CN112941040B - 斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种对虾E3泛素连接酶TRIM50‑like蛋白及其编码的基因。本发明还公开了含有上述基因的表达载体、重组蛋白以及与对虾E3泛素连接酶TRIM50‑like蛋白特异性结合的抗体。本发明还进一步公开了上述蛋白或重组蛋白在制备对虾抗病毒药物或增强虾类免疫力药物方面的应用，以及作为体外泛素化检测的标准E3泛素连接酶、构建体外泛素化检测体系或者试剂盒以及用于鉴定和筛选斑节对虾体内参与抗病毒过程的E1泛素酶或E2泛素酶方面的用途。

Description

斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白以及该蛋白在对虾抗病毒感染和体外泛素化检测中的应用。
背景技术
蛋白质翻译后修饰，如磷酸化、乙酰化和泛素化，是一个重要的生物过程，调控许多细胞内信号。泛素化是一种能调节DNA修复、分化和免疫应答等细胞过程的翻译后修饰方式之一。泛素化是将一种高度保守的76个氨基酸分子，泛素分子，以共价方式连接到到底物蛋白上。泛素化的过程需要三种酶，E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶来分别完成活化、结合和连接。TRIM蛋白家族(tripartite motif family proteins)是一类E3泛素连接酶，它们在调节先天免疫信号通路中发挥重要的作用。在人体中，超过一半的TRIM蛋白具有抗病毒作用。TRIM蛋白主要通过以下三种方式来发挥抗病毒作用：(1)直接和病毒组分，例如病毒囊膜蛋白或病毒基因组DNA结合；(2)调节细胞炎症因子、干扰素等的表达来发挥抗病毒作用；(3)调节其他重要的细胞内在防御途径，如细胞自噬，来发挥抗病毒作用。
斑节对虾是世界三大养殖虾类之一，具有重要的经济价值。然而，随着集约化养殖的快速发展和海洋生态环境的严重污染，疾病的爆发对对虾养殖业构成了严重威胁，这严重地限制了对虾养殖的健康发展。对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是虾类中毒性最强的病原体之一，给对虾养殖产业造成了巨大的经济损失。至今，白斑综合征病毒仍是对虾养殖业的头号威胁。
对虾自身先天免疫系统对于抵御病菌感染发挥重要的作用，在受到病毒侵染时，对虾会启动自身的某些抗病毒机制，产生抗病毒因子，对抗病毒的入侵。因此，了解对虾抵御病毒入侵的分子免疫机制对于如何防治病毒感染具有重要意义。虽然过去对对虾感染WSSV的免疫应答和抵抗WSSV感染的分子机制的研究已经取得了很大进展。但是目前对于WSSV病害的爆发尚无有效的防治措施和治疗方法。寻找对虾自身的抗病毒效应因子并且加以利用使抗病毒药物研发的重要手段之一。从对虾自身免疫系统出发，找到对虾体内具有高效抗病毒作用的关键因子，并了解其调节抗病毒的分子免疫机制对于控制WSSV的爆发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白及其编码的基因。
本发明的目的还在于提供上述含有上述斑节对虾TRIM50-like基因的表达载体、重组蛋白以及与斑节对虾TRIM50-like蛋白特异性结合的抗体。
本发明的最后一个目的在于提供上述斑节对虾TRIM50-like蛋白或重组TRIM50-like蛋白在制备对虾抗病毒药物或增强虾类免疫力药物方面的应用，以及作为体外泛素化检测的标准E3泛素连接酶、构建体外泛素化检测体系或者试剂盒以及用于鉴定和筛选斑节对虾体内参与抗病毒过程的E1泛素酶或E2泛素酶方面的用途。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了编码所述蛋白的基因，所述基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。
申请人通过对斑节对虾的研究发现，其体内存在一种活性蛋白(TRIM50-like蛋白)，能直接和WSSV病毒组分结合，并能将病毒组分泛素化，显著抑制对虾体内WSSV的复制，提高对虾感染WSSV后的存活率。且经过比对，其基因序列及编码的蛋白在虾蟹等动物抗病毒感染或治疗中的应用未见报道。
本发明所述斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白还可以通过提取斑节对虾的总RNA，逆转录成cDNA，根据本发明提供SEQ ID NO.2(TRIM50-like开放阅读框序列)设计PCR引物，利用基因克隆的常规方法获得核酸序列，然后利用基因工程手段进行原核或者真核重组表达系统获得蛋白，见实施例1。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种表达载体，含有上述基因。
本发明还提供了一种重组蛋白，包括用上述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组蛋白的步骤的方法制备。
本发明还提供了一种与斑节对虾TRIM50-like蛋白特异性结合的抗体，采用上述重组蛋白经动物免疫后制取所得。
本发明提供的与上述斑节对虾TRIM50-like蛋白特异性结合的抗体为重组TRIM50-like蛋白经动物免疫后制取所得，见实施例2。该抗体可以用来检测斑节对虾体内的内源性TRIM50-like蛋白，或者分离纯化斑节对虾体内TRIM50-like蛋白。
本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：上述蛋白或上述重组蛋白在制备具有对虾抗病毒效果的药物或具有增强虾类免疫力效果的药物方面的用途以及作为体外泛素化检测的标准E3泛素连接酶，构建体外泛素化检测体系或者试剂盒以及用于鉴定和筛选斑节对虾体内参与抗病毒过程的E1泛素酶或E2泛素酶方面的用途。
优选的，所述病毒为对虾白斑综合症病毒。
利用基因工程的手段将本发明所述的斑节对虾TRIM50-like蛋白在原核系统中表达，并进一步亲和纯化后制备的具有生物活性的纯化蛋白产物进行体外蛋白互作和泛素化检测表明：本发明所述的具有抗病毒功能的斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白能靶向识别、结合WSSV病毒囊膜蛋白VP24、VP26和VP28，并对上述蛋白进行泛素化标记，见实施例3。说明本发明提供的具有抗病毒功能的斑节对虾TRIM50-like蛋白有望开发成为新型抗病毒药物，同时根据其具有的E3泛素连接酶活性，可以用来作为标准E3泛素连接酶来鉴定和筛选斑节对虾体内参与抗病毒过程的E1，E2等泛素酶，或者以E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白为基准构建体外泛素化检测试剂盒。
优选的，本发明所述药物通过体内注射法、口服或外用的方式给药，药物剂型为体内注射剂型、体内过表达剂型、微囊化控释剂型、饲料添加剂或利用药用载体制成体内或体外制剂。
进一步的，本发明所述具有抗病毒功能的斑节对虾TRIM50-like蛋白应用的方法途径优选是：
(1)将该蛋白体内注射、外用、口服、与添加剂共同投喂或者利用药物载体制备成体内或者体外给药的制剂；
(2)以该蛋白作为体外泛素化检测的标准E3泛素连接酶，构建体外泛素化检测体系或者试剂盒，用于筛选斑节对虾体内的E1或者E2等泛素相关酶类。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明提供的具有抗病毒功能的斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白cDNA的用途，提供一种含有上述具有抗病毒功能的对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白cDNA的表达载体。该载体能作为模板体外逆转录合成TRIM50-like蛋白的过表达mRNA，上述过表达mRNA在对虾体内能显著抑制WSSV的复制，提高对虾感染WSSV后的存活率，可以开发成新型抗病毒药物。
作为本发明的另外一种优选的实施方式，基于编码斑节对虾TRIM50-like蛋白的cDNA，利用分子生物技术手段合成能特异性干扰本发明所述的具有抗病毒功能的斑节对虾TRIM50-like蛋白基因的小干扰RNA和能在对虾体内过表达本发明所述的具有抗病毒功能的斑节对虾TRIM50-like蛋白的mRNA。通过实施的动物体内注射实验表明：干扰本发明所述的斑节对虾TRIM50-like蛋白促进WSSV繁殖，降低WSSV感染后对虾存活率；过表达本发明所述的斑节对虾TRIM50-like蛋白则能显著抑制WSSV繁殖，提高WSSV感染后对虾存活率(见实施例4)。这说明本发明所述的斑节对虾TRIM50-like蛋白在对虾体内能有效抑制病毒复制，提高感染病毒后对虾的存活率。基于本发明所述的TRIM50-like蛋白的基因序列设计的TRIM50-like过表达mRNA有望开发应用于治疗和预防对虾WSSV病毒感染的药物制剂。
本发明所述具有抗病毒功能的斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白的过表达mRNA的应用途径优选是：将过表达mRNA体内注射或者口服给药。
本发明具有以下优点：
(1)本发明所述斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白是从斑节对虾中克隆、鉴定获得，NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、百度学术(https://xueshu.baidu.com/)等学术性网站检索结果表明，该蛋白尚未在其它物种中被报道；
(2)鉴于本发明所述的蛋白具有直接拮抗和泛素化WSSV病毒组分的活力，同时可以降低斑节对虾体内WSSV的复制量，提高对虾感染WSSV后的存活率等功能，有望开发应用于治疗和预防对虾WSSV病害的爆发；
(3)本发明所述蛋白或重组蛋白可以进一步的在制备具有对虾抗病毒效果药物或具有增强虾类免疫力效果的药物方面的应用以及作为体外泛素化检测的标准E3泛素连接酶，构建体外泛素化检测体系或者试剂盒以及用于鉴定和筛选斑节对虾体内参与抗病毒过程的E1泛素酶或E2泛素酶方面的应用。
附图说明
图1本发明实施例1中斑节对虾TRIM50-like蛋白的原核重组表达与纯化；
图2本发明实施例3中斑节对虾TRIM50-like蛋白与WSSV病毒囊膜蛋白相相互作用和体外泛素化分析；
图3本发明实施例2和实施例4中斑节对虾TRIM50-like蛋白在斑节对虾体内抑制WSSV病毒复制，提高斑节对虾感染WSSV病毒后的存活率。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白的获得
(1)总RNA的提取
取鲜活健康斑节对虾肠道组织50mg，按照Qiagen Mini试剂盒使用说明提取总RNA，并使用DNase消化除去基因组。
(2)全长cDNA模板的制备
按照PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)说明书制备全长cDNA模板，取1μg总RNA加入1μL Oligo dT Primer(50μM)，1μL dNTP Mixture(10mMeach)，加RNase free ddH2O补齐至10μL。混匀上述溶液，短暂离心，用PCR仪进行65℃，5min恒温后，迅速取出，冰上冷却，使模板RNA变性。依次加入以下列试剂：4μL5×PrimeScriptII Buffer，0.5μL Inhibitor(40U/μL)，1μL PrimeScript II RTase(200U/μL)和RNasefree ddH2O。进行如下反应程序：30℃10min，42℃15min，95℃ 5min，4℃冷却。
(3)斑节对虾TRIM50-like蛋白开放阅读框cDNA的克隆与其编码蛋白的体外重组表达
根据本发明提供的斑节对虾TRIM50-like基因序列设计引物扩增开放阅读框，扩增引物如下所示：
ExF：TACTCAGAATTCATGCTGCCTGAGTGCGGTC
ExR：TACTCACTCGAGTCAATTCGTCGCAAAGTCGC。
利用设计的引物PCR扩增带有EcoRΙ和XhoΙ酶切位点的开放阅读框，将胶回收后的PCR产物与已经准备好的pET32a载体分别双酶切。分别将载体和PCR产物双酶切后进行跑胶回收。将胶回收的PCR产物和pET32a载体进行连接，然后转化DH5a宿主菌，进行测序验证。对测序验证正确的菌株提取质粒，转化表达菌株BL21(DE3)，挑单克隆至对数期，加入终浓度为0.6mM的IPTG在28℃诱导表达12h。所获重组表达蛋白用His-bind Purification Kit(Beyotime,Shanghai,China)试剂盒进行纯化，纯化的重组TRIM50-like蛋白进一步用6×His标签抗体进行免疫印迹验证。利用常规Ni柱亲和层析，本发明的蛋白进行分离纯化可得到纯度为90％以上的活性蛋白(见图1，箭头所示)，即为纯化的TRIM50-like重组蛋白。
图1为重组的斑节对虾TRIM50-like蛋白的表达和纯化；其中M为蛋白marker；泳道1为经IPTG诱导后来自大肠杆菌的总蛋白；泳道2为未经IPTG诱导的来自大肠杆菌的总蛋白；泳道3为通过蛋白质印迹(wester-blot)验证纯化后的重组蛋白。
本实施例1中获得的斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，即斑节对虾TRIM50-like开放阅读框编码的氨基酸序列。
具体信息为：
(a)序列特征
＊长度：414氨基酸；
＊类型：氨基酸；
＊链型：单链；
(b)分子类型：蛋白质；
(c)序列描述：SEQ ID NO.1。
Figure BDA0002914803080000061
Figure BDA0002914803080000071
斑节对虾TRIM50-like开放阅读框的核苷酸序列特征和推导的氨基酸特征；灰色区域为RING功能域；B-Box功能域用加粗下划线表示；亲环素超家族结构域用波浪线标记。
编码上述蛋白的基因(cDNA)，它具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(斑节对虾TRIM50-like开放阅读框)，具体信息为：
(a)序列特征
＊长度：1245碱基
＊类型：碱基
＊链型：单链
(b)分子类型：核酸
(c)序列描述：SEQ ID NO.2。
实施例2TRIM50-like蛋白多克隆抗体制备
将上述纯化的TRIM50-like重组蛋白(约100-200μg)与3mL完全弗氏佐剂充分混匀孵化，在小鼠皮下多点注射，共注射8只小鼠，每只小鼠约注射50μg蛋白。第一次注射3周后加强免疫3次。加强注射剂量为10-20μg蛋白，使用不完全弗氏佐剂进行乳化。每次注射间隔10天。第4次注射后将小鼠摘除眼球取血，将鼠血于37℃静置1h后，4000rpm离心10min，吸取上层多抗血清，分装保存于-80℃。
如图3所示，上述制备的斑节对虾TRIM50-like蛋白多克隆抗体可以特异性结合斑节对虾内源性TRIM50-like蛋白，取三只健康虾的不同组织利用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测TRIM50-like的mRNA和蛋白在不同组织中的表达分布情况，如图3中A图所示，TRIM50-like的mRNA分布在所取的各个组织，其中在肠道和血液消化器官中表达丰富(图3中A图上半部分)，蛋白免疫印迹结果也显示TRIM50-like蛋白在肠道和血细胞中有高的表达(图3中A图下半部分)。
实施例3斑节对虾TRIM50-like蛋白与WSSV囊膜蛋白相互作用和体外泛素化测定
(1)斑节对虾TRIM50-like蛋白与WSSV囊膜蛋白相互作用
首先利用原核表达菌株表达纯化带GST标签的WSSV囊膜蛋白VP19(GenBankaccession No.DQ681071.1)、VP24(GenBank accession No.DQ196431.1)、VP26(GenBankaccession No.AY220746.1)和VP28(GenBank accession No.DQ681069.1)(图2中A-D图)。原核表达具体实施方法如“实施例1(3)”所述，原核表达引物分别如下所示：
VP19：
rVP19-F GAATTCATGGCCACCACGACTAACAC
rVP19-R CTCGAGTTAATCCCTGGTCCTGTTCTTAT
VP24：
rVP24-F GAATTCATGCACATGTGGGGGGTTTA
rVP24-R CTCGAGTTATTTTTCCCCAACCTTAA
VP26：
rVP26-F GGATCCACACGTGTTGGAAGAAGCGT
rVP26-R GAATTCTTACTTCTTCTTGATTTCGTCCTTG
VP28：
rVP28-F GAATTCATGGATCTTTCTTTCACTCTTTCGG
rVP28-R CTCGAGTTACTCGGTCTCAGTGCCAGAGTAG。
His-pulldown：取200μL Ni-NTA磁珠加到EP管中，用800μL洗涤液(20nMImidazole,50mM Tris-Hcl,PH 8.0)润洗一次，加入200μg重组斑节对虾TRIM50-like蛋白到EP管中，4℃条件下共孵育6小时；然后分别加入重组VP19、VP24、VP26或者VP28，4℃共孵育过夜。用1mL洗涤液(20nM Imidazole,50mM Tris-Hcl,PH 8.0)洗涤三次后加入200μL洗脱液(250nM Imidazole,50mM Tris-Hcl,PH 8.0)洗脱。洗脱液通过常规SDS-PAGE电泳分析后，用anti-GST抗体进行免疫印迹检测。
GST-pulldown：取200μLGST-Beads(Immobilized Glutathione)到EP管中，PBS+1％Triton-100润洗一次，加入重组VP19、VP24、VP26或者VP28到EP管中，4℃共孵育6小时；然后加入重组TRIM50-like蛋白，4℃共孵育过夜。TBS洗涤三次后用200μL洗脱液(10mMreduced glutathione and 50mM Tris-HCl,pH 8.0)洗脱。洗脱液通过常规SDS-PAGE电泳分析后，用anti-His抗体进行免疫印迹检测。
(2)斑节对虾TRIM50-like蛋白与WSSV囊膜蛋白体外泛素化测定
按照一下体系配置反应液：8μL5×ubiquitination buffer(100mM Tris-HCl,pH7.5,25mM MgCl2,2.5mM DTT,10mM ATP),250ng of ubiquitination E1(E-305,BostonBiochem,Inc),500ng of ubiquitination E2(E2-656,Boston Biochem,Inc),500ng ofubiquitin(U-110,Boston Biochem,Inc),500ng of TRIM50-like蛋白,250ng of VP19，VP24，VP26 or VP28蛋白，加入灭菌去离子水补齐至40μl。37℃摇床孵育3小时后分别加入蛋白上样缓冲液煮沸10分钟。然后分别用抗泛素抗体和抗-GST抗体进行免疫印迹检测。
结果显示，斑节对虾TRIM50-like蛋白能和WSSV病毒囊膜蛋白VP24、VP26和VP28结合(图2中E图和F图)，并且通过其E3泛素连接酶活性将VP24、VP26和VP28进行泛素化标记(图2中G图)。斑节对虾TRIM50-like蛋白既不能靶向结合VP19，也不能对其进行泛素化标记。
实施例4斑节对虾TRIM50-like蛋白在对虾体内的抗病毒效果
本实施例选取对虾的重要致病病毒，白斑综合症病毒(white spot syndromevirus,WSSV)进行抗病毒效果研究。此病毒为双链DNA病毒，可以感染多种甲壳类动物，是海水养殖动物的重要致病病毒，目前还无特效药物进行防治。健康的斑节对虾(15±2g/只)，饲养于500L的水桶中。随机取三只对虾提取肌肉组织的基因组，PCR方法检测确定无WSSV病毒感染，饲养3天使其适应环境后开始实验。
(1)将对虾按每组30只分组，分别注射WSSV病毒(105拷贝数)和PBS，然后取注射后不同时间点的对虾肠道和血细胞，从基因和蛋白水平检测TRIM50-like表达情况。结果如图3中B图和C图所示，WSSV病毒感染后，斑节对虾肠道和血细胞中的TRIM50-like基因的转录水平(图3中B和C图的上半部分)和蛋白水平表达量都显著升高(图3中B和C图的下半部分)，说明斑节对虾TRIM50-like参与了WSSV感染过程。
(2)参照Takara公司的Transcription T7 Kit的说明书体外合成TRIM50-like基因的干扰RNA-dsTRIM50-like。按照Invitrogen公司的mMESSAGEm
Figure BDA0002914803080000091
T7Transcription Kit的说明书，构建含有TRIM50-like蛋白的cDNA的表达载体，体外转录合成具有成熟结构的斑节对虾TRIM50-like的mRNA(具有帽子结构和polyA尾)。
将斑节对虾按每组30只分组，分别注射50μg dsTRIM50-like+病毒(105拷贝数)、50μg dsGFP+病毒(105拷贝数)作为对照、100μg TRIM50-like mRNA+病毒(105拷贝数)、100μg Trx-His mRNA+病毒(105拷贝数)作为对照。取感染WSSV病毒后不同时间点的对虾肠道和血细胞组织，从转录水平(图3中D和E图的上半部分)和蛋白水平(图3中D和E图的下半部分)检测病毒的囊膜蛋白VP28的表达量。每隔12小时统计干扰组中对虾的存活数(图3中G图)。
由图3中D图和E图可见，与dsGFP对照组相比，注射本发明所述斑节对虾TRIM50-like蛋白的干扰RNA-dsTRIM50-like后，无论是在基因转录水平还是蛋白水平，VP28在肠道和血细胞中的表达量都显著升高，WSSV拷贝数会显著增加(图3中F图)。另外注射dsTRIM50-like后斑节对虾感染WSSV后的存活率显著下降(图3中G图)。说明当对虾体内TRIM50-like减少后，WSSV复制会增强，从而降低对虾存活率。与Trx-His mRNA对照组相比，通过注射本发明所述体外合成的斑节对虾TRIM50-like的成熟mRNA后实现TRIM50-like的过表达后，无论是在基因转录水平(图3中H和I图的上半部分)还是蛋白水平(图3中H和I图的下半部分)，VP28在肠道和血细胞中的表达量都显著降低，WSSV拷贝数显著减少(图3中K图)。表明TRIM50-like当在对虾体内TRIM50增多后，WSSV复制会被抑制。以上结果说明TRIM50-like在斑节对虾体内能有效抑制WSSV病毒的复制。
实施例5斑节对虾TRIM50-like蛋白用于抗病毒药物的应用方法
本发明所述的斑节对虾TRIM50-like蛋白可以用多种方法制备多种形式的抗病毒药物，以下列举的方法最为常用。
(1)体内注射法：将斑节对虾TRIM50-like蛋白利用基因工程方法进行表达纯化，蛋白可以冻干粉的状态在液氮或-80℃冰箱长期保存。用于抗病毒治疗时，可以通过将蛋白干粉用生理盐水溶解后直接进行体内注射。
(2)体内过表达法：利用体外转录系统(mMESSAGEm
Figure BDA0002914803080000101
T7 TranscriptionKit，Invitrogen公司)制备的TRIM50-like蛋白的过表达的成熟mRNA或者过表达载体，通过口服或者注射方法将过表达mRNA或者构建好的过表达载体导入对虾中，过量表达TRIM50-like蛋白。
(3)微囊化控释方法：可以用多种方法制备微囊，最为常用的有脂质体法或者海藻酸纳载体法。具体方法己经为本领域研究人员所熟练掌握。以脂质体为例：将卵磷脂、胆固醇和二琼脂磷酸酯按照一定比例溶解在氯仿中，加入TRIM50-like蛋白。于N2气体下，37℃乳化。将上述乳化液在室温下保持2小时，于N2气体下，4℃，用超声波处理10秒。在室温下保持2小时，再通过琼脂糖6B柱收集脂肪微粒部分，离心分离，所得悬浮液于生理盐水中，继以超声波处理，离心分离，所得悬浮液于生理盐水中，再通过琼脂糖6B柱收集脂肪微粒部分。
(4)将斑节对虾TIRM50-like蛋白作为饲料添加剂来制备具有抗病毒和提高免疫力的特种饲料。
(5)利用药用载体将斑节对虾TRIM50-like蛋白制备成体内或体外给药的制剂。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1245
<212> DNA
<213> ubiquitin-ligase enzymes(E3泛素连接酶)
<400> 1
atgctgcctg agtgcggtca caccttctgc agggagtgtc tcctcaacct acagtctact 60
tctcttgttt gtccgaactg caggcaacac cactatagtg tgtgcgttga ggagttgcct 120
gtgaatttcg ctcagctggg catagccacc gccttgtcaa atattcagaa aagcaaagac 180
caaggacagt gcagcaagca cagcctacca ctggatctgt ggtgttcagt ttcccagaga 240
gagatgtgtg cgatgtgcta cttcgaggaa acgaaacaga cacagcagcg ggttctaacg 300
ctcgctgaaa ggaggcaatt caccgtggac gccattagac agaagtcgct tatcctgagc 360
cagctgtaca cgaccctaaa acattgctta accagtgata gcgaaagcat gtgccaaaac 420
agctacgcca agaagctcaa tgatattctt cggggggagg aacttggcat ccttccatcg 480
tcaaccatcg acaaaagact agatggactg aagaagatga tgtttccccc cgaccgagag 540
aagagaagcg gtaccggcag cagcagggaa agcagacagg aagcagagag gcctgataag 600
atgaagctgc ggtgtgtggc aaagtgcgac aagggcaaga aggcacggtt gacctgggag 660
gaagatcagc ttcacatcta tgcactctgt gtggaccccg aggaggcgca catcacttta 720
aatatgaggg acgtccgcct cctcgtctct caggaaaacc ccacagtgtt cgtggacgtg 780
gccgacaggg acggacccat cggccgcgtc aacatcaagg tgtggaccca cctccgccgc 840
ggccagcagt tcctcgccct gtgccaggga cacctcgggc caacgctgaa gggctcggcg 900
ttcctggacg tcaccgagac cgccgggatc gactgcctcc gcgggggacg ctacctgacg 960
gagaacggca cgagctccca cgccctgatg gatcgtctgg agtggaacga gggtcacgag 1020
cggccagggc gaaagggcct ggtggctggc tggagtttca ggaaggcgga ggacgagacc 1080
ctgttcggca tagcgctagg ggagtgtcat atcaagttct gctgcccttt cggcgaggtc 1140
gtgtccggta tgtccatcgt tgaggacatt gcctacaacc gcacggtgag ggacgtgacc 1200
attgtggagg tggggacggc agtgcgcgac tttgcgacga attga 1245
<210> 2
<211> 414
<212> PRT
<213> ubiquitin-ligase enzymes(E3泛素连接酶)
<400> 2
Met Leu Pro Glu Cys Gly His Thr Phe Cys Arg Glu Cys Leu Leu Asn
1 5 10 15
Leu Gln Ser Thr Ser Leu Val Cys Pro Asn Cys Arg Gln His His Tyr
20 25 30
Ser Val Cys Val Glu Glu Leu Pro Val Asn Phe Ala Gln Leu Gly Ile
35 40 45
Ala Thr Ala Leu Ser Asn Ile Gln Lys Ser Lys Asp Gln Gly Gln Cys
50 55 60
Ser Lys His Ser Leu Pro Leu Asp Leu Trp Cys Ser Val Ser Gln Arg
65 70 75 80
Glu Met Cys Ala Met Cys Tyr Phe Glu Glu Thr Lys Gln Thr Gln Gln
85 90 95
Arg Val Leu Thr Leu Ala Glu Arg Arg Gln Phe Thr Val Asp Ala Ile
100 105 110
Arg Gln Lys Ser Leu Ile Leu Ser Gln Leu Tyr Thr Thr Leu Lys His
115 120 125
Cys Leu Thr Ser Asp Ser Glu Ser Met Cys Gln Asn Ser Tyr Ala Lys
130 135 140
Lys Leu Asn Asp Ile Leu Arg Gly Glu Glu Leu Gly Ile Leu Pro Ser
145 150 155 160
Ser Thr Ile Asp Lys Arg Leu Asp Gly Leu Lys Lys Met Met Phe Pro
165 170 175
Pro Asp Arg Glu Lys Arg Ser Gly Thr Gly Ser Ser Arg Glu Ser Arg
180 185 190
Gln Glu Ala Glu Arg Pro Asp Lys Met Lys Leu Arg Cys Val Ala Lys
195 200 205
Cys Asp Lys Gly Lys Lys Ala Arg Leu Thr Trp Glu Glu Asp Gln Leu
210 215 220
His Ile Tyr Ala Leu Cys Val Asp Pro Glu Glu Ala His Ile Thr Leu
225 230 235 240
Asn Met Arg Asp Val Arg Leu Leu Val Ser Gln Glu Asn Pro Thr Val
245 250 255
Phe Val Asp Val Ala Asp Arg Asp Gly Pro Ile Gly Arg Val Asn Ile
260 265 270
Lys Val Trp Thr His Leu Arg Arg Gly Gln Gln Phe Leu Ala Leu Cys
275 280 285
Gln Gly His Leu Gly Pro Thr Leu Lys Gly Ser Ala Phe Leu Asp Val
290 295 300
Thr Glu Thr Ala Gly Ile Asp Cys Leu Arg Gly Gly Arg Tyr Leu Thr
305 310 315 320
Glu Asn Gly Thr Ser Ser His Ala Leu Met Asp Arg Leu Glu Trp Asn
325 330 335
Glu Gly His Glu Arg Pro Gly Arg Lys Gly Leu Val Ala Gly Trp Ser
340 345 350
Phe Arg Lys Ala Glu Asp Glu Thr Leu Phe Gly Ile Ala Leu Gly Glu
355 360 365
Cys His Ile Lys Phe Cys Cys Pro Phe Gly Glu Val Val Ser Gly Met
370 375 380
Ser Ile Val Glu Asp Ile Ala Tyr Asn Arg Thr Val Arg Asp Val Thr
385 390 395 400
Ile Val Glu Val Gly Thr Ala Val Arg Asp Phe Ala Thr Asn
405 410

Claims (2)

1.斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白或斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like重组蛋白在制备具有对虾抗病毒效果的药物方面的应用，所述病毒为对虾白斑综合症病毒，所述斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like重组蛋白，由表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组蛋白的方法制备得到，所述表达载体含有编码所述斑节对虾E3泛素连接酶TRIM50-like蛋白的基因，所述基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述药物通过体内注射法、口服或外用的方式给药，药物剂型为体内注射剂型、体内过表达剂型、微囊化控释剂型、饲料添加剂或利用药用载体制成体内或体外制剂。
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