KR102390674B1 - 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물 - Google Patents
개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명의 백신 조성물은 최근 국내에서 유행하고 있는 신규한 개 아데노바이러스 2형 균주를 분리하여 포르말린으로 불활화하여 항원 백신으로 사용하며, 국내에서 유행하는 개 아데노바이러스 감염증을 보다 효과적으로 예방할 수 있을 뿐만 아니라 불활화백신이기 때문에 안전성이 보장되며, 면역원성도 우수하였다. 또한, MDCK 세포에서 매우 높은 증식력을 나타내어 in vitro 증식을 통한 대량생산이 용이하다. 또한, 본 발명의 신규 개 아데노바이러스 2형을 2개월 령부터 4개 월령의 개에 경구로 투여하였을 때 바이러스가 분변으로 8일까지 검출되기 때문에 백신 개발 또는 테스트를 위한 공격접종용 바이러스주로도 유용하게 사용할 수 있어, 이후 보다 우수한 백신의 개발에도 큰 도움이 될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
대부분의 아데노바이러스는 사람을 포함한 동물에서 호흡기질병, 소화기질병 및 각결막염의 원인체로 알려져 있다. 소, 돼지는 각각 10, 4개의 혈청형이 알려져 있으며, 개와 말은 2개의 혈청형이 존재하는 것으로 보고하고 있다. 개 아데노바이러스는 1형과 2형으로 나눠지는데 1형은 전염성 간염을 일으키고, 2형은 전염성 후두기관염을 일으킨다. 개 아데노바이러스 1형 또는 2형의 감염증은 전 세계적으로 개, 여우, 늑대 등에서 보고되고 있다. 한국에서는 수달과 여우가 아데노바이러스 1형에 감염되었다는 보고가 있다. 2000년 이후로 농림축산검역본부에 진단을 의뢰하여 개 아데노바이러스 감염증으로 진단된 건수는 38건에 해당하며, 주로 유전자 증폭과 조직병리에 의해 진단되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 2002년도에는 6건의 개 아데노바이러스 감염증이 확인되었고 2017년까지 지속적으로 발생하고 있다. 개 아데노바이러스의 전파는 백신을 접종받지 않은 개에서 빠르게 일어나며, 오염된 먹이통, 주거장소, 타액이나 비루를 통해 이루어진다.
국내의 여러 동물에서 개 아데노바이러스에 대한 항체 분포를 확인하기 위하여 개, 너구리, 소, 돼지, 말, 고양이의 혈청에서 개 아데노바이러스 2형에 대한 항체검사를 실시하여 항체 양성률을 확인하였다. 하기 표에서 보는 것과 같이 개는 1,028두 중 910두 (88.5%)가 양성으로 확인되었으며, 백신을 하고 있지 않은 너구리는 51.3%, 소는 85%, 돼지 48.6%, 말 35%, 고양이 2.8%의 감염률을 나타내었다.
[축종별 개 아데노바이러스 2형에 대한 항체 양성률]
국내에서도 개 아데노바이러스 감염증을 예방하기 위하여 개의 복합백신인 DHPPL 백신이 사용되고 있다. 국내에서 사용 중인 개 아데노바이러스 감염증의 백신 주는 아데노바이러스 1형을 사용하는 제품도 있고, 2형의 경우 대부분 외국의 분리주를 사용하고 있다. 이것은 국내에서 자연적으로 감염된 개체로부터 바이러스를 분리하여 백신 주를 제작하지 않았기 때문이다. 최근 나고야 의정서로 인하여 유전자원에 대한 이익공유의 문제가 대두되고 있어, 국내에서 유래한 자원을 통해 개 아데노바이러스 2형 감염증을 예방하는 것이 바람직하다.
따라서, 현재 사용되고 있는 외국 분리주-기반의 개 아데노바이러스 백신은 국내에서 순환하고 있는 야외주와 큰 차이를 나타내므로, 면역원성 및 효능에 한계를 나타낼 수 있어, 국내에서 유행하는 개 아데노바이러스 2형 대한 예방 백신의 개발의 필요성이 대두하고 있다.
1. Tham KM, Horner GW, Hunter R. Isolation and identification of canine adenovirus upper respiratory tract of a dog. N Z. Vet J. 1998. 46(3), 102-5
2. Yang DK, Kim HH, Yoon SS, Ji M, Cho IS. Incidence and sero-survey of canine adenovirus type 2 in various animal species. J Bac Virol. 2018. 48(3), 102-108.
3. Yang DK, Kim HH, Yoon SS, Lee H, Cho IS. Isolation and identification of canine adenovirus type 2 from a naturally infected dog in Korea, Korean J Vet Res. 58(4). 1-6.
이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 국내에서 유행하는 개 아데노바이러스 2형에 대응하기 위한 백신 또는 백신 개발용 바이러스로 사용하기에 적합한 신규한 바이러스 주를 개발하고자 예의연구 노력하였다. 그 결과, 국내에서 분리한 개 아데노바이러스 2형을 동정하여 40대 계대배양함으로써, 신규한 개 아데노바이러스 2형 균주를 확립하였다. 상기 본 발명의 신규한 균주는 증식능 및 병원성이 우수하여 백신 개발 또는 테스트를 위한 공격 접종용 바이러스주로서 유용할 뿐만 아니라, 이를 불활화하여 백신으로 이용하는 경우 개 아데노바이러스 2형 감염을 안전하면서도 효과적으로 방어할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 개 아데노바이러스 2형 백신 또는 백신후보물질의 면역원성 검정 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 사료 첨가제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 불활화된, 수탁번호 KCTC13956BP로 수탁된 신규한 개 아데노바이러스 2형(Canine Adenovirus Type 2) 균주 또는 이로부터 유래된 항원을 유효성분으로 포함하는, 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물을 제공한다.
상기 수탁번호 KCTC13956BP로 수탁된 개 아데노바이러스 2형(Canine Adenovirus Type 2) 균주는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 균주이며; E1b 19K 단백질이 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고; E3 12.5K 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 균주는 국내 개 아데노바이러 2형 모균주로부터 분리 및 40대 계대배양된 신규한 개 아데노바이러스 2형 균주로서 APQA1701-40P로 명명하고 생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2019년 09월 18일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC13956BP를 부여받았다.
본 명세서에서, 본 발명의 신규한 균주인 "수탁번호 KCTC13956BP로 수탁된 개 아데노바이러스 2형(Canine Adenovirus Type 2) 균주"는 APQA1701-40P와 혼용되며, APQA1701-40P는 국내에서 순환하고 있는 개 아데노바이러스 2형에 속한다.
본 발명에서 "개 아데노바이러스 2형 (canine adenovirus type 2)"은 아데노바이러스과에 속하며 개과 동물에 감염되어 간염 또는 호흡기 질환인 폐렴을 발생시킬 수 있는 바이러스를 의미한다.
상기 APQA1701-40P는 농림축산검역본부로부터 제공받은 개 아데노바이러스 감염증 진단 시료에서 바이러스를 분리하여 여러 조건에서 바이러스를 배양하고 40대 계대 및 증식하여 얻은 바이러스주로, 40대 계대 및 증식을 통해 최초 분리주와 비교하여 핵산 서열 및 아미노산 서열에 변화가 발생하였으며, 이로 인해 환경에 적응하고 증식율이 증가된 균학적 특성을 갖는다.
본 발명의 항원은 서열번호 2의 염기서열이 코딩하는 폴리펩타이드이며; 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 항원은 본 명세서에 기재된 서열번호 3의 서열 뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물들도 포함할 수 있다. 예를 들면, 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항원의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항원의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다.
본 명세서에서, "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 개 아데노바이러스 2형 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
또한 본 명세서에서, "백신"은 항원, 즉 병원체를 약하게 만들어 인체 또는 동물에 주입하여 항체를 형성하게 하여 그 질병에 방어, 면역성을 가지게 하는 의약품을 총칭하는 것으로, 백신의 종류는 완전히 병원체를 죽여 만드는 불활화 백신과 병원성을 순화시킨 생백신이 있다.
이 중 불활화 백신은 병원체를 정제한 후 가열하거나, 자외선 조사 또는 포르말린이나, 알킬화 시약 등의 약품을 이용하여 병원성 미생물을 죽여서 만든 백신으로, 불활성화 할 때에 바이러스가 복제될 수 없게 만들지만 생물체 표면에 존재하는 항원의 구조를 그대로 유지시키는 것이 중요하다. 불활성화 백신은 주로 체액성 면역만을 유도하지만 안전성이 높아서 백신 접종의 부작용이 거의 없으며 다가 백신으로서 응용 가능성이 있다.
본 발명에 따른 불활성화 백신은 애주번트(adjuvant)를 포함할 수 있다.
상기 애주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다.
상기 애주번트는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 허용 가능한 애주번트로는 프로인트 완전 애주번트, 프로인트 불완전 애주번트, 사포닌, 미네랄 겔, 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 이들 중에서도 카보폴(Carbopol 974 PNF polymer) 또는 몬타나이드 젤 01(Montanide Gel 01)을 애주번트로 함유하는 것이 바람직하며, 카보폴의 경우 1 내지 5 mg; 몬타나이드 젤 01 (Montanide Gel 01)은 5 내지 15 중량 %를 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 APQA1701-40P는 MDCK 세포를 이용하여 증식시킬 수 있다. 예를 들어, MDCK 세포에 APQA1701-40P를 접종하고 D-MEM 배지 상에서 MDCK 세포를 배양하는 방법을 사용할 수 있다. 이때 D-MEM 배지에 DMSO를 0.5 내지 0.1% 농도로 함유시켜 배양하면 높은 바이러스 증식을 기대할 수 있다.
본 발명의 APQA1701-40P는 0.05% 포르말린으로 불활화하면 개 아데노바이러스 2형 예방용 백신으로 사용할 수 있다. 이 때 포르말린은 통상적인 바이러스의 불활화 방법을 적용할 수 있으나 다른 불활화제인 BEI는 개 아데노바이러스를 불활화 하는데 적합하지 않았다.
본 발명의 백신 조성물은 특정 유전자 결실에 의해 증식능이 개선된 변이체인 개 아데노바이러스 2형 균주 또는 이로부터 유래된 항원을 유효성분으로 포함하여, 상기 백신 조성물을 동물에 처리하여 개 아데노바이러스 2형 감염증을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 상기 조성물의 투여량은 투여대상의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 투여대상의 체중 1kg 당 0.1 내지 1㎖ (107.0 TCID50/㎖ 이상), 바람직하게는 체중 1kg당 0.2 ~ 0.4 ㎖을 2주 간격으로 2회 투여가 가능할 것으로 판단된다.
본 발명의 백신 조성물은 경구, 근육, 피하, 복강, 정맥, 진피, 안구, 뇌내 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 피하 투여경로를 통해 투여될 수 있다.
상기 백신 조성물은 포유 동물에 접종할 수 있으며, 포유동물은 개, 돼지, 말, 소, 양, 염소, 사슴, 너구리, 인간 등 일 수 있으며, 바람직하게는 개에 접종할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립(drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 개 아데노바이러스 2형 백신 또는 백신 후보 물질의 면역원성 검정 방법을 제공한다:
(a) 개 아데노바이러스 2형 백신 또는 백신 후보 물질을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계;
(b) 상기 백신 또는 백신 후보 물질이 투여된 인간을 제외한 동물에게 수탁번호 KCTC13956BP로 수탁된 신규한 개 아데노바이러스 2형(Canine Adenovirus Type 2) 균주 또는 이로부터 유래된 항원을 공격 접종하는 단계; 및
(c) 상기 공격 접종한 인간을 제외한 동물의 증상을 조사하는 단계.
본 발명의 면역원성 검정 방법에는 4주령 내지 20주령의 개를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 기니픽 및 개를 대상으로 하여 본 발명 바이러스의 백신으로서의 안전성 및 면역원성을 평가하였다.
이를 통해 안전성 및 면역원성이 검증되었으므로, 우선적으로는 사람을 제외한 동물, 예를 들어 개, 말, 소, 돼지를 포함한 가축과 멧돼지 및 너구리와 같은 야생동물 등에서 아데노바이러스 2형의 호흡기질병을 예방하는데 사용할 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명의 APQA1701-40P는 불활화하지 않은 상태에서 2개월 령 개에 간질성 폐렴의 병원성과 분변으로 바이러스 배출하여 다른 동물로 전파할 수 있다.
APQA1701-40P는 국내에서 유행하는 일반적인 야외주와 유전적으로 2 곳에서 차이가 있음에도 증식력이 높다는 점과 다루기가 용이하기 때문에 이를 기존의 백신의 재평가나 백신후보물질의 효능과 면역원성을 평가하는데 효과적으로 이용할 수 있다. 보다 구체적으로 개 아데노바이러스 2형 백신 또는 백신후보물질을 개에 피하 또는 근육 접종한 다음 APQA1701-40P를 공격 접종하고 분변 내에 바이러스의 배출을 확인하는 방법으로 효능을 평가할 수 있다. 본 발명에 따르면 APQA1701-40P가 2 개월 령 개에서 병원성을 나타낼 수 있다는 것이 확인되었으므로, 이 범위 내의 개를 대상으로 효능시험을 평가하고, 또 이 바이러스로 접종한 개의 혈액세서 항체가를 측정하여 면역원성을 평가하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 개 아데노바이러스 2형 예방용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 상술한 불활화한 본 발명의 개 아데노바이러스 2형 신규 균주 또는 유래 항원을 유효성분으로 포함하여, 보호 효과뿐만 아니라, 안전하므로 이를 사료 첨가제로 사용할 경우 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방 및 면역 증강에 기여할 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 불활화한 본 발명의 개 아데노바이러스 2형 신규 균주 또는 유래 항원 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 상술한 불활화한 본 발명의 개 아데노바이러스 2형 신규 균주 또는 유래 항원을 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 백신 항원은 국내에서 순환하고 있는 신규 개 아데노바이러스 2형을 분리한 것으로, 이를 불활화한 백신은 국내에서 유행하는 개 아데노바이러스 감염증을 보다 효과적으로 예방할 수 있을 뿐만 아니라 불활화백신이기 때문에 안전성이 보장되며, 면역원성도 우수하였다. 또한, MDCK 세포에서 매우 높은 증식력을 나타내어 in vitro 증식을 통한 대량생산이 용이하다. 또한, 본 발명의 신규한 균주인 개 아데노바이러스 2형(APQA1701-40P)을 2개월 령부터 4개 월령의 개에 경구로 투여하였을 때 바이러스가 분변으로 8일까지 검출되기 때문에 백신 개발 또는 테스트를 위한 공격접종용 바이러스주로도 유용하게 사용할 수 있어, 이후 보다 우수한 백신의 개발에도 큰 도움이 될 것으로 기대된다.
도 1은 2000년 이후 국내 개 아데노바이러스 발생 건수를 나타낸 그래프이다.
도 2는 APQA1701-40P를 MDCK cell에 감염시켜 나타난 세포변성효과 (CPE) 비교하여 나타낸 현미경 사진이다.
도 3은 APQA1701-40P를 MDCK cell에 접종하여 80% 아세톤으로 고정한 후 개 아데노바이러스 2형에 특이적인 단 클론 항체 (VMRD, USA)로 1차 염색하고, 2차로 형광항체로 2차 염색한 후 핵내 특이적인 형광을 나타낸 현미경 사진이다.
도 4는 염화세슘으로 APQA1701-40P를 정제한 사진으로 바이러스의 밴드를 확인할 수 있다.
도 5는 APQA1701-40P를 MDCK cell에 접종하여 초원심분리기를 이용하여 정제한 후 전자현미경으로 촬영한 사진으로, 전형적인 아데노바이러스의 입자 형태를 나타내고 있다.
도 6은 APQA1701-40P의 Fiber 유전자에 대한 특이 프라이머를 이용하여 유전자를 증폭한 사진이다.
도 7은 APQA1701의 Fiber 전체 유전자를 기존에 알려진 아데노바이러스 유전자와 비교한 phylogenetic tree이다. APQA1701 strain은 개 아데노바이러스 2형에 속함을 확인할 수 있다.
도 8a는 개 아데노바이러스 2형 APQA1701주와 APQA1701-40P주의 E1b 19K 아미노산 서열을 비교한 것으로 APQA1701-40P주의 E1b 19K 단백질 중 6개의 아미노산이 결손된 것을 나타내는 도이다.
도 8b는 개 아데노바이러스 2형 APQA1701주와 APQA1701-40P주의 E3 12.5K 아미노산 서열을 비교한 것으로 APQA1701주의 E3 12.5K 단백질의 21번째 아미노산이 알라닌에서 글리신으로 치환된 것을 나타내는 도이다.
도 9는 APQA1701-40P의 결손이 확인된 E1b유전자의 전후 프라이머를 이용하여 APQA1701-40P의 결손은 증명한 사진으로 11P부터 결손되기 시작하여 13P까지 일부 남아 있다가 14P에서 완전히 결손되는 것을 확인할 수 있다.
도 10은 APQA1701-40P strain에 대한 DMSO 농도별 증식곡선으로 0.25%에서 가장 높은 함량을 나타내고 있다.
도 11은 APQA1701-40P 균주를 접종한 MDCK 세포에서 일령별 증식곡선을 나타낸 그래프로 4일째에 가장 높은 함량을 나타낸다.
도 12는 APQP1701 균주의 계대수에 따른 바이러스의 함량 변화를 나타낸 그래프이다. 10P: 10대 계대한 바이러스, 20P: 20대 계대한 바이러스, 40P: 40대 계대한 바이러스로 40대 계대한 바이러스가 가장 높은 함량을 나타낸다.
도 13은 2개월 령 개에 APQA1701-40P를 비강과 경구로 투여한 후 체온을 측정한 그래프이다.
도 14는 APQA1701-40P를 2개월 령 개에 경구 및 비강 투여한 후 14일 후에 부검하여 폐 조직세포를 현미경으로 촬영한 사진으로, 폐 조직에 국소적인 적색경화와 간질성 폐렴을 확인 할 수 있다. 두 장의 사진은 hematoxylin and eosin으로 염색한 것으로 폐 세포 사진으로 세포질 내 다발적으로 폐포막이 비후되어 있으며, 림프구가 침윤된 것을 확인할 수 있다.
도 15는 본 발명의 일실시 예를 통해 107.5 TCID50/㎖의 APQA1701-40P주를 함유시켜 제조한 개 아데노바이러스 2형 불활화 백신을 나타낸 것이다.
도 16는 도 15에서 제조한 시험백신을 기니픽에 접종하여 개 아데노바이러스 2형 불활화 백신의 면역원성을 나타낸 그래프이다. 카보폴이 함유된 불활화백신이 겔이 함유한 백신보다 약간 더 높은 항체가를 나타내었다.
도 17는 카보폴이 함유된 개 아데노바이러스 2형 불활화 백신을 개에 접종하여 얻은 항체가를 나타낸 그래프이다.
도 2는 APQA1701-40P를 MDCK cell에 감염시켜 나타난 세포변성효과 (CPE) 비교하여 나타낸 현미경 사진이다.
도 3은 APQA1701-40P를 MDCK cell에 접종하여 80% 아세톤으로 고정한 후 개 아데노바이러스 2형에 특이적인 단 클론 항체 (VMRD, USA)로 1차 염색하고, 2차로 형광항체로 2차 염색한 후 핵내 특이적인 형광을 나타낸 현미경 사진이다.
도 4는 염화세슘으로 APQA1701-40P를 정제한 사진으로 바이러스의 밴드를 확인할 수 있다.
도 5는 APQA1701-40P를 MDCK cell에 접종하여 초원심분리기를 이용하여 정제한 후 전자현미경으로 촬영한 사진으로, 전형적인 아데노바이러스의 입자 형태를 나타내고 있다.
도 6은 APQA1701-40P의 Fiber 유전자에 대한 특이 프라이머를 이용하여 유전자를 증폭한 사진이다.
도 7은 APQA1701의 Fiber 전체 유전자를 기존에 알려진 아데노바이러스 유전자와 비교한 phylogenetic tree이다. APQA1701 strain은 개 아데노바이러스 2형에 속함을 확인할 수 있다.
도 8a는 개 아데노바이러스 2형 APQA1701주와 APQA1701-40P주의 E1b 19K 아미노산 서열을 비교한 것으로 APQA1701-40P주의 E1b 19K 단백질 중 6개의 아미노산이 결손된 것을 나타내는 도이다.
도 8b는 개 아데노바이러스 2형 APQA1701주와 APQA1701-40P주의 E3 12.5K 아미노산 서열을 비교한 것으로 APQA1701주의 E3 12.5K 단백질의 21번째 아미노산이 알라닌에서 글리신으로 치환된 것을 나타내는 도이다.
도 9는 APQA1701-40P의 결손이 확인된 E1b유전자의 전후 프라이머를 이용하여 APQA1701-40P의 결손은 증명한 사진으로 11P부터 결손되기 시작하여 13P까지 일부 남아 있다가 14P에서 완전히 결손되는 것을 확인할 수 있다.
도 10은 APQA1701-40P strain에 대한 DMSO 농도별 증식곡선으로 0.25%에서 가장 높은 함량을 나타내고 있다.
도 11은 APQA1701-40P 균주를 접종한 MDCK 세포에서 일령별 증식곡선을 나타낸 그래프로 4일째에 가장 높은 함량을 나타낸다.
도 12는 APQP1701 균주의 계대수에 따른 바이러스의 함량 변화를 나타낸 그래프이다. 10P: 10대 계대한 바이러스, 20P: 20대 계대한 바이러스, 40P: 40대 계대한 바이러스로 40대 계대한 바이러스가 가장 높은 함량을 나타낸다.
도 13은 2개월 령 개에 APQA1701-40P를 비강과 경구로 투여한 후 체온을 측정한 그래프이다.
도 14는 APQA1701-40P를 2개월 령 개에 경구 및 비강 투여한 후 14일 후에 부검하여 폐 조직세포를 현미경으로 촬영한 사진으로, 폐 조직에 국소적인 적색경화와 간질성 폐렴을 확인 할 수 있다. 두 장의 사진은 hematoxylin and eosin으로 염색한 것으로 폐 세포 사진으로 세포질 내 다발적으로 폐포막이 비후되어 있으며, 림프구가 침윤된 것을 확인할 수 있다.
도 15는 본 발명의 일실시 예를 통해 107.5 TCID50/㎖의 APQA1701-40P주를 함유시켜 제조한 개 아데노바이러스 2형 불활화 백신을 나타낸 것이다.
도 16는 도 15에서 제조한 시험백신을 기니픽에 접종하여 개 아데노바이러스 2형 불활화 백신의 면역원성을 나타낸 그래프이다. 카보폴이 함유된 불활화백신이 겔이 함유한 백신보다 약간 더 높은 항체가를 나타내었다.
도 17는 카보폴이 함유된 개 아데노바이러스 2형 불활화 백신을 개에 접종하여 얻은 항체가를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 본 발명의 신규한 개 아데노바이러스 2형 균주 APQA1701-40P의 제작
1-1. 국내에서 유행하는 변이된 개 아데노바이러스 2형의 분리
본 발명자들은 신규한 개 아데노바이러스 2형 균주를 획득하기 위하여, 다음과 같이 실시하였다.
먼저, 국내에서 유행하는 개 아데노바이러스 2형을 분리하기 위하여, 2017년 농림축산검역본부에 진단을 위하여 의뢰된 시료번호 17D248번 강아지의 뇌, 폐, 비장, 간, 심장, 임파절 및 소장에서 조직시료 7점을 수집하였다. 수집된 시료 1 g을 유발에 넣고, 0.5 g의 sea sand를 이용하여 유제하였다. 이 유제액에 D-MEM 5 ㎖를 넣어 20%의 조직 유제액을 만들고, 강렬하게 혼합한 다음 3,000 rpm에서 15분 원심분리하였다. 시료 7개의 상층액을 0.45 ㎛의 필터 디스크(filter disk)를 통과시켜 세균을 제거하였다. MDCK 세포(ATCC, CCL34)가 준비된 24 웰-플레이트를 PBS로 2회 세척한 후 시료 100 ㎕를 접종하고, 신선한 배지 1 ㎖를 추가하였다. 접종 후 1 시간을 배양하고, 접종 시료를 제거한 후 10% FBS가 함유된 신선한 배지 1 ㎖를 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 37℃ 이산화탄소 배양기에 넣고 7 일 동안 배양하면서 현미경으로 날마다 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 7 개의 시료 중 6 개의 시료에서 포도모양의 특이적인 세포변성효과를 관찰할 수 있었다. 이 시료를 6 웰에 준비한 MDCK 세포에 상기에 언급한 배지에서 계대한 결과, 2대에서도 동일한 세포 변성 효과를 나타내었다. 또한, 개 아데노바이러스 2형에 특이적인 항체를 이용하여 염색한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 세포핵 내에 특이적인 형광을 나타내어 개 아데노바이러스 2형임을 확인하였다.
한편, 바이러스 입자를 확인하기 위하여 MDCK 세포에 상기 분리주를 접종하여 100 ㎖를 증식하였다. 증식된 바이러스를 3 회 동결 및 융해를 반복하여 세포핵 및 세포질 내 바이러스를 유리시키고 3,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 세포 잔존물을 제거하였다. 이 상층액을 50 kDa 이상은 여과되지 않은 필터(viva spin)로 바이러스액을 5 배 농축한 다음 염화세슘 (cesium chloride)를 위에 정치한 후 초원심분리기를 이용하여 1시간 30분 동안 30,000 rpm에서 원심 분리하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 1.34 mg/ml에 바이러스의 밴드가 확인되었다.
이것을 수집하여 PBS 10 ml로 희석하여 위에서 언급한 동일한 방법으로 초원심하여 침전한 바이러스를 회수하여 전자현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 아데노바이러스의 입자를 확인할 수 있었다.
상기 결과물인 개 아데노바이러스 2형 분리주를 APQA1701주(APQA1701-1P)로 명명하고 하기 실시예를 실시하였다.
1-2. 개 아데노 바이러스 2형의 선발 및 계대
불활화 백신주는 바이러스 함량이 높아야 백신으로서 우수한 면역원성을 나타낼 수 있기 때문에 선발된 바이러스가 세포에 잘 증식할 수 있어야 한다. 이에, 상기 실시예 1-1에서 확인된 개 아데노바이러스 2형이 MDCK에서 높은 농도로 오랫동안 바이러스 함량을 유지하는, APQA1701주를 불활화 백신용 계대주로 선발하였다.
선발된 APQA1701주를 하기 표 1에서와 같이 증식용 배지에 5 mM 우레아(Urea) 또는 0.1% DMSO를 추가하여 계대하였다. 6대부터 20대까지 증식용 D-MEM 배지에 5 mM이 함유되도록 urea를 첨가하고 증식 및 배양하였다.
우레아는 강력한 계면활성제로 단백질의 비공유 결합을 파괴하는 특징을 갖고 있어 바이러스가 수용체와 결합할 때 투과성을 증가시킬 수 있다. 그러나, 하기 표 2에서와 같이 7.8 mM 이상의 우레아는 MDCK 세포에 독성을 나타내어, 5 mM의 농도가 되도록 배지에 첨가하여 6에서 40대까지 개 아데노바이러스 2형을 계대하였다.
DMSO (dimethyl sulfoxide) 는 세포에서 투과성을 증가시키는 성질을 가지고 있어서 배지에 추가하였을 때 바이러스가 MDCK 세포에 잘 들어갈 수 있도록 D-MEM 배지에 0.1%가 되도록 DMSO를 첨가하였다. 하기 표 2에서 보는 것과 같이 vero 세포에서 DMSO는 1% 이상에서 독성을 나타냈다. 그러나, 0.5% 이하 농도에서는 세포독성을 나타내지 않았다. 따라서, 21대부터 40대까지 개 아데노바이러스 2형을 계대하는데 DMSO를 0.1%가 되도록 추가하여 계대하였다. 상기 세포에서 40대 계대한 바이러스 함량을 확인한 결과 107.0 TCID50/mL을 나타내었고, 이를 하기 실시예에 이용하였다.
| 계대수 | 계대세포 | 처리내용 | 비 고 |
| 1-5 | MDCK cell | - | 104.5 TCID50/㎖ |
| 6-20 | MDCK cell | 5 mM urea | |
| 21-40 | MDCK cell | 5 mM urea, 0.1% DMSO |
| 물질 | 세포독성 | ||||||||
| 농도(mM) | 1000 | 500 | 250 | 125 | 62.5 | 31.2 | 15.6 | 7.8 | 3.9 |
| Urea | + | + | + | + | + | + | + | + | - |
| 농도 (%) | 10 | 5 | 2 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 | 0.01 |
| DMSO | + | + | + | + | - | - | - | - | - |
+: 세포독성, -: 정상
1-3. 개 아데노바이러스 2형 전체 유전자 염기서열 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1-2에서 분리한 MDCK 세포에서 40번 계대한 개 아데노바이러스 2형을 APQA1701-40P로 명명하고 생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2019년 09월 18일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC13956BP를 부여받았다.
또한, 상기 40대 계대한 APQA1701-40P의 개 아데노바이러스 2형의 F 단백질의 아미노산을 확인하기 위하여, 표 3의 프라이머를 이용하여 유전자를 증폭하고(도 6), 그 증폭된 유전자들을 pGEM-T easy vector에 클로닝하여 유전자의 염기서열을 확인하였다.
| 프라이머 이름 | 프라이머 염기서열(5' to 3') | 유전자 크기 | 목적유전자 |
| CAVF1(757) | TCCCGTTCACCAGCACCAGGGCC | 757 | Fiber gene |
| CAVR1(757) | GGTGAGAGGCGGGGGAGGGGT | ||
| CAVF2(549) | TGCCGGCCTTGCCGTGCAGA | 549 | |
| CAVF2(549) | TCGATACCCCCCCTCTCCCA | ||
| CAVF3(630) | CCAACCCCCAGCTGCCCCCA | 630 | |
| CAVR3(630) | CCTGAAGGCGGCAGCCTTACC |
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, APQA1701-40P는 개 아데노바이러스 2형에 속한 것을 확인하였다. F 유전자의 염기서열을 기존의 보고한 개 아데노바이러스 2형과 상동성을 확인한 결과 핵산의 상동성은 98.7% (1609/1629), 아미노산 상동성은 99.2%(539/543)으로 확인되었다.
또한, APQA1701-1P 및 APQA1701-40P의 전체 유전자의 염기서열을 NGS (Next generation sequencing) 기법(마크로젠 대한민국)으로 분석한 결과, APQA1701-40P의 유전자 염기서열의 ORF(open reading frame)는 약 30개로 나타났으며, 총 31,053개의 뉴클레오티드로 구성되어 있음을 확인하였으며, 상기 APQA1701-40P의 전체 유전자 염기서열은 서열번호 2에, 이의 아미노산 서열은 서열번호 3에 나타내었다. 또한, 상기 APQA1701-1P의 전체 유전자 염기서열은 서열번호 1에 나타내었다.
APQA1701-1P주와의 염기서열 및 아미노산의 상동성을 확인한 결과, 99% 이상의 상동성을 나타내었으나, APQA1701-40P 균주의 서열 상 18개의 뉴클레오타이드가 결손되어 있으며, 또한, 연역된 아미노산 서열로 비교했을 때 결손된 부위의 6개의 아미노산이 결손되어 있음을 확인하였다.
이러한 유전자의 결손은 단백질을 암호화하는 것이 짧아지므로 바이러스의 증식과 구조에 영향을 미칠 수 있다.
구체적으로, 40대 계대한 개 아데노바이러스 2형 APQA1701-40P 균주는 E1b 19K 유전자 중 6 개의 단백질을 암호화하는 18 개의 뉴클레오타이드가 결손된 것을 확인할 수 있다. E1b 19K 유전자가 코딩하는 APQA1701-1P 균주의 E1b 19K 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타내었고, 상기 APQA1701-40P 균주의 E1b 19K 아미노산 서열은 서열번호 5에 나타내었다.
상기 서열들을 얼라인먼트한 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, APQA1701-1P 균주의 E1b 19K 아미노산 서열 중 122번째 아미노산인 트립토판, 123번 아미노산인 세린, 124번 아미노산인 아르기닌, 125번 아미노산인 메티오닌, 126번 아미노산인 글루타민 및 127번 아미노산인 이소루신이 결손된 것으로 확인되었다.
즉, 본원발명의 신규한 APQA1701-40P 균주는 APQA1701-1P 균주의 서열번호 4로 표시되는 E1b 19K 아미노산 서열 중 124번부터 129번까지의 아미노산이 결손된 것을 특징으로 한다.
또한, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 본원발명의 신규한 APQA1701-40P 균주는 상기 결손 부위 이외에, 서열번호 6으로 표시되는 APQA1701-1P 균주의 E3 12.5K 유전자가 코딩하는 부위의 21번째 아미노산이 알라닌에서 글리신으로 치환된 변이체(variant)임을 확인하였다. 상기 E3 12.5K 유전자가 코딩하는 APQA1701-1P 균주의 E3 12.5K 아미노산 서열은 서열번호 6에 나타내었고, 상기 APQA1701-40P 균주의 E3 12.5K 아미노산 서열은 서열번호 7에 나타내었다.
| 프라이머 이름 | 프라이머 염기서열(5' to 3') | 유전자 크기 | 목적유전자 | |
| 3P | 40P | |||
| CAVDDF | TGCTACGCAACTGGCCTTCTGAC | 240 | 228 | E1b gene |
| CAVDDR | GGGTCGGGCAGCTGCAAGTCAT | |||
한편, 본 발명자들은 전체 염기서열 주에서 E1b 유전자의 18개 뉴클레오타이드가 결손된 것을 증명하기 위하여, 표 4에서 보는 것과 같이 프라이머를 작성하였고, 이 프라이머를 이용하여 APQA1701-10P부터 APQA1701-16P의 DNA를 추출하여 확인한 결과 도 9에서 보는 것과 같이 APQA1701-3P 및 10P는 240 bp의 밴드를 확인하였고, 11P부터 13P까지는 두 개의 바이러스가 공존하다가 APQA1701-14P는 228 bp의 밴드만을 나타내었다.
이는 APQA1701주의 6대부터 5 mM Urea를 첨가하여 계대하였는데 이 5 mM 우레아가 영향을 미친 것으로 추정하고 있다.
따라서, 본 발명의 신규한 개 아데노바이러스 2형 바이러스 APQA1701-40P는 계대 과정 및 특정 배지 조건을 통해 특정 유전자 부위가 결손되었음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 균주인, 40대 계대한 개 아데노바이러스 2형 APQA1701-40P주는, 최초 분리주와 비교하였을 때 염기서열 및 아미노산의 상이한 변화가 존재하는 신규 균주이며, 이에 의해 증식 속도가 빠르고 증식 환경에 적응할 수 있는 균학적 특징이 발휘된다.
실시예 2. 본 발명의 신규한 개 아데노바이러스 2형 APQA1701-40P의 균학적 특징 확인
2-1. 개 아데노바이러스 2형 APQA1701-40P의 증식능 평가
본 발명의 균주인, 40대 계대한 개 아데노바이러스 2형 APQA1701-40P주를 증식시키는 데 최적인 DMSO 농도를 선별하기 위하여, APQA1701-40P를 1, 0.5. 0.25, 0.125 및 0.075%의 농도로 DMSO가 함유되도록 하고, 접종 후 72시간에 수확하여 함량을 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 10진 희석하여 APQA1701-40P 함량을 확인했을 때, APQA1701-40P는 0.25%에서 108.0 TCID50/㎖의 바이러스 함량을 나타내었다. 이에, 개 아데노바이러스 2형 APQA1701-40P 바이러스 증식을 위한 최적 DMSO의 농도는 0.25%로 설정하였다.
또한, 개 아데노바이러스 2형 APQA1701-40P을 수확하는 데 최적인 수확 시간을 선별하기 위하여, APQA1701-40P를 25㎠의 플라스크에 접종한 후 7일 동안 매일 수확하여 함량을 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, APQA1701-40P 바이러스는 4일째에 107.0 TCID50/㎖의 바이러스 함량을 나타내었다.
상기 결과들을 기반으로 최적 DMSO의 농도와 최적 수확시간을 설정한 후 10대, 20대 및 40대 계대한 바이러스의 함량을 검사한 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 10대에서는 106.7 TCID50/㎖, 20대에서는 107.0 TCID50/㎖, 40대 (APQA1701-40P)에서는 107.5 TCID50/㎖를 나타내어 MDCK 세포에서 계대할수록 바이러스의 함량이 증가하는 경향을 나타내었다.
2-2. 개 아데노바이러스 2형 APQA1701-40P의 병원성 평가
본 발명자들은 APQA1701-40P주가 2개월 령 개에 호흡기 질환을 일으키는지 여부를 확인하기 위하여, 개 아데노바이러스 2형에 대한 항체 음성인 2개월 령 개 6 두에게 APQA1701-40P주 107.0 TCID50/㎖ 비강(1 ㎖) 및 경구(2 ㎖)로 접종한 다음 각각의 케이지에 사육시키고 매일 오전 오후로 임상관찰을 실시하였다.
그 결과, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 바이러스 접종 후 12일 동안 특이적인 임상관찰은 확인되지 않았다.
또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 매일 온도를 측정하고 확인한 결과 39℃ 이상 발열반응을 나타내지 않았다.
그러나, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, APQA1701-40P주를 개에 접종한 후 12일 동안 분변을 채취하여 분변 내 바이러스의 검출을 PCR로 확인한 결과, 접종 후 1일부터 8일까지 바이러스 배출을 확인할 수 있었다.
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 접종 후 14일째에 접종한 개를 부검하여 병리학적 소견을 확인한 결과, 경구 접종한 개의 폐는 간질성 폐렴이 확인되었다.
즉, 2개월 령 개에서 폐렴을 일으킨 것과 분변에서 바이러스의 배출을 확인하는 것은 백신의 효능을 확인할 때 공격용 바이러스로 활용이 가능함을 나타낸다.
| 개체번호 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 1 | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N |
| 2 | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N |
| 3 | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N |
| 4 | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N |
| 5 | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N |
| 6 | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N | N |
N: 정상
| 개체번호 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 1 | N | P | P | P | P | P | P | P | P | N | N | N | N |
| 2 | N | P | P | P | P | P | P | P | N | N | N | N | N |
| 3 | N | N | P | P | N | N | P | P | N | N | N | N | N |
| 4 | N | N | P | N | N | N | P | P | N | N | N | N | N |
| 5 | N | P | P | P | P | P | N | N | P | N | N | N | N |
| 6 | N | N | N | P | N | P | N | N | N | N | N | N | N |
N: 음성, P: 양성
실시예 3. 본 발명의 신규한 개 아데노바이러스 2형 APQA1701-40P의 백신 효과 확인
3-1. 개 아데노바이러스 2형 APQA1701-40P를 이용한 불활화 백신의 제조
본 발명자들은 선발된 개 아데노바이러스 2형 (APQA1701-40P)를 MDCK 세포에서 증식하고, 바이러스 함량이 107.5 TCID50/㎖임을 확인한 다음 바이러스를 불활화하기 위하여, 포르말린을 0.05%가 되도록 바이러스에 첨가하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음날 1 ㎖를 투석막에 넣고 PBS로 24시간 투석하였다.
투석한 바이러스가 불활화되었는지 확인하기 위하여, 준비된 MDCK 세포에 접종하고 5 일간 배양한 결과, 표 8에 나타낸 바와 같이, 불활화제에 따른 개 아데노바이러스 2형의 증식성 여부를 확인했을 때, 개 아데노바이러스 2형의 특이적인 세포 변성 효과를 나타내지 않았으며, 이를 고정하여 개 아데노바이러스 2형에 특이적인 항체를 이용하여 염색한 결과 핵내 형광이 나타나지 않아 불활화된 것으로 간주하였다. 반면, BEI로 불활화한 개 아데노바이러스 2형은 불활화되지 않았다.
도 15에서와 같이, 준비한 항원인 개 아데노바이러스 2형 (APQA1701-40P)에, MontanideTM Gel 01은 5%, 카보폴 (Carbopol 974 PNF polymer) 2 mg/ml이 되도록 혼합하여 2 종의 개 아데노바이러스 2형 불활화 백신을 제조하였다. 카보폴은 분말형태로 되어 있기 때문에 gel의 형태로 제조하여 첨가하여야 한다.
상기 카보폴의 제작과정은 Carbopol 974 PNF polymer 2 g을 증류수 94 ml에 넣고 1시간 동안 교반한 후 온도를 70℃까지 상승시켜 완전히 녹였다. 이때 1 N NaOH 6 ml를 넣고 중화시켜서 겔을 형성시켰다. 이렇게 제작한 카보폴은 20 mg/ml에 해당하며 멸균시킨 후 상온에 준비하고, 개 아데노바이러스 항원과 카보폴의 비율을 90:10으로 하여 백신을 제작하였다. 이렇게 되면 카보폴의 최종 농도는 2 mg/ml이 된다.
| 불활화제 | APQA1701-40P 증식여부 농도(포르말린/BEI) |
||||
| 0.4/4 | 0.2/2 | 0.1/1 | 0.05/0.5 | 0.025/0.25 | |
| Formalin (%) | - | - | - | - | - |
| BEI (mM) | + | + | + | + | + |
-: 증식하지 않음, +: 증식
3-2. 불활화 백신의 기니픽에서 면역원성 평가 및 에쥬번트 선정
상기 실시예 3-1에서 바이러스 함량이 107.5 TCID50/㎖이 되는 개 아데노바이러스 2형을 포르말린으로 불활화하였고, 2종의 애주번트를 이용하여 불활화 백신을 제조하였다. 2종의 불활화 백신을 기니픽 5두에 2주 간격으로 2회에 걸쳐 1 ㎖를 각각 근육접종 하였다. 2차 접종 2주 및 11주 후에 혈액을 채취하여, 개 아데노바이러스 2형에 대한 항체가를 검사한 결과, 도 16에서와 같이 카보폴이 2 mg/ml 함유된 불활화 백신은 접종 후 4주에 2,702 배 (211.4)와 MontanideTM Gel 01 5%가 함유된 불활화 백신을 접종한 기니픽은 2,352 배 (211.2)를 나타내어 높은 항체가를 나타내었다. 2주, 4주, 11주의 결과를 분석한 결과, 카보폴이 함유된 개 아데노바이러스 2형 불활화백신이 약간 더 높은 항체가를 나타내었고, 11주에는 카보폴이 2 mg/ml 함유된 불활화 백신은 1,024배 (210)를 나타내어 약간 감소하는 경향을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 개 아데노바이러스 2형 불활화 백신은 카보폴이 함유된 백신을 선정하였고 목적동물 실험을 진행하였다.
3-3. 불활화 백신의 개에서 안전성 및 면역원성 평가
상기 실시예 3-2를 통해 2종의 개 아데노바이러스 2형 불활화 백신 중에서 카보폴이 함유된 불활화 백신을 선발하였다. 상기 개 아데노바이러스 2형 (APQA1701-40P)주를 함유한 불활화 백신의 안전성을 확인하기 위하여, 카보폴이 함유되어 있는 불활화 백신을 아데노바이러스 2형 대한 항체가 없는 4개월 령 개에 2두에 2 ㎖ (2두분)을 피하 접종하고 14일간 임상 관찰한 결과, 하기 표 9에서와 같이 관찰기간 동안 호흡기 질환의 증상을 나타내지 않고 정상적으로 성장하였다.
면역원성을 확인하기 위하여 아데노바이러스 2형 대한 항체가 없는 4 개월 령 개에 3두에 피하로 1 ml씩 접종하고 접종 후 2주 후에 2차 접종을 실시하였다. 혈액은 접종 전, 1차후 2주째, 2차 후 2주째 채취하였고, 혈청에 대하여 개 아데노바이러스 2형을 이용하여 중화시험을 측정한 결과, 도 17에서와 같이 2차 접종 2주 후에 256배 이상의 항체가를 나타내었다.
따라서, 본 발명의 APQA1701-40P 유래의 항원을 이용한 개 아데노바이러스 2형 불활화 백신을 제조하여 개에 접종하였을 경우 개 아데노바이러스 2형에 대하여 315.17배 (2.8.3) 의 중화항체를 형성할 수 있음을 알 수 있었다.
| 접종백신 | 접종두수 | 접종량/방법 | 임상관찰 | 관찰기간 | 평균항체가 |
| 개아데노바이러스2형 백신 | 2 | 2 ㎖ (2두분) SC, 1회 |
정상 | 14일 | 256(log28) |
종합적으로, 본 발명의 균주는, 국내에서 분리해낸 분리주를 지속적으로 40 계대를 배양함으로써 모균주와 서열 상 차이에 의해 특정 아미노산의 결손이 존재하는 신규한 개 아데노바이러스 2형 균주인 것으로 확인되었고, 이를 불활화한 항원 백신으로 이용하는 경우, 개의 아데노바이러스 2형에 의한 감염증을 효과적으로 예방할 수 있음을 입증하였다.
또한, 본 발명의 신규 개 아데노바이러스 2형은 2-4개월 령 개 간질성 폐렴을 일으키는 등 호흡기에 병원성을 가지고 있어서 백신 개발 또는 효능시험을 위한 공격 접종용 바이러스로 유용하게 사용할 수 있어, 이후로 생백신 또는 혼합 백신의 개발에도 큰 도움이 될 것으로 기대된다.
한편, 국내에서 분리된 개 아데노바이러스 2형을 이용하여 상용화된 백신은 아직까지 없다. 반려동물의 시장이 점차 성장하고 있으며, 반려동물을 키우는 사람들이 늘어나고 안전성 및 효능이 우수한 예방약의 수요가 커지고 있는 실정이다. 개 아데노바이러스 2형이 개의 호흡기질환을 일으키는 원인 중 하나이기 때문에, 국내 분리 주를 이용한 예방백신은 현재 사용 중인 외국용 백신의 수입을 대체할 수 있을 뿐만 아니라, 최근에 분리 주를 이용하여 백신을 개발하면 동남아시아를 비롯하여 다른 나라에 수출이 가능하다.
따라서, 본 발명에서 기술하고 있는 개 아데노바이러스 2형 예방용 백신 조성물에 대하여 동물용 생물학적 제제를 생산하는 산업체에서 대량배양 시설을 갖추고, MDCK 세포를 잘 증식하는 제조업체는 충분히 불활화 백신을 제조할 수 있다. 위에서 기술한 조건에 맞추어 새로운 개 아데노바이러스 2형의 항원을 생산하고, 불활화 하여 애쥬번트와 혼합하여 백신을 제조하여 반려동물에 불활화 백신을 접종하면, 반려동물이 건강하고, 이에 따라서, 반려동물 산업이 더욱 성장하게 되는 선순환의 계기가 될 수 있을 것이다.
즉, 본 발명은 반려동물의 복지와 관련되며, 개의 호흡기 질환 중 개 아데노바이러스 2형에 대한 예방을 가능하게 하므로, 반려동물의 산업이 성장하면서 반려동물 예방 백신 산업시장도 성장이 예상됨에 따라 백신의 제조시설을 가지고 있는 생물학적 제제 회사에서 개 아데노바이러스 2형에 대한 불활화 백신을 제조할 수 있을 뿐만 아니라 개의 호흡기 질병을 일으키는 파라인플루엔자바이러스 또는 보데텔라 브론키셉티카 세균과 혼합 또는 복합 백신의 형태로 제품을 생산할 수 있어, 산업적으로 이용 가능성이 높을 것으로 예상된다
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> Vaccine Composition for Preventing Canine Adenovirus Type 2 Infection
<130> QIA1-102P
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 31071
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APQA1701-1P nucleotide seq.
<400> 1
catcatcaat aatatacagg acaaagaggt gtggcttaaa tttgggcgtt gcaaggggcg 60
gggtcatggg acggtcaggt tcaggtcacg ccctggtcag ggtgtttcca cgggaatgtc 120
cagtgacgtc aaaggcgtgg ttttacgaca gggcgagttc cgcggacttt tggctggcgc 180
cccgggtttc tgggcgttta ttgattttgc ggtttaccgg gtggtgcttt taccactgtt 240
tgcggaagat ttagttgttt atggagctgg tttcggtgcc agtttcccca cagctaatgt 300
gaaagtttat gtcaatataa cagaaacact ctgttctcag tttacagcac cccacccggt 360
ggttttttgc cacgcctttg ggttaatttt atttccctat acgcagcctt aaattctcag 420
tgcagacgaa agaggactac tcttgagtgc gcagcgagaa gagttttctc ttcactctgt 480
ctgatatatt ttctgaaaaa tgaaatatac tattgtgccg gcgccgcgca acctccatga 540
ttatgtttta gagctactgg aagagtggca gccggactgc cttgactgtg agtatcctca 600
tggcggcccc tcgccgccta ctctgcacga tctttttgat gttgagctgg agacttctca 660
cagccctctt gtgggcctgt gtgattcttg tgcggaggct gacactgatt cgagtgcgag 720
cactgaggct gattctggct ttagtccttt atccactccg ccggtttcac ctcttccacc 780
gcatcccacc tctcctgcta gcatttctga cgacatgttg ctgtgcttag aggaaatgcc 840
cacctttgat gacgaggacg aggttcgaag tgcggcgacc acctttgagc ggtgggaaaa 900
cacttttgac ccccatgtgg gtcctatttt tggctgtttg cgctgtgctt tttatcaaga 960
gcaggatgag aatgcacttt gtgggctttg ctatctaaag gcccttgctg aaggtaagtt 1020
ttaagttaat taaatgtttg ggcaggttaa atgttttagg tgtgtattga ttttaaattt 1080
tgctttttag tgccttttgc tttgcctgta cgttcagagc ccgcttcggc tggagctgag 1140
gaggaagatg atgaagttat ttttgtgtct gccaaacctg ggggcagaaa gaggtcagcg 1200
gctactccct gtgagccaga tggggtcagc aaacgccctt gcgtgccaga gcctgagcaa 1260
acagaacctt tggatttgtc tttgaagcca cgcccgcact aatctgtttg agtacaaagc 1320
aataaagtaa tcttgtttaa caagtttgcc tacatttgtg gttttacggg gcggggcgag 1380
tagtatataa tgccaaaagc cagtgcctgc ttcattaagc ttctagactg agctaagagc 1440
aggtagtatg gaccctctca agatttgtga aaactacctt acttttagag ctataattag 1500
gggaagtact ttgtcgcctg gattttttag gcggtggtgt tttcctgcct tggctgatgt 1560
ggtgggcaat atagtggaac aggaggaagg caggttttgg caaattttac ctgaaaacca 1620
cactttttgg ggtcttttgc gcaggggctt tactgttgct tcttttactg aaattattac 1680
agcagctcag ttggaaaata gaggtagaca gttggccttt ttagctttta tatcattttt 1740
gctacgcaac tggccttctg actctgtagt gcctgaagct gacagacttg acctggtctg 1800
tgcgccggca tggagcagaa tgcagatatg gagccagacc gccaggttaa tcaacgacct 1860
ccaagattcc gtgctcgagg agcaggggtc cgcggaagag gaagagtgcg aagaagcgct 1920
tttagcaggg gacagcgacg acccattatt cgggtagatg acttgcagct gcccgacccc 1980
ctgtatgtta tgcaagcttt gcaacgggac cacactttag aaatgcccag agggcaggta 2040
gattttagct ggattgaggc tgaagagagg cgggtaggtc ctacagacga gtggtacttt 2100
gaggctgtga agacttacaa agctaagccg ggagatgact tgcaaactat aatcaaaaac 2160
tatgccaaga tttccttaga atgtggggcc gtgtatgaaa ttaattctaa gattagggtt 2220
acgggggctt gctacattat tggtaattgt gctgtgctta ggcctaacct gcctgctgga 2280
gaagcaatgt ttgaggtttt gaatgttgat tttattccct ctattggttt tatggaaagg 2340
atagtgtttt ccaatgttat ttttgattgc aggaccaccg cgactgtagt gtgttgcatt 2400
agtgaaagaa acaccttgtt tcacaattgt gttttttctg gccctcacat gttatgtttg 2460
gaccttaggg cgggggcgga ggtgaggggc tgtcactttg tgggggcggt gtgtgcgttg 2520
cgtagcaagg ggctgtacag tattcgagtc aaaaatagca tttttgaaaa gtgtgctttt 2580
ggggtggtga ccgggtcaaa ggcttttatt agccattgca tgtttaagga ttgtacctgc 2640
tctattatgc tggggggtca gggcactatt gcccatagtc agtttattgt aactacttct 2700
gctgaggccc ccatgaacct gcaactgtgc acttgcgagg gtaatggaag tcatgtagtt 2760
ccattgggga atattcactt tgcttctcac cgggaagctt cgtggcctac gttttatgca 2820
aacaccttgg ttcgggtgcg cttgtatatg ggccggcgcc ggggagtttt tcaccccaag 2880
cagtctactt tgtcaatgtg tgtaattgca gcccctcggg gggttgtgca gagaatttat 2940
ttgtttggtg tgtatgatgc tacttgtgcc attatgcaac tgggcgaggc aggcaatgct 3000
gctagtgaaa gactgtgtac ttgcgggttc agacacagca ccccttccct gcgggccacc 3060
tatgtaactg acaccaggat tgaccgggag ctgaactctc aagacacggc tgagttcttt 3120
agcagtgatg aagataattt ttaggtgagt agatgggcgt ggtttggggg agtataaaag 3180
gggcgcggta cgtggctgtg tatttacagc catggaccct caacagaagg ggcttgtgaa 3240
cacgtgtttt gtgactacgc gtattccgtc ttgggcagga gcaagacaga atgtcaccgg 3300
gtcagattta gaaggaaagc ccgtgccctc agatgtgctg gaaagtggac gcccgcttgc 3360
agccccgcgc atcagaactt tgtatgagga gcagcagctg aacatgcttg cagtgaatgt 3420
tcttttggat gagctgaaga tccaggtggc tgccatgcaa aactctgtga ctgctattca 3480
gcgagaagta aatgatctaa agcaacgaat cgcccgagat taatgtaaaa ataaaattta 3540
tttctttttt gaatgataat accgtgtcca gcgttgtctg tctgtaatag ttctatgaat 3600
tctttccatg gcttggtaca ctttagcttg aatgttaagg tacatgggga tgagtccctc 3660
gtcggggctc aagtacagcc agtgcataca attgtcaatg ggctcagtat tgtatacaat 3720
ccaatcaaag ttagtattga ggcggtggta gttaaaaata tccttaagca ggagggaaat 3780
agcagtgggt tgtcccttag tgtagatgtt aataaaccta ttaagctggg aaggatgcac 3840
cttaggactg atgatatgca tctttgcttg gatttttaag ttggcaatgt ttcctccctg 3900
gtctcgtctg ggattcatgt tgtgcaagac cactataaca gagtagcctg tgcacttggg 3960
aaacctgtct agcagtttag agggaaaggc gtgaaagaac ttggctatgc ccctattgcc 4020
ccctaagtct tccatgcact catccattac aatagctatt ggccctttag aagcggccct 4080
cgcaaaaaca ttggtagggt tggtaacatc atagttggcc tcattggtga gttctgcata 4140
agacatttgt acaaacttgg gcatgatgct gccactctga ggaaccaccg tgttttcggg 4200
gcctgcaaga aagtttccct cacatatttg ggtttcccat gctgcaattt cctggggagg 4260
aatcatgtcc acctgggggg tgataaaaaa gactgtttct ggggcgggaa ctataagctg 4320
ggcagacatg aggttcctaa gaagctggga cttgccacac cctgtgggcc catacactgc 4380
agcaataaag ggttgcttgt agtagttaag ggatgcacag cttccatctt tattaaggta 4440
cttattgacc ttcatgcaac actgggttat gctatcttga atatctagta ggtcatttaa 4500
cagactgtct ccccccatag aaagcagttc ctcaaaagag gcaaagtttt tgaggggctt 4560
tagtccctct gcatatggca tgtttgttag gctttgctgg agagtttgca acctgtccca 4620
gaggcttttt aagtcatcca ctgcagctcc atccaggtag tttctgtgtt tcttgggttt 4680
ggatgcttgc ggctgtatgg aatgagacga tgcatgtcta gagcatgcag ggttttgtcc 4740
ttccatggcc tcagcttcct tgttagggtg gtttctgtca ctgtgaaagg ttgcacgtgg 4800
gcctgcacgc tggtgagggt cctgcgcagg ctcatcctgc tggttttgaa gacgtccgag 4860
ccctgctgca tgtcggcata gtagcaagct tttagcacat cataagagag ggtggaagtg 4920
gcatgacctt tggccctgag cttgcccttg cccacgtgat ggcacttagg gcaggtggtg 4980
tccttgagag catacaactt gggtgccagg tacactgatt ctgagctgta agcatccgat 5040
ccacacttct cacactgtgt ttcacactct actagccaag tgagctctgg gttgctggga 5100
tcaaagacta gcttgcctcc attttttttg agtcgtttct tacctttttc ttccatcaat 5160
ttgtaacctt ccatggtggt gaagaggctg tcagtgtctc cgtagacaga tttcaggacc 5220
ctgttttcaa gtggggttcc cgcgtcgttt tcgtagagaa actgagacca ctctgagaca 5280
aatgcccggg tccatgctag gacgaaggaa gcaatttgtg agggatatct gttattggct 5340
attagggggg tggacttttc taaagtatgt aaacaaaagt catcatcctc agcatcaata 5400
aacatgattg gcttataatg gtatgacgtc atgctaaaat tatgcataaa aggcgcttcg 5460
gcgagggggt ctttagttgg atcttcttcg ctgcaagaag gcggtgccaa ctggtgaacg 5520
tcagaattga caggtgggta cgctacgaca aattctggca tgatttctgc acacaaattg 5580
tctgtttcta tgtatgagga tgatttgact acataggcac cagaagcaat ttctttagcg 5640
atgtttgact ctatttgatc tgaaaaaact gtttttttgt tgtctagctt ggtagcaaaa 5700
gacccataga gggcatttga cagcagctta gcaatgctgc gcatggtttg atttttgctt 5760
ttgtctgctt cctctttggc actaatgttg agctgcacat actctctggc aagacatttc 5820
cactctggaa acacggtggt tctggtatca gggatgaggg taaccttcca cccgcggttg 5880
tgcagggtaa taacatctat agaggtcgca atctccccgc gcaggggctc gttggtccag 5940
caaagcctgc ctcccttgcg tgaacaaaat gggggcagca cgtccagaaa ctcttctgcc 6000
ggtgggtcag catcaattgt gaagatgccc ggaagaaggt ccttatcaaa gtagctaata 6060
gttttgtgat ttagcatttt ttgctcataa gcctttatgg ccagcgcccg ctcatagggg 6120
tttagcggtg aaccggcggg aaaagggtgt gtaagggcac ttgcatacat gccacatatg 6180
tcatagacaa acactggctc ttgcaacact ccaatgtaag tggggtagca cctgcctcct 6240
ctgatgctaa gccttacata ctcatacatt tcattggagg gtgccatgag gatggtactt 6300
aggtggtgtg tgttaggctt ttctgcctta tacaagattt gtttaaaaat ggcatgggag 6360
ttggagctga tggttggacg ctggaagacg ttaaaggagg tttcaggtaa gtttacagag 6420
tttttaataa agatttggta ggattctatg agtttgttta ccaactgggc tgttacttga 6480
acgtcgagtg cgcagtaatc aagggtttgc tgaattatgt cgtaagcgcc ctttttttct 6540
tttatccaaa ggtctttgtt aaaggagtac tcctcctgat ccttccagta ctttaagtcc 6600
ggaaagccat cggcgtcttg ttggtaagag ccaagcatgt aaaactcatt cacagcctgg 6660
tagggacagc agcctttgga aaccgttagg ctgtatgctt tggcagcatt tttgaggctt 6720
gtgtgtgtta aagagaaagt gtcacgcacc ataaatttta tgtactggct tttcaagtca 6780
gacgccagta cttggccctg ctcccagtgc ttgtaactct tggcaggcac gtagctgggg 6840
ttaggcagag agtaagtaat atcattgaac agcaaccttc cagctcgcgg catgaagttg 6900
cggcaaattt caaacacagg tggtatttct gcccgcgtgc taaccacctg agctgctagc 6960
aatatttcat caaaccctgt gatgttgtgt cccactgcat acacctcaat aaatcttggg 7020
tttcctttga gcttaaatgt ttttaactga tctggagtaa gctcttcagg gctttctagt 7080
cccaaagtag cggcttcttc ttgaagctgg ggattttggc aaatcacgtg ggaccagagg 7140
ctggcggcaa tatgctgctg caaggtgtcc ctgaactttt tgaatttaac tcctatggct 7200
cttttttctg gagtgatgca atagtacagg gtgtcctgtt ctttaccatt ccaaatttcc 7260
cagttttgtt ctgttgcaag atttttggca acattgacca ggtggttgtc ccccagcagt 7320
tggaaaacta gcataaatgg cacaagttgc tttccaaact tgccgtgcca cgtgtacgtt 7380
tccacatcat atacaataaa cagcctctct gtgttgggcg gggccccaat gggggtgaaa 7440
gatatttttt cccaccagtc tgcgctgtgt gcggccacgt gatggaagta aaagtcccgt 7500
cttctgaggg cgcaggtgtg agtaacttta aaaaaagagc cgcagaactc acacttttgc 7560
atttgagaga tgtcttttat taggaagact ttaccttgct taactaaaaa cttgagtgga 7620
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tagcaaatta gactgtaggg tgccgcggcc tcctctatga gggcgggcag gttgtgggca 7740
gtgatgggcc tgtttaagca tgcaggtagg tcatagaggt tagtgttgca aaggttagta 7800
agcgcgctgg ccaagttgga gtgatactta atttccacac actgtccatt atccaacacg 7860
gcggaaatgc ttagtgtggc gcgctggacc accacggcgc ccttgtactt gcgcttgggt 7920
gggattacta tggtggaagt tgcacctgct cgtggtgagc tggcaaaggc ctgtgctgca 7980
tcctgagctg ggaggctagg gccactactc tcctgttgat tgattggatt tggcggttct 8040
gtgaaaagac cactggtccc gtgaccttga acctaaaaga gagttccata gagtcaacct 8100
ctgtatcatt aatggctact tgtctgagaa tttcgctcac gtccccgctg ttttcatgat 8160
aagcaatatc tgccataaac tgctccattt cctcttcctc tagctcccct agcccagccc 8220
tttccacggt ggcagccagg tctcccgaca cgcgggccat aacctggcta aaggcatttt 8280
ctcccatttc attccacacc cgactgtaga ccacctgccc ctcgtggtcc ctagcccgca 8340
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tgtggtgcag gtagttgagg gtggtggcta cgtgctcagc tacaaaaaaa tacatgaccc 8460
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gcaggaggcg gatagcttct actatagtgt ctcggacttc ttcttcaaag gaacggcgag 8640
gaggggaggc aggaggagga gaggcctctg cttcgggctc agacagctcc tcagacaccg 8700
gaggcggcgg gggagccctg cgtctgcgcc tgcgcactgg aagcctgtct ataaaccttt 8760
ctatcacctc tccccgcctg cgcctcattt cctctgtaac tgcacgtcca ttttccctgg 8820
gcctaagctc gaaggctccc ccagagagcg gggtgcaggg cgcgggtctg ggcaggctca 8880
gggcgctaat tatgcttttt gttacagatt ggctgggtaa agactgaatt gtttgaaact 8940
gtgacagctc cggatcagtg aatttttcca caaaggcatc aagccacaaa caatcacaag 9000
gtaagcttag catggtgtgc gggttgcggg ggctaactaa aaagttgaaa aaagctgtct 9060
taagcttacg gatggtggtt agaataacta ggtctttgtt gcccgcctgc tggatgcgca 9120
tgcggtctgc cagtccccat gcttcgtttt gacactggga caggtttttg taatggtctt 9180
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cctgcgccag ggtctctgca aagttttcaa agtcaatgaa cctgtggtaa gctccagtgt 9360
taatggtgta tgagcagttg gccatcaccg tccagtttag tttttgctgc aagggcaggt 9420
gtatctctgt gtactttagc ctgctgtagg acctggtgtc aaagacgtag tcattgcacg 9480
ttctcactag gtactggtag cccaccaaaa ggtggggcgg ggggtaccaa aacagtggcc 9540
agccctcggt agcgggctct cgagggctga ggttcataag catgaggcgg tggtattggt 9600
atatgtactt ggacatccat gccagcccta cagaggtggt ggaagctctg gcgtactctc 9660
gaacccggtt aaaaatgttt ctgagaggcc tgaacacctc aacggtgtat ggggtttgtc 9720
cggttaggcg ggcgcagtcc agcgcgttct gcaaaacaaa caaggagtcg atggcacttt 9780
cattcgctcc attgcagatg catccggtac tgcgacagat gaagcccctg cccgcctctg 9840
ccagcaagct agaagcagag agcgagggtt tggcccgctt acaagggggt gctgctccag 9900
agttgcaccc ccgggtgcag atgaagcaag aggcggcgga ggcttacatc cccgctagca 9960
atgtgtttag ggataatgaa ggagaagaag cagagggctt gcggcactta aagtatgagt 10020
cggggaggct gttgcgtaat gaccacactt ccaagcgggt gctgggcgag cgagactttg 10080
aaaaggaccc ccagaatggc attagcgcgg ccgaggcaca cctaaagtct gcagacttag 10140
tcacggccta tgagcatact gtgaaggcag aggttaattt tcagaccacc tttaacaaca 10200
atgtgcgtac cctcatcgcc agggaagagg tggtcattgg cctgatgcac ttgtgggact 10260
ttgtggaggc ttttctagaa aacccagtga gcaaggccct cactgcccag ctctttctta 10320
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ctgagagccg gtggctggtg gacctgttaa acctgttaca gactattgtg gtgcaagagc 10440
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tgtaccgcaa tgagcggatt gagagggcag tgtctggtgc caggcagcgg gaattaaatg 10680
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ttagaggccg tggtgccttc ccgcaaagac cctacccatg aaaaagtgct aactatagta 11100
aatgccctaa tagaaaatgg tgccattagg cgggacgagg gggcgggggt gtatgacgcc 11160
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tccctaaccg cacttaatgg ctttttggca cgcctgcccg ccaatgtgga gcggggccag 11340
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gtgtctccct ttacagacag tgttagcatt agcagggact cctacttggg ttacctgctt 11640
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tttttgctaa ccaatagaca aaaaagaatt cccaaagact actccctaac cccagaggag 11820
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gactactttt tgggggcagt gatgaatccc cgctggctcc cccctgaggg cttctttact 12060
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ctcagggaga tagatgggtt agcagacaag ctggctcggt ggaaaacata caagcgtgag 12360
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tcccctatct ccagcgatga cagtgatgat gggatgagca ggccagaccc gtttctcaag 12480
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agtgaataaa atactcacca gagacatgac gctagcgttt ttttatagca atggagtttt 12600
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ggggtgggga atttaagtcc attttacaca tgaacatgcc taatgtgaca gagtacatgt 12960
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cctatgagtg gtacacccta accattcccg agggtaacta ttctgaggtt atgcttttgg 13080
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aatctatctg ccacccaagt ccaccaaacg gagaactaaa gttaaaacag aggaaaaagt 14640
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catgttgccc gtaaccaagt ccgagggggg agacgtgaaa gtggaaaaca agggctttga 15120
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ccgaatactt gtctcccgcc ctggttcagt ttgcccaagc aaccagttct tactttaagt 17040
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tcaagagcgt gcctaactac aaactcaatg atcccacagt gcagtatgtg ctctggggaa 20160
accaagaaaa gctgtataag tttttggaaa aacactctgc ttactttcgc acccacgccg 20220
ctgcaattaa agccaggact gcttttaata aattgaaaca ataaaccgtt tattcgaaaa 20280
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ggggcaaaat ggtattttgg tacctgtgtt catcggacca gtggaactct gggaatttaa 20400
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<210> 2
<211> 31053
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APQA1701-40P nucleotide seq.
<400> 2
catcatcaat aatatacagg acaaagaggt gtggcttaaa tttgggcgtt gcaaggggcg 60
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attgaccggg agctgaactc tcaagacacg gctgagttct ttagcagtga tgaagataat 3120
ttttaggtga gtagatgggc gtggtttggg ggagtataaa aggggcgcgg tacgtggctg 3180
tgtatttaca gccatggacc ctcaacagaa ggggcttgtg aacacgtgtt ttgtgactac 3240
gcgtattccg tcttgggcag gagcaagaca gaatgtcacc gggtcagatt tagaaggaaa 3300
gcccgtgccc tcagatgtgc tggaaagtgg acgcccgctt gcagccccgc gcatcagaac 3360
tttgtatgag gagcagcagc tgaacatgct tgcagtgaat gttcttttgg atgagctgaa 3420
gatccaggtg gctgccatgc aaaactctgt gactgctatt cagcgagaag taaatgatct 3480
aaagcaacga atcgcccgag attaatgtaa aaataaaatt tatttctttt ttgaatgata 3540
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cactttagct tgaatgttaa ggtacatggg gatgagtccc tcgtcggggc tcaagtacag 3660
ccagtgcata caattgtcaa tgggctcagt attgtataca atccaatcaa agttagtatt 3720
gaggcggtgg tagttaaaaa tatccttaag caggagggaa atagcagtgg gttgtccctt 3780
agtgtagatg ttaataaacc tattaagctg ggaaggatgc accttaggac tgatgatatg 3840
catctttgct tggattttta agttggcaat gtttcctccc tggtctcgtc tgggattcat 3900
gttgtgcaag accactataa cagagtagcc tgtgcacttg ggaaacctgt ctagcagttt 3960
agagggaaag gcgtgaaaga acttggctat gcccctattg ccccctaagt cttccatgca 4020
ctcatccatt acaatagcta ttggcccttt agaagcggcc ctcgcaaaaa cattggtagg 4080
gttggtaaca tcatagttgg cctcattggt gagttctgca taagacattt gtacaaactt 4140
gggcatgatg ctgccactct gaggaaccac cgtgttttcg gggcctgcaa gaaagtttcc 4200
ctcacatatt tgggtttccc atgctgcaat ttcctgggga ggaatcatgt ccacctgggg 4260
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acactgggtt atgctatctt gaatatctag taggtcattt aacagactgt ctccccccat 4500
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catgtttgtt aggctttgct ggagagtttg caacctgtcc cagaggcttt ttaagtcatc 4620
cactgcagct ccatccaggt agtttctgtg tttcttgggt ttggatgctt gcggctgtat 4680
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cttgttaggg tggtttctgt cactgtgaaa ggttgcacgt gggcctgcac gctggtgagg 4800
gtcctgcgca ggctcatcct gctggttttg aagacgtccg agccctgctg catgtcggca 4860
tagtagcaag cttttagcac atcataagag agggtggaag tggcatgacc tttggccctg 4920
agcttgccct tgcccacgtg atggcactta gggcaggtgg tgtccttgag agcatacaac 4980
ttgggtgcca ggtacactga ttctgagctg taagcatccg atccacactt ctcacactgt 5040
gtttcacact ctactagcca agtgagctct gggttgctgg gatcaaagac tagcttgcct 5100
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gtgaagaggc tgtcagtgtc tccgtagaca gatttcagga ccctgttttc aagtggggtt 5220
cccgcgtcgt tttcgtagag aaactgagac cactctgaga caaatgcccg ggtccatgct 5280
aggacgaagg aagcaatttg tgagggatat ctgttattgg ctattagggg ggtggacttt 5340
tctaaagtat gtaaacaaaa gtcatcatcc tcagcatcaa taaacatgat tggcttataa 5400
tggtatgacg tcatgctaaa attatgcata aaaggcgctt cggcgagggg gtctttagtt 5460
ggatcttctt cgctgcaaga aggcggtgcc aactggtgaa cgtcagaatt gacaggtggg 5520
tacgctacga caaattctgg catgatttct gcacacaaat tgtctgtttc tatgtatgag 5580
gatgatttga ctacataggc accagaagca atttctttag cgatgtttga ctctatttga 5640
tctgaaaaaa ctgttttttt gttgtctagc ttggtagcaa aagacccata gagggcattt 5700
gacagcagct tagcaatgct gcgcatggtt tgatttttgc ttttgtctgc ttcctctttg 5760
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cgtgaacaaa atgggggcag cacgtccaga aactcttctg ccggtgggtc agcatcaatt 6000
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ttttctgcct tatacaagat ttgtttaaaa atggcatggg agttggagct gatggttgga 6360
cgctggaaga cgttaaagga ggtttcaggt aagtttacag agtttttaat aaagatttgg 6420
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ttaaaggagt actcctcctg atccttccag tactttaagt ccggaaagcc atcggcgtct 6600
tgttggtaag agccaagcat gtaaaactca ttcacagcct ggtagggaca gcagcctttg 6660
gaaaccgtta ggctgtatgc tttggcagca tttttgaggc ttgtgtgtgt taaagagaaa 6720
gtgtcacgca ccataaattt tatgtactgg cttttcaagt cagacgccag tacttggccc 6780
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atatcattga acagcaacct tccagctcgc ggcatgaagt tgcggcaaat ttcaaacaca 6900
ggtggtattt ctgcccgcgt gctaaccacc tgagctgcta gcaatatttc atcaaaccct 6960
gtgatgttgt gtcccactgc atacacctca ataaatcttg ggtttccttt gagcttaaat 7020
gtttttaact gatctggagt aagctcttca gggctttcta gtcccaaagt agcggcttct 7080
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gttgcacctg ctcgtggtga gctggcaaag gcctgtgctg catcctgagc tgggaggcta 7980
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ccgtgacctt gaacctaaaa gagagttcca tagagtcaac ctctgtatca ttaatggcta 8100
cttgtctgag aatttcgctc acgtccccgc tgttttcatg ataagcaata tctgccataa 8160
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ctaggtcaac ccagcgggag cagggtgggt acagcctaag gttgtggtgc aggtagttga 8400
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atgcttcgtt ttgacactgg gacaggtttt tgtaatggtc ttgcaagagc ccctctacgg 9180
gcacctgcct gtcgcctgcc atgttggtgg tgccatagcc cctaagtggc ctaataaggg 9240
ccaaatcggc cactacgcgc tctgccagga ccgcttgctg aacctgcgcc agggtctctg 9300
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gcctgctgta ggacctggtg tcaaagacgt agtcattgca cgttctcact aggtactggt 9480
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ctcgagggct gaggttcata agcatgaggc ggtggtattg gtatatgtac ttggacatcc 9600
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ccagcgcgtt ctgcaaaaca aacaaggagt cgatggcact ttcattcgct ccattgcaga 9780
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ccagggaaga ggtggtcatt ggcctgatgc acttgtggga ctttgtggag gcttttctag 10260
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gctttgtgcc agtcatgcaa gaggatggcc agtacactta caaaacccgc ttccagcttg 17160
cggtgggaga caacagggtg ctggacatgg ccagtactta cttcgatatc aggggtaccc 17220
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aggccggggc taacaactgt ctttttaatg gacagggtgc caatattaac actttagccc 17340
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3635 3640 3645
Ala Gly Asp Val Arg Glu Ala Val Ala Gln Gln Val Arg Ile Ala Thr
3650 3655 3660
Gly Asn Leu Gly Ser Leu Thr Ala Leu Asn Gly Phe Leu Ala Arg Leu
3665 3670 3675 3680
Pro Ala Asn Val Glu Arg Gly Gln Glu Asn Tyr Thr Gly Phe Val Ser
3685 3690 3695
Ala Leu Lys Leu Leu Val Ser Glu Val Pro Ser Thr Glu Val Tyr Gln
3700 3705 3710
Ser Gly Pro His Tyr Phe Leu Gln Ser Ser Arg Asn Gly Thr Gln Thr
3715 3720 3725
Val Asn Leu Thr Asn Ala Phe Glu Asn Leu Lys Pro Leu Trp Gly Val
3730 3735 3740
Lys Ala Pro Thr Met Glu Arg Leu Ser Ile Ser Ala Leu Leu Thr Pro
3745 3750 3755 3760
Asn Thr Arg Leu Leu Leu Leu Leu Val Ser Pro Phe Thr Asp Ser Val
3765 3770 3775
Ser Ile Ser Arg Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Leu Leu Thr Leu Tyr Arg
3780 3785 3790
Glu Ala Leu Gly Arg Asn His Leu Asp Glu Arg Thr Leu Glu Glu Val
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Thr Glu Val Ser Arg Ala Met Gly Ser Glu Asn Ile Asn Asn Leu Gln
3810 3815 3820
Ala Thr Leu Asn Phe Leu Leu Thr Asn Arg Gln Lys Arg Ile Pro Lys
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Asp Tyr Ser Leu Thr Pro Glu Glu Glu Arg Ile Val Arg Phe Val Gln
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Gln Ala Val Ser Leu Arg Met Met Gln Glu Asn Leu Ser Pro Thr Glu
3860 3865 3870
Ala Leu Asp Val Thr Ala Ala Asn Met Glu Pro Ser Phe Tyr Ala Ser
3875 3880 3885
Asn Arg Asp Phe Ile Asn Lys Leu Met Asp Tyr Phe His Arg Ala Ala
3890 3895 3900
Ala Met Ala Pro Asp Tyr Phe Leu Gly Ala Val Met Asn Pro Arg Trp
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Leu Pro Pro Glu Gly Phe Phe Thr Gly Val Phe Asp Phe Pro Glu Arg
3925 3930 3935
Asp Ser Tyr Thr Trp Asp Gly Leu Asp Ser Ser Leu Glu Leu Thr Arg
3940 3945 3950
Gln Asp Ala Met Arg Phe Leu Glu Asp Lys Phe Met Asp Asp Asp Gln
3955 3960 3965
Arg Thr Glu Ser Arg Ser Leu Ser Arg Val Thr Thr Pro Ala Ser Ser
3970 3975 3980
Arg Arg Ser Ser Val Thr Met Pro Pro Gly Gly Phe Met Gly Met Ile
3985 3990 3995 4000
Asn Asn Asn Lys Asn Asp Asn Ser Leu Arg Glu Ile Asp Gly Leu Ala
4005 4010 4015
Asp Lys Leu Ala Arg Trp Lys Thr Tyr Lys Arg Glu Ser Glu Glu Ala
4020 4025 4030
Arg Val Ser Leu Pro Ala Val Val Arg Pro Lys Gln Tyr Arg Pro Arg
4035 4040 4045
Ser Pro Ile Ser Ser Asp Asp Ser Asp Asp Gly Met Ser Arg Pro Asp
4050 4055 4060
Pro Phe Leu Lys Phe Glu Gly Ser Gly Asn Pro Phe Ala His Leu Arg
4065 4070 4075 4080
Pro Lys Leu Gly Arg Gly Leu Met Glu Phe Ser Ser Ser Pro Pro Pro
4085 4090 4095
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4100 4105 4110
Val Pro Pro Arg Tyr Lys Gly Ala Thr Glu Gly Arg Asn Ser Ile Arg
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Asp Asn Lys Ser Ser Asp Ile Gln Ala Leu Asn Tyr Gln Asn Asp His
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4245 4250 4255
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4260 4265 4270
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Pro Tyr Val Tyr Lys Ser Leu Gly Val Val Val Pro Arg Ala Leu Ser
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4645 4650 4655
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Thr Glu Leu Ser Lys Trp Leu Asn Thr Ser Asp Pro Glu Ala Leu Glu
7265 7270 7275 7280
Lys Gln Arg Lys Thr Val Met Gly Ser Val Leu Val Thr Val Val Leu
7285 7290 7295
Glu Cys Met Gln Arg Leu Phe Thr Ser Glu Glu Met Val Lys Lys Ile
7300 7305 7310
Gly Glu Ala Leu His Tyr Thr Phe Arg His Gly Tyr Val Ser Leu Ala
7315 7320 7325
Cys Lys Ile Ser Asn Val Glu Leu Thr Asn Val Val Thr Tyr Met Gly
7330 7335 7340
Ile Leu His Glu Asn Arg Leu Gly Gln Thr Thr Leu His His Thr Val
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Gln Gly Glu Ala Arg Arg Asp Tyr Ile Arg Asp Ser Ile Phe Leu Ile
7365 7370 7375
Leu Ile His Ala Trp Gln Thr Ala Met Gly Ile Trp Gln Gln Cys Leu
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Glu Glu Glu Asn Leu Lys Glu Leu Ala Lys Leu Leu Gln Arg Ile Lys
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Lys Pro Leu Tyr Thr Glu Thr Ser Gln Arg Leu Met Gly Lys Leu Leu
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Ala Asn Val Val Phe Pro Pro Lys Leu Leu Gln Thr Phe His Lys Gly
7425 7430 7435 7440
Leu Pro Asp Ile Val Ser Gln Ser Met Met Gln Asn Phe Arg Ser Phe
7445 7450 7455
Ile Leu Glu Arg Ser Gly Ile Leu Pro Ser Met Thr Cys Ala Leu Pro
7460 7465 7470
Thr Asp Phe Val Pro Ile His Phe Lys Glu Cys Pro Pro Thr Met Trp
7475 7480 7485
Pro Tyr Thr Tyr Leu Leu Lys Leu Ala Asn Phe Phe Met Tyr His Asn
7490 7495 7500
Asp Leu Cys Tyr Asp Val Gly Gly Glu Gly Leu Leu Glu His Tyr Cys
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Arg Cys Asn Leu Cys Thr Pro His Arg Cys Leu Ala Thr Asn Pro Ala
7525 7530 7535
Met Leu Asn Glu Thr Gln Leu Ile Gly Thr Phe Asp Ile Arg Gly Pro
7540 7545 7550
Gly Gly Glu Asn Gly Ala Glu Ser Ser Ser Gly Leu Lys Leu Thr Ala
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Gly Met Trp Thr Ser Ala Phe Leu Arg Lys Phe Glu Ser Ser Asp Tyr
7570 7575 7580
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7605 7610 7615
Leu His Asp Ile Lys Lys Ala Arg Glu Glu Phe Leu Leu Lys Ser Gly
7620 7625 7630
Gln Gly Gln Tyr Leu Asp Pro Gln Thr Gly Glu Pro Leu Asn Ala Ala
7635 7640 7645
Asp Pro Ser Val Glu Ser Ser His Glu Phe Gln Gly Asp Gly Arg His
7650 7655 7660
Arg Asn Pro Lys Arg Gly Arg Asn Phe Arg Gln Arg Gly Gly Pro Arg
7665 7670 7675 7680
Lys Pro Pro Arg Val His Ala Gly Ala Glu Arg Asp Ala Arg Gly Thr
7685 7690 7695
Ser Ser Met Ser Ser Lys Glu Met Glu Asp Thr Glu Thr Leu Ser Val
7700 7705 7710
Glu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Glu Asp Leu Glu Ser Leu Pro Glu Ser
7715 7720 7725
Met Pro Glu Gln Ser Glu Met Pro Glu Glu Arg Ala Pro Arg Trp Asp
7730 7735 7740
Gln Lys Glu Lys Pro Leu Ala Lys Gln Lys Leu Lys Arg Arg Pro Thr
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Pro Leu Lys Ser Pro Lys Pro Ala Ala Gly Glu Asp Asn His Gln Thr
7765 7770 7775
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7845 7850 7855
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Asn Ser Val Asp Gly Tyr Asp Met Ala Met Thr Lys Glu Ser Met Asp
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Phe Lys Lys Leu Lys Lys Gly Leu Phe Arg Val Thr Cys Arg Ala Lys
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Ser Ile Met Phe Phe Ile Val Ala Met Leu Ala Thr Leu Ser Leu Leu
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Asn Gly Lys Leu Leu Gly Glu Thr Thr Leu Ser Phe Lys His Ile Arg
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Lys Leu Ala Arg Thr His Lys Trp Lys Tyr Gln Ser Trp Glu Glu Gly
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Met Lys Arg Thr Arg Arg Ala Leu Pro Ala Asn Tyr Asp Pro Val Tyr
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Ser Pro Pro Leu Thr Phe Ser Thr Leu Gly Ala Ile Lys Leu Ser Thr
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Gly Pro Gly Leu Thr Leu Asn Glu Gly Lys Leu Gln Ala Ser Leu Gly
8805 8810 8815
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Asn Lys Val Leu Ser Phe Thr Ser Pro Leu His Lys Thr Glu Asn Thr
8835 8840 8845
Val Ser Leu Ala Leu Gly Asp Gly Leu Glu Asp Glu Asn Gly Thr Leu
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Lys Val Thr Phe Pro Thr Pro Pro Pro Pro Leu Gln Phe Ser Pro Pro
8865 8870 8875 8880
Leu Thr Glu Thr Gly Gly Thr Ile Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ser Met
8885 8890 8895
Gln Val Thr Asn Gly Lys Leu Gly Val Lys Pro Thr Thr Tyr Ala Pro
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Pro Leu Lys Lys Thr Asp Gln Gln Val Ser Leu Gln Val Gly Ser Gly
8915 8920 8925
Leu Thr Val Ile Asn Glu Gln Leu Gln Ala Val Gln Pro Pro Ala Thr
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Asn Asp Asn His Val Ala Leu Ser Ala Gly Ser Gly Leu Arg Ile Ser
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Asn Asn Thr Val Gln Pro Arg Pro Ser His Thr Trp Lys Leu Cys Met
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Gly Leu Asp Ser Ile Ala Val Asp Gly Ala Pro Ser Arg Ser Ile Asp
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Cys Met Leu Ile Ile Asn Lys Pro Lys Gly Val Ala Thr Tyr Thr Leu
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Thr Phe Arg Phe Leu Asn Phe Asn Arg Leu Ser Gly Gly Thr Leu Phe
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Cys Val Lys Gly Ile Ile His Phe Glu Glu Asp Phe Val Arg Glu Leu
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Lys Asn Lys Pro Gly Ile Thr Phe Lys Val Val Phe Tyr Ser Gln Leu
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Lys Glu Ile Ser Asp Val Val Asn Asn His Pro Asn Val Asn Asn Ala
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Asp Ser Phe Phe Lys Asp Phe Gly Ile Thr His Gly His Asp Phe Thr
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Thr Ala Glu Leu Ala Leu Phe Thr Val Lys Cys Val Ser Gly Met Leu
9860 9865 9870
Ser Gly Val Leu Leu Phe Cys Arg Met Ala Ser Gly Ala Ala Tyr Phe
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Ala Leu Gly Val Ser Met Gly Ala Cys Phe Cys Leu Arg Leu His Lys
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Gly Ser Val Ala Asp Ile Gln Ala Thr Ala Val Ser Leu Gln Glu Ala
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Glu
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<213> Artificial Sequence
<220>
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100 105 110
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Glu Gln Gly Ser Ala Glu Glu Glu Glu Cys Glu Glu Ala Leu Leu Ala
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Gly Asp Ser Asp Asp Pro Leu Phe Gly ***
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<210> 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APQA1701_40P_E1B19K
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Ile Arg Gly Ser Thr Leu Ser Pro Gly Phe Phe Arg Arg Trp Cys Phe
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Pro Ala Leu Ala Asp Val Val Gly Asn Ile Val Glu Gln Glu Glu Gly
35 40 45
Arg Phe Trp Gln Ile Leu Pro Glu Asn His Thr Phe Trp Gly Leu Leu
50 55 60
Arg Arg Gly Phe Thr Val Ala Ser Phe Thr Glu Ile Ile Thr Ala Ala
65 70 75 80
Gln Leu Glu Asn Arg Gly Arg Gln Leu Ala Phe Leu Ala Phe Ile Ser
85 90 95
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100 105 110
Arg Leu Asp Leu Val Cys Ala Pro Ala Trp Ser Gln Thr Ala Arg Leu
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130 135 140
Glu Glu Glu Cys Glu Glu Ala Leu Leu Ala Gly Asp Ser Asp Asp Pro
145 150 155 160
Leu Phe Gly ***
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Met Ala Met Thr Lys Glu Ser Met Asp Gln Val Glu Val Asn Cys Leu
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Gly Phe Asp Ile Pro Asp Ser Tyr Gln Glu Gly His Gly Val Asp Ile
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100 105 110
Cys Ser Met Tyr Asn Leu Asn ***
115 120
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> APQA1701_40P_E3_12.5K
<400> 7
Met Ala Met Thr Lys Glu Ser Met Asp Gln Val Glu Val Asn Cys Leu
1 5 10 15
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Glu Gly Leu Cys Ala Asn Trp Phe Tyr Asn Pro Ala Leu Ala Phe Glu
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65 70 75 80
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Cys Ile Cys Asn Lys Pro Arg Pro His Met Ser Leu Ile Glu Ala Ala
100 105 110
Cys Ser Met Tyr Asn Leu Asn ***
115 120
Claims (10)
- 0.05% 포르말린으로 불활화된, 수탁번호 KCTC13956BP로 수탁된 신규한 개 아데노바이러스 2형(Canine Adenovirus Type 2) 균주 또는 이로부터 유래된 항원; 및 애주번트로서 Carbopol® 974P NF polymer 또는 MontanideTM Gel 01을 유효성분으로 포함하는, 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 개 아데노바이러스 2형 균주는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 균주인 것을 특징으로 하는,
개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 개 아데노바이러스 2형 균주의 E1b 19K 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지고; E3 12.5K 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는,
개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물.
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- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방 방법.
- 다음 단계를 포함하는, 개 아데노바이러스 2형 백신 또는 백신 후보 물질의 면역원성 검정 방법:
(a) 개 아데노바이러스 2형 백신 또는 백신 후보 물질을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계;
(b) 상기 백신 또는 백신 후보 물질이 투여된 인간을 제외한 동물에게 수탁번호 KCTC13956BP로 수탁된 신규한 개 아데노바이러스 2형(Canine Adenovirus Type 2) 균주 또는 이로부터 유래된 항원을 공격 접종하는 단계; 및
(c) 상기 공격 접종한 인간을 제외한 동물의 증상을 조사하는 단계.
- 제8항에 있어서,
상기 인간을 제외한 동물은 2개월 령 내지 4개월 령의 개인 것을 특징으로 하는,
개 아데노바이러스 2형 백신 또는 백신후보물질의 면역원성 검정 방법.
- 0.05% 포르말린으로 불활화된, 수탁번호 KCTC13956BP로 수탁된 신규한 개 아데노바이러스 2형(Canine Adenovirus Type 2) 균주 또는 이로부터 유래된 항원; 및 애주번트로서 Carbopol® 974P NF polymer 또는 MontanideTM Gel 01을 유효성분으로 포함하는, 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 사료 첨가제.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020190154752A KR102390674B1 (ko) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190154752A KR102390674B1 (ko) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물 |
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| KR20210065700A KR20210065700A (ko) | 2021-06-04 |
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ID=76391787
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| KR1020190154752A KR102390674B1 (ko) | 2019-11-27 | 2019-11-27 | 개 아데노바이러스 2형 감염증 예방용 백신 조성물 |
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-
2019
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Non-Patent Citations (2)
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| 비특허문헌 1 |
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