΔldh1虫株可刺激机体产生较强的细胞免疫应答。

(13)统计学分析

使用GraphPad Prism 5软件采用one-way ANOVA with Bonferroni post tests分析，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,NS:无显著差异。

本发明通过向患病动物注射减毒的弓形虫生物制剂，进而抑制瘤的生长达到治疗肿瘤的效果，所述的减毒弓形虫生物制剂，是缺失了弓形虫LDH1与LDH2基因，或者是LDH1与OMPDC基因的弓形虫虫株，通过瘤内注射能够抑制肿瘤的生长。

实施例2弓形虫虫株(ME49△ompdc△ldh1)的构建

(1)出发虫株ME49

ME49是球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株，具有乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶1基因，所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因和乳酸脱氢酶1基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgompdc质粒的构建

pSAG1-Cas9-TgU6-sgompdc质粒为CRISPR/Cas9系统的CRISPR质粒，该质粒构建以pSAG1-Cas9-TgU6-ccdb-sgMIC3质粒为模板，利用NEB公司Q5点突变试剂盒(

Site-Directed Mutagenesis Kit)将MIC3靶点特异的gRNA替换为基因ompdc靶点特异的gRNA，具体操作步骤如下：

①利用gRNA在线设计网站

(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)对目标基因打靶位点进行设计，根据所设计的靶点序列设计gRNA引物：上游引物gRNA-ompdc-Fw:

5’–GAGCTTGACTCCACCCTCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’

下游引物(gRNA-R)为：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’。

②在已灭菌的PCR管配制如下反应体系：

③PCR反应条件如下：

④PCR反应结束以后，在PCR管反应体系中加入0.7μl DpnI，放入PCR仪37℃进行消化30min。

⑤取新的灭菌PCR管，配制如下反应体系：

在PCR仪中，25℃反应15min。

⑥取全部步骤⑤的PCR产物转入100μl DH5α感受态细胞中转化，涂LB/Amp平板，37℃倒置培养过夜。

⑦挑取单菌落于5mlLB/Amp液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊。

⑧各取⑦中的菌液700μl与300μl 50％的无菌甘油于1.5mlEP管中混匀，-80℃保菌；余下菌液用于质粒提取，提取质粒后将该质粒与原始模板质粒进行凝胶电泳鉴定对比，用限制性内切酶SalI对对比正确的质粒进行酶切鉴定，反应体系如下：

将如上体系放置于37℃培养箱中3-5h后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性克隆质粒的酶切产物为两条大小分别为6kb和3.7kb的目的带。

⑨将鉴定为阳性克隆的质粒送生物公司测序，测序引物为MIC3反向引物，若测序结果显示靶点序列被全部替换，则该质粒构建成功。

⑩利用TRANSGEN公司的质粒提取试剂盒(

Hipure Plasmid MaxiPrepKit)对pSAG1-Cas9-TgU6-sgompdc)进行质粒提取，测定浓度、备用。

(3)ompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR同源模板的制备

该质粒的构建是利用Vazyme公司的多片段无缝连接试剂盒(ClonExpress^TMMultiSOne Step Cloning Kit)将基因ompdc的5’同源臂，3’同源臂和带有loxp位点的DHFR药物筛选标记进行连接所得，具体操作步骤如下所示：

①在ToxoDB网站上输入拟敲除基因ompdc的Gene ID，确定该基因所在的locus，通过该基因所在的基因组序列确定它的5’同源臂(ompdc-5’UTR)和3’同源臂(ompdc-3’UTR)；

②按照多片段无缝连接试剂盒说明书中所介绍的方法设计5’同源臂，3’同源臂，loxp-DHFR-loxp，pUC19载体无缝连接扩增引物；

③利用所设计的引物(表1)用高保真酶(KD plus)分别从弓形虫ME49基因组DNA序列中扩增获得5’同源臂和3’同源臂片段，从带loxp-DHFR-loxp的质粒中扩增获得loxp-DHFR-loxp片段，利用所设计的特异性引物线性化pUC19载体(购自http://www.addgene.org)，分别对上述目的片段进行回收，并利用NanoDrop2000测定回收产物的浓度，-20℃保存备用。

表1.构建pompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR质粒引物

④根据回收产物的浓度配制如下反应体系：

充分混匀，PCR仪37℃反应30min，冰上放置5min。

⑤将10μl连接产物全部加入100μl DH5α感受态细胞中进行转化，涂LB/Amp平板，培养箱37℃倒置培养过夜。

⑥挑取上一步培养过夜平板中的单菌落于含5ml LB/Amp液体培养基的无菌PV瓶中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊。

⑦各取上一步振荡培养过夜的菌液700μl分别与300μl 50％的无菌甘油于EP管，-80℃保菌。

⑧利用TRANSGEN(

Hipure Plasmid MaxiPrep Kit)pSAG1-Cas9-Tgu6-sgompdc)pSAG1-Cas9-Tgu6-sgompdc)质粒提取试剂盒对上一步余下菌液提取质粒，对所提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

⑨将上一步鉴定疑似正确的质粒送生物公司测序，利用M13正向和反向引物进行测序分析，比对测序结果正确即可认为pompdc-5UTR::-loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR质粒构建成功，将鉴定正确的菌液进行质粒提取，-20℃保存。

⑩利用U5ompdc-Fw上游引物和U3ompdc-Rw下游引物，利用高保真酶KD Plus对pompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR质粒进行PCR扩增目的片段(ompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR)，对扩增到的目的片段进行切胶回收，测定浓度、备用。

(4)弓形虫基因敲除虫株△ompdc::DHFR的获得

①收取步骤(1)所述还在纳虫泡中即将溢出的Ⅱ型弓形虫ME49速殖子，用3μm孔径的无菌滤膜过滤除去宿主细胞碎片，1000rcf离心10min，弃净上清，用7-8ml的Cytomix(120mM KCl,0.15mM CaCl₂,10mM K₂HPO4/KH₂PO₄,25mM HEPES,2mM EGTA,5mM MgCl₂,pH＝7.6)重悬虫体沉淀，1000rcf再次离心10min，弃净上清。

②用250-300μl Cytomix重悬虫体沉淀，将全部虫体悬液加入4mm电转杯中，按照质粒和同源模板片段DNA摩尔比＝5:1比例(7500ng：1500ng)，加入电转杯中步骤(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgompdc质粒和步骤(3)ompdc-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ompdc-3UTR同源模板片段。

③用移液枪将DNA和ME49虫体悬液混合均匀，避免出现气泡。

④转染：将电转杯置于Bio-Rad电转仪内，设置程序1600V、25μF、50Ω、4mm，电击一次后，将程序更改为1500V、25μF、50Ω、4mm，电击两次。

将电击后的DNA虫体悬液混合液迅速吸出加入T25细胞瓶中(HFF宿主细胞+DMEM+2％FBS+双抗)，并加入终浓度250uM的尿嘧啶(后续培养过程中均需加入终浓度为250uM的尿嘧啶)，置于培养箱内培养。

⑤待60-80％转染后的虫体逸出HFF宿主细胞后，将细胞裂解使虫体从宿主细胞中释放虫体；取1000μl左右虫体悬液加入到新鲜的宿主细胞中(T25)，按照培养基：乙胺嘧啶体积比10000:1的比例加入乙胺嘧啶进行药物筛选。

⑥按照⑤中所述连续药筛三至五代，药筛稳定后，将虫子置于含有宿主细胞的96孔板中进行单克隆筛选(接4块96孔板)，剩余虫子可用DNA基因组提取试剂盒提取基因组，利用表2所示引物对其进行鉴定。图1所示为检测同源臂整合效率以及基因敲除效率，PCR1扩增到目的条带说明ompdc的5’同源臂成功整合入弓形虫基因组中，PCR2扩增到目的条带说明ompdc的3’同源臂成功整合入弓形虫基因组中，PCR3目的条带是检测敲除基因ompdc是否还存在在基因组中，若对照组ME49有PCR3条带，而转染实验组无PCR3条带，则说明ompdc被成功敲除。

表2.△ompdc::DHFR单克隆虫株PCR鉴定引物

⑦在96孔板中培养10-12天后观察是否有单克隆的存在，利用无菌枪头将单克隆对应孔的宿主细胞刮下，加入到含有宿主细胞的24孔板中，培养5d左右，当60％～70％的宿主细胞被裂解时，用无菌枪头刮取100μl虫液到新的24孔板中继续培养，其余剩下虫液用于DNA提取并利用表1所示引物鉴定单克隆。

⑧若PCR1和PCR2有特异性目的条带而PCR3无目的条带(如图2所示)，说明该单克隆虫株为基因敲除虫株△ompdc::DHFR；将确定为△ompdc::DHFR的虫株从24孔板中传入T25培养瓶扩大培养；对T25扩大培养后的基因敲除虫株再次进行PCR1，PCR2和PCR3鉴定，PCR反应体系如下，若鉴定结果与之前一直，则可在扩大后进行冻存。

在灭菌PCR管中配制如下反应体系：

PCR反应条件如下：

⑨PCR产物的鉴定：取反应完成的PCR产物10μl，琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示，表示△ompdc::DHFR虫株构建成功。

(5)△ompdc::DHFR虫株DHFR药物筛选标签的删除

在构建△ompdc::DHFR虫株时，外源性的插入了经过突变，缺失内含子的DHFR序列，使得转染后的虫株具有了药物抗性，便于在构建过程中用药物乙胺嘧啶进行筛选。在外源性插入的DHFR序列的两端各有一个loxp位点，可用Cre质粒对其进行切除。

①收集步骤(5)中的新鲜的△ompdc::DHFR虫株速殖子，用孔径为3μm的滤器过滤，去除宿主细胞碎片，纯化速殖子。

②将收集到的纯化的速殖子1000rcf离心10min，弃净上清，加入7-9ml的电转缓冲液Cytomix重悬沉淀后，1000rcf离心10min，弃净上清。

③用250-300μl的电转缓冲液Cytomix重悬速殖子沉淀，加入4mm的电转杯中，并加入2μg-4μg的Cre质粒，混匀，避免出现气泡。

④将含有速殖子悬液、Cre质粒的电转杯放入Bio-Red电转仪中进行转染，转染程序为：1600V、25μF、50Ω、4mm，用此程序点击三次。

⑤将转染后的混合液迅速传入含有宿主细胞的T25细胞瓶中培养。

⑥待有20％-30％的速殖子从纳虫泡中溢出时，收集速殖子，按3个/孔的量传入96孔板进行切除DHFR标签虫株的筛选。

⑦在96孔板中培养10-12天后观察是否有单克隆的存在，利用无菌枪头将单克隆对应孔的宿主细胞刮下，加入到含有宿主细胞的24孔板中，培养5d左右，当60％～70％的宿主细胞被裂解时，用无菌枪头刮取100μl虫液到新的24孔板中继续培养，其余剩下虫液用于DNA提取并利用表3所示引物鉴定单克隆。

表3.△ompdc::DHFR虫株药物筛选标签切除的PCR鉴定引物

⑧因为弓形虫的基因组中原本就含有DHFR序列，该引物能在野生型虫株的基因组中扩增到一条700bp大小的目的带，在△ompdc::DHFR虫株中能扩增到大小分别为700bp、235bp的两条目的带，△ompdc::DHFR虫株在经过Cre质粒转染后，若我们外源性插入的loxp-DHFR-loxp同源模板片段被切除，则只能扩增到一条700bp大小的目的带，如图3所示，得到切除药筛标签的基因敲除虫株△ompdc。

(6)pSAG1-Cas9-TgU6-sgldh1质粒的构建

①引物设计同步骤(2)所述，上游引物gRNA-ldh1-Fw:

5’–GCCGGTCTGACCAAGGTGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’

下游引物(gRNA-R)为：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’

②在灭菌PCR管中配制如下反应体系：

后续步骤如同(2)中③至⑨所述操作。最后利用质粒提取试剂盒提取质粒，测定浓度，-20℃保存备用。

(7)ldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR同源模板的制备

该质粒的构建是利用Vazyme公司的多片段无缝连接试剂盒(ClonExpress^TMMultiSOne Step Cloning Kit)将从含有基因LDH1的5’同源臂，3’同源臂的以及pUC19载体片段的pldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR质粒中扩增得到的大片段和带有loxp位点的DHFR药物筛选标记片段进行连接所得，具体操作步骤如下所示：

①设计带有同源臂的引物(表4)利用高保真酶(KD plus)从质粒pldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR中扩增ldh1-5UTR-pUC19-3UTR-ldh1片段，用表1所示的引物，同样利用高保真酶从含有loxp-DHFR-loxp片段的的质粒中扩增loxp-DHFR-loxp片段，并回收两个片段，并利用NanoDrop2000测定回收产物的浓度，-20℃保存备用；

表4.构建pldh1-5’UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3’UTR质粒引物

②根据回收产物的浓度配制如下反应体系：

充分混匀，PCR仪37℃反应30min，冰上放置5min。

③将10μl连接产物全部加入100μl DH5α感受态细胞中进行转化，涂LB/Amp平板，培养箱37℃倒置培养过夜。

④挑取上一步培养过夜平板中的单菌落于含5ml LB/Amp液体培养基的无菌PV瓶中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊。

⑤各取上一步振荡培养过夜的菌液700μl分别与300μl 50％的无菌甘油于EP管，-80℃保菌。

⑥利用TRANSGEN(

Hipure Plasmid MaxiPrep Kit)pSAG1-Cas9-Tgu6-sgompdc)质粒提取试剂盒对上一步余下菌液提取质粒，对所提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；。

⑦将上一步鉴定疑似正确的质粒送生物公司测序，利用M13正向和反向引物进行测序分析，比对测序结果正确即可认为pldh1-5UTR::-loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR质粒构建成功，将鉴定正确的菌液进行质粒提取，-20℃保存。

⑩利用U5ldh1-Fw上游引物和U3ldh1-Rw下游引物(表4)，利用高保真酶KD Plus对pldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR质粒进行PCR扩增目的片段(ldh1-5UTR::loxp-DHFR-loxp::ldh1-3UTR)，对扩增到的目的片段进行切胶回收，测定浓度、备用。

(8)弓形虫基因敲除虫株△ompdc△ldh1::DHFR的获得

①收取步骤(5)中构建成功虫株△ompdc的新鲜速殖子，用无菌的3μm孔径滤器过滤除去宿主细胞碎片，1000rcf离心10min，弃净上清，用7-8ml电转缓冲液Cytomix重悬虫体沉淀，1000rcf再次离心10min，弃净上清。

余下操作步骤同步骤(4)②至⑤。利用表5所示引物对其进行鉴定，图4所示为检测同源臂整合效率以及基因敲除效率，PCR1扩增到目的条带说明ldh1的5’同源臂成功整合入弓形虫基因组中，PCR2扩增到目的条带说明ldh1的3’同源臂成功整合入弓形虫基因组中，PCR3目的条带是检测敲除基因ldh1是否还存在在基因组中，若对照组ME49有PCR3条带，而转染实验组无PCR3条带，则说明ldh1被成功敲除,如图5所示。

表5.△ompdc△ldh1::DHFR单克隆虫株PCR鉴定引物

(9)虫株△ompdc△ldh1::DHFR药物筛选标签的切除

同上述步骤(5)一样对虫株△ompdc△ldh1::DHFR进行药物筛选标签DHFR的切除，并利用表3所示引物对其进行鉴定得到△ompdc△ldh1虫株，如图6所示。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 弓形虫基因缺失虫株在制备抗肿瘤生物制剂中的用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2916

<212> DNA

<213> 弓形虫乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶 (OMPDC gene of Toxoplasma)

<400> 1

atgccggcag acgcgctgcg tgagaagccg gttgtccagg ctgctgtgaa tacctcggaa 60

gggtgcaaga acttcttcaa gacattggat gcaaggatcg aagcggtaga ttccttgctc 120

acagtcggcc ttgatccgca catcgcggac ctcccgtcgc cagccacagc tgagcgtgcc 180

tttgtatttt gtgaacgcat catcagggaa actcttcctt ttacgtgttg ttacaaaccg 240

aacagcgcgt tttttgaggc atttggtccc ccgggtttgc aggtacgtat ttcaatgtga 300

ggatggagca tggttgtcat ggccagatat actttagccc gacaacgtta ccaggcattt 360

ggagtacctc caactcctca gttgcaaaga tacactgcac atgctcgtgt agtaccgctg 420

agagacagaa ccacttgaaa cgtcatcttt cattagtatg aagcggttgt ccgaagttcg 480

gccatcattc tggaatctat cagtcctatg tttcctcact gcctaggtac tgttttcctg 540

tttgtgtata tcccgaaaaa ctgtattgaa agcaagcagt ggggatagcg gtgaagcagg 600

gggttggtga agcggtttcg gaggggacag ggaaatacct tcaatttttg aaaggcgcag 660

ttccctgttc cttcgcagtc accacggaca gactagagat atgtctgttc tgtacgcgcc 720

ttaccaagac ccgaaccgcg tacagggtgc aaacctttcg cgccataatc gaatgccgct 780

tgtcgccacg tgtaggcact cgagagagtc tgcgcgctga ttcccgacga tgttcctatt 840

cttctagacg ccaaaagagg ggacatagga tcgacggcgc aagcctacgc atcttcggct 900

tttgacgcgt tcaaggtatg gaacttcgag ccctaagagg ttgaagagag tacgtagaac 960

catgtttatt tcattaacat cgagtcggtt ctgtatacat acgcgtgctg ctgcagtgaa 1020

tgtattacaa gatatctcgt atgcatgcgc ccgacgagaa tatcgccaat atcatagcct 1080

tatgacgtgc gcgattcgtc tggtggcaaa tctgcggtct acaagtgatc tattgtcagc 1140

gcatggcagt aacgatctca tccatttatg cgggtgacgc attacatcgt gtcttttgtc 1200

aaaaatgtgc tgcttgatgt cgcgcaggcg gacggtgtca ccgtcaacgc ctacatgggc 1260

agagaagcag ttcgaccgtt tctgtcgtat cgaaacaaag gcgtatttgt acttgtgaag 1320

acgtcgaatc aatcgtccaa cgagtttcag accctgccag tgagggtgga gtcaagctcc 1380

gacactcagg atgtcccgct gtatgtacag atggccagag tttgcaacga acttgcccaa 1440

ggtgagagtg ggtccgtcag cttcgttaga ccagcttctc ttccgttgta tttgtctttt 1500

gtgagcgacc cgtgtcgcca gagcttcatg cttagctaca ccgctcggca gaactggcat 1560

ctctctcgct ccaggagtgt gatccgcgtt tccagttttt ggttgataag tcgcacccca 1620

gaggagaaaa atcctcagca cctgccatac agattcaacg gagtctcagg cagcttttta 1680

ctccgagccc gcacttgccc gacctgccat tttcgtttac acagagccac tttctgcggg 1740

gcggtggcga caaaaaccgc gagctttgta gtaaatgaaa ccacgtcgtg agaagtagtc 1800

cagttctccc ttcgaacact acgttgcctg ctacatatct gtgcctcatc gtcgagtgcc 1860

gctgtccgtg tcttgctcca ctttgtcaat ccgaactcag aatgcgtttc tgaggaagac 1920

tctccatcca cgactggaca tggcctccgt cataatgcgt cgggcggtgg tgtcggactc 1980

gtagtaggag caacagatat agaagctctt cgcgaggtgc gaaaggcatg cccggacctt 2040

tatattcttg ctcccggagt cggtgcccaa ggagcggacc tcgagagggc cttgagtgcc 2100

ggtaagcatg gagctgggtc tcagttgaga gcgaagttac acaattgaat ctgacattga 2160

ggttgatttg attgtcgctt gaggcgcctg tgaccctaat gatcccgaaa cgcaggaacc 2220

atagaagcaa cggagggaga cggaaccttg ctgttttagg tcattgtgcg ctaaacgtgg 2280

tttctggtac accgtgcaag atcgtatact cacgggtatg atcgcagtga aaatgctcct 2340

aagagcgaag aaataaggta ccacattttc aacacctcta cggtttttcc tgttacttgg 2400

gactcgttgc tctgccaggt ctctgcaagg acggcaaagg gatgcttatt cccgtctctc 2460

gtggcatatc acgagcggag gtaagggcag gttgtcttga cacttgtagc ccgtagtttt 2520

tgaaaatcca gcacaccgca tagaaccttg gtgacagaga tgcgtgcgtc actcgaacga 2580

atattccgat gacggcgaag ttgactgaag tatttctgtt ttcagcagta tatttttcag 2640

cgtttgtatg gccccaggat ggatgcaaaa ccaaccgact gcgcccttcg ctcagatgtg 2700

cggaatccac cggatccatg caatagaaaa tagatttcag atgacacgga tttgagatga 2760

aatcacccgt tcatagtaca gctgtttgcg tccactttgt ccgtcctccc tgttccgttc 2820

ccttcattgc agaatttagc tgcccaagct aacgcataca gagaacagat caatgaagtc 2880

agaagaggca ttgtccagca gtacgaggaa agctga 2916

<210> 2

<211> 3411

<212> DNA

<213> 弓形虫的乳酸脱氢酶1( LDH1 gene of Toxoplasma)

<400> 2

gcaaactcgt tgagtagcgt tctgctctct gatcgcgcca tggatccctg gtccctacgt 60

tccacccatt caccagagtt ctttgaatct tcaaaatgaa gtcaacaaac gacgcaaagc 120

acagtgtaac agtgaatcgg acggtccgcc ctcggaagca actctttcag aatgtagcga 180

ggggcctccg atccgactcg agatgtgtca gcatacagag tcaccccgtt tgttgaaatg 240

ccgtaggtac agattaacag aatacatacg caatgtatag tatgccgtgg atctctaaat 300

ctctacccga gggcctgctg tgcgaatgtg tcgcgtcgtt taaaactgaa cgtggaaacc 360

gttttcgtgc gatcccagtt actcggcggc gtctgaagtg tgtccctctt ctccacttca 420

agactgggac gggaacgaga gttggacgac cactggaagc gggcgctcga attttctaaa 480

gttggcctcg ggtgttcgtc cggtatctcg cagcagatga cgcagcactc cccgctgttt 540

aaggaactgg aatcttgaac tgtgcccctc taacatcgca ccgtctctgc gcaccgtcgc 600

tgttccgcga ctcccgtcag agcgatatcg cgttgcgtca cgtcatcgtt attcggtttt 660

tgttcgggaa aatggcagca gcgggacgaa cacactgggt agtgtccacg ccgcttccgt 720

cccacctgcg aaggtgcgtc caccacaact cacgcgacta ggtgctgcgg ctgcgaattc 780

gcgttcccac actcgaccag atttttttga ttttcgattt ccaaacgcga tttattccaa 840

tccgccttgt agcagactaa ccggtgcact tttgcacgtg tacgcaagac agcttcgcag 900

acaacatctg gcagcctccc gctcattttt agtcagcaaa aatggcaccc gcacttgtgc 960

agaggagaaa gaaggtggcc atgattggct ctggcatgat tggtggcact atgggctacc 1020

tgtgcgctct ccgtgagctc gctgacgtcg ttctctacga tgttgtcaaa ggtacgacct 1080

ccttgccgca attgccacga ttctcctttt gcgttccgat tgcccttgtg tgtgcggtgg 1140

acatccggtc aagatcgtgc tcctcggctt gcatgtagct gttttacggt gcaaactgaa 1200

atcggagcga ccagcgattt agctagaatt ctgctgtttt gcggtcgatt cgtgcgacgc 1260

ggaggcagag ggaacccgta cccaccaggg tctggcacgc cttcggtgtt ttcgttttct 1320

tacgtcgctg ttacacggtt atgctagacg cggagagttg tgacccgcgt gcatgtttcc 1380

tctgaatgat gcaggtcgta ccgtacccat ttccggtgtg ttacgggacc gtattttttg 1440

tgtttccggc ttgcttccgc gagcgacccg ctgtttatga tgacgtctca gctcggggag 1500

ttcccttttt gacacggtgt gtcgtgaaat atcgttcttt ttaatgtgta ccctgagtgt 1560

gtagcttgga cgtttatcat ttatgcctct tgatttgctg tgtttgcagg tatgcccgag 1620

ggtaaggctc ttgacctgag ccatgtgacc tccgtggtcg acaccaacgt ttccgtccgt 1680

gctgagtact cttacgaggc cgcgctcacc ggtgcggact gcgttatcgt taccgccggt 1740

ctgaccaagg tgccgggcaa gcccgactcc gagtggagcc gaaacgatct gctcccgttc 1800

aactcgaaga tcattcgcga gatcggtcag aacatcaaga agtactgccc caagaccttc 1860

atcatcgtgg tcaccaaccc gctggactgc atggtcaagg tcatgtgcga ggcctctggc 1920

gtcccgacca acatgatctg cggtatggcc tgcatgctcg actctggtcg cttccgccga 1980

tacgtcgccg acgcgctgtc tgtctctccc cgcgacgtcc aggccaccgt catcggcaca 2040

cacggcgact gcatggtccc gcttgtccgg tacattaccg tgaacggcta cccgatccag 2100

aagttcatca aggacggcgt agtcacggag aagcagctcg aggagatcgc tgagcacacc 2160

aaagtgtctg gcggcgagat cgtccgcttc ctcggccagg gttccgctta ctacgccccc 2220

gccgcatccg ctgtcgccat ggcaacatcc ttcttgaacg acgaaaagcg cgtcatcccg 2280

tgcagtgtgt actgcaacgg agagtacggc ttgaaggaca tgttcattgg tctcccggcc 2340

gtcattggag gcgccggcat cgagcgcgtc atcgagctcg agctgaacga ggaggagaag 2400

aagcagttcc agaagtccgt cgacgacgtc atggcgctca acaaggcggt tgctgctctt 2460

caggcgtaag cgttggcaaa acaggagcgg aatgccactt tactgcgcgg ggcccatgat 2520

ttatacacgc gtttgcaacg gaagcgaaaa gacggttccg gttcgcacca cgcgctcgtc 2580

ccgaaaaagg gaagtcgcgg cgctgtcggt caacgctgtg cgggttgcag gtgcgtgctt 2640

aagcatcaca aagtggcaga gccattttgt ccagggaagt agcgtctcaa acaggtgaac 2700

gcgtgcaagc atgagaggca tccgtcgctg cgttcgctca catatccgaa ggcaacagat 2760

tttggtcggc aaaagcctct gcacaaccgt ggcaagatga tggaaacagt tcgtgtttgg 2820

acagcaaccg cgttcgctct cactcaaaac cctgtagtcg agaggggtgt cgcatgactt 2880

ggcttttgtg ggagtgccca aatcgtctgt gttcgaggtg aagatcacat gtccgctgca 2940

gtactgaaaa acacttggtg cgcagaggcg agcgataggt gcgctgactt tttttttgtt 3000

tgttcaagga aggcatcttt ttttttttac cggttgtcca ctgtcatgtc gaaaacgtag 3060

tccgtgtgaa gtggttggtc ccctgttgtc ctttgtctag ccgcgcgtgt ctcatggagc 3120

atttttcaac gttgcttcaa acgaatgctg gtttctcgag tgcacctgca ccgaaagctg 3180

cgggaaattc aaaatctttc ccgacaatgc ggagccgtac gaaagccgac gtgggttatt 3240

tggcccatga tacatagagg aactggtgct ttgaaggcgc ccgtaggcac ctaacacttc 3300

agatggccgt agggaaacta aaactttttg ctgtttaccc cttacctacg aactcgtgtg 3360

actgctgaac gcgtcccctt tgttagcaac agtgcatcag ggtgagcagt t 3411

Claims (4)

1.弓形虫基因缺失虫株在制备抗肿瘤生物制剂中的用途，所述弓形虫基因缺失虫株是同时缺少了LDH1与OMPDC基因的弓形虫虫株，所述肿瘤为黑色素瘤。

2.一种抗肿瘤生物制剂，它是弓形虫基因缺失虫株的速殖子混悬液，所述弓形虫基因缺失虫株是同时缺少了LDH1与OMPDC基因的弓形虫虫株，所述肿瘤为黑色素瘤。

3.如权利要求2所述的抗肿瘤生物制剂，其特征在于：所述速殖子混悬液的溶剂为无血清的DMEM溶液或者PBS。

4.如权利要求2所述的抗肿瘤生物制剂，其特征在于：为瘤体内注射免疫疫苗。

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