CN109536642A - 一种通用型猪丁型冠状病毒巢式rt-pcr检测方法 - Google Patents

一种通用型猪丁型冠状病毒巢式rt-pcr检测方法 Download PDF

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常小云
晋钱钱
曾攀
胡利群
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Abstract

本发明提供了用于检测猪丁型冠状病毒的巢氏RT‑PCR引物、检测方法及试剂盒。所述巢氏RT‑PCR引物是根据检测猪丁型冠状病毒的高度保守的特异性序列设计的两对引物。所述检测方法包括：提取样本RNA；以所得样本RNA为模板，利用所述引物进行RT‑PCR反应；反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。所述试剂盒包括引物、扩增试剂、阳性对照和阴性对照。本发明提供的技术方案特异性强、灵敏度高、抗干扰性能好，且可靠性强，克服了普通检测方法灵敏度低，特异性差等问题，而且与现有的核酸杂交、基因芯片等检测方法相比成本较低，检测周期短，实用性强。

Description

一种通用型猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR检测方法
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种通用型猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR检测方法。
背景技术
猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是冠状病毒科(Coronavirinae)δ-冠状病毒属的成员，是近年来发现的呈世界性流行的猪肠道病毒。其临床状表现为急性腹泻、呕吐、脱水。该病毒首先于2012年在香港被报道，2014年后，该病相继在美国韩国等国家被报道，之后便以暴发的方式在世界范围内发生与流行，对养猪业的健康发展造成了一定的影响。
猪丁型冠状病毒是δ冠状病毒(Deltacoronavirus)的成员，是属于冠状病毒科冠状病毒亚科，基因组的组成和排列与其它冠状病毒类似。其基因组至少包括7个ORFs(开放阅读框)，分别编码四种结构蛋白(核蛋白N、小包膜蛋白E、纤突蛋白S和膜糖蛋白M)、两种非结构蛋白(NS6和NS7蛋白)和两种多聚蛋白(1a和1b蛋白)冠状病毒是在已知RNA病毒的基因序列长度中最长的,但是猪丁型冠状病毒的序列大小约为25.4kb，它又是所有冠状病毒中基因组最小的。
PDCoV的临床症状与其它猪肠道冠状病毒相近。因此，猪丁型冠状病毒的检测目前主要是实验室检测。病原学检测技术主要有普通RT-PCR、荧光定量RT-PCR、LAMP法等。血清学检测方法中主要是抗体检测。但由于普通RT-PCR敏感性较低，本专利在常规RT-PCR基础上建立一种检测PDCoV的巢式RT-PCR方法，以提高检测的敏感性及特异性。
巢式RT-PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增目的片段。经过两次PCR扩增，可以极大程度的提高普通PCR的灵敏度，且二次PCR引物发生非特异性结合的概率极低。序列分析显示：流行毒株N蛋白氨基酸高度保守，可以作为临床诊断的靶抗原。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了用于检测猪丁型冠状病毒的巢式RT-PCR引物、检测方法及试剂盒，建立了一种通用型猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR检测方法，且具有特异性强、灵敏度高的特点，适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等，具有重要现实意义。
本发明第一方面提供一种用于检测检测猪丁型冠状病毒的巢式RT-PCR引物，所述引物根据检测猪丁型冠状病毒N基因中碱基序列设计两对特异性引物，分别为一对外侧引物PDCoV-O-F、PDCoV-O-R和一对内侧引物PDCoV-I-F、PDCoV-I-R，具体为：
PDCoV-O-F：5'-CAGGTCCCAGAGGAAATCTTA-3'(SEQ ID NO.1)
PDCoV-O-R：5'-TTTGGTAGGTGGCTCATAGGT-3'(SEQ ID NO.2)；
PDCoV-I-F：5'-GAAGACCTCAGGAGCGTGGAA-3'(SEQ ID NO.3)；
PDCoV-I-R：5'-TGAGTAGGAGAAGGTAAGGGTGA-3'(SEQ ID NO.4)。
本发明第二方面提供了一种用于检测猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)、使用Trizol RNA提取液提取待测样品RNA；
(2)、第一轮PCR扩增：以S1提取的RNA为模板，利用上述外侧引物进行第一轮PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，如果扩增出665bp大小目的条带则证明为阳性，否则为阴性；
(3)、第二轮PCR扩增：以第一轮阴性的PCR扩增产物为模板，利用上述内侧引物进行第二轮PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，如果扩增出353bp大小目的条带则证明所述样品中存在猪丁型冠状病毒。
进一步地，所述步骤(2)中，PCR反应体系为：2×1Step Buffer 12.5μl，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl，20μmol/L的PDCoV-O-F与20μmol/L的PDCoV-O-R各1μl，RNA模板1μl，补加RNase Free dH2O至25μl。
进一步地，所述步骤(2)中，PCR的反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min。
进一步地，所述步骤(3)中，PCR反应体系为：Mix 12.5μl，20μmol/L的PDCoV-I-F与20μmol/L的PDCoV-I-R各1μl，模板1μl，补加RNase Free dH2O至25μl。
进一步地，所述步骤(3)中，PCR的反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min。
本发明第三方面提供了一种用于检测猪丁型冠状病毒的试剂盒，包括本发明第一方面所述的两对特异性引物，还包括扩增试剂、阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为含有猪丁型冠状病毒665bp基因片段的重组质粒，所述阴性对照为RNase-free water。
本发明的有益效果是：本发明所提供的巢式RT-PCR检测引物是针对猪丁型冠状病毒N基因基因中的碱基序列设计出的4条特异性引物，具有针对猪丁型冠状病毒的特异性。本发明提供的检测方法针对现有流行毒株检测的最低拷贝数可达到1个数量级，最低拷贝数为1.4，比普通PCR检测方法灵敏度高2-3个数量级。采用使用Trizol RNA提取液提取待测样品RNA，不仅可以迅速破坏细胞结构，还能保证RNA的完整，提高了检测结果的可靠性。而且该方法适用于待检猪的血清、腹泻、脾脏、肺脏等样品，因此该检测方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。综上所述，本发明提供的方法具有特异性强、灵敏度高、实用性强等特点，克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，且成本较低，检测周期短。
附图说明
图1为巢式RT-PCR外侧引物特异性检测的凝胶电泳图，其中M为DL2000DNAMarker；1为重组阳性质粒；2-7分别为猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV),猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；8为阴性对照(RNase-free water)。
图2为巢式RT-PCR内侧引物特异性检测的凝胶电泳图，M为DL2000DNA Marker；1为重组阳性质粒；2-7分别为猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；8为阴性对照(RNase-free water)。
图3为巢式RT-PCR外侧引物敏感性检测的凝胶电泳图，M为DL2000DNA Marker；1-9中模板拷贝数依次为1.4×108，1.4×107，1.4×106，1.4×105，1.4×104，1.4×103，1.4×102，1.4×101，1.4。
图4为巢式RT-PCR内侧引物敏感性检测的凝胶电泳图，1-9分别以第一次PCR产物为相应模板；1-9中模板拷贝数依次为1.4×108，1.4×107，1.4×106，1.4×105，1.4×104，1.4×103，1.4×102，1.4×101，1.4。
图5为巢式RT-PCR引物干扰性检测的凝胶电泳图，M为DL2000DNA Marker，1为外侧引物扩增混合的基因组，2，3，4为阴性对照(RNase-free water)。
图6为巢式RT-PCR引物干扰性检测的凝胶电泳图，M为DL2000DNA Marker，1为内侧引物扩增混合的基因组，2，3，4为阴性对照(RNase-free water)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明做进一步的描述，但并不是限制本发明的范围，仅作示例说明。
实施例1：猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR检测方法的建立
(1)猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR引物的设计
根据猪丁型冠状病毒N基因中碱基序列设计两对特异性引物，两对引物的序列分别为：
PDCoV-O-F：5'-CAGGTCCCAGAGGAAATCTTA-3'(SEQ ID NO.1)
PDCoV-O-R：5'-TTTGGTAGGTGGCTCATAGGT-3'(SEQ ID NO.2)；
PDCoV-I-F：5'-GAAGACCTCAGGAGCGTGGAA-3'(SEQ ID NO.3)；
PDCoV-I-R：5'-TGAGTAGGAGAAGGTAAGGGTGA-3'(SEQ ID NO.4)。
(2)取样与RNA提取
A：样本采集：收集样本血清，3000r/min离心20分钟，取200μL利用Trizol RNA提取液提取RNA，测定浓度备用。
B：组织样品处理：取待检测猪只样本的组织器官肝、肺，剪碎后利用Trizol RNA提取液提取RNA，测定浓度备用。
(3)PCR扩增与电泳检测
A：用外侧检测引物PDCoV-O-F、PDCoV-O-R进行第一次PCR扩增。PCR反应体系为：2×1Step Buffer 12.5μl，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl，20μmol/L的PDCoV-O-F与20μmol/L的PDCoV-O-R各1μl，RNA模板1μl，补加RNase Free dH2O至25μl；PCR反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增；
B：用内侧检测引物PDCoV-I-F、PDCoV-I-R对第一次扩增产物模板进行第二次扩增。内侧引物的最佳扩增条件如下：Mix 12.5μl，20μmol/L的PDCoV-I-F与20μmol/L的PDCoV-I-R各1μl，模板1μl，补加RNase Free dH2O至25μl；PCR反应程序为：94℃预变性2min，98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
(4)结果分析
根据巢式RT-PCR扩增结果判定：在第一次PCR扩增后电泳检测到目标条带则报告为阳性，且样品带毒量较高；第二次PCR扩增后电泳检测到目标条带的也判断为含有猪丁型冠状病毒，但是样品带毒量相对较低；两轮PCR后检测均无目的条带的则报告为样品不含猪丁型冠状病毒。
实施例2：重组阳性质粒pMD18-T-N构建
(1)N基因的克隆
提取猪丁型冠状病毒(PEDV)的基因组RNA，以该基因组RNA为模板，采用巢式RT-PCR外侧引物PDCoV-O-F和PDCoV-O-R扩增N基因部分保守序列。PCR反应体系(25μl)为：2×1Step Buffer 12.5μl，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl，20μmol/L的PDCoV-O-F与20μmol/L的PDCoV-O-R各1μl，RNA模板1μl，补加RNase Free dH2O至25μl；PCR反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min，PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，结果如图1所示，获得了一条约665bp的特异性DNA条带，与目标DNA片段大小相符。
(2)pMD18-T-N阳性质粒构建
将上述PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，然后与TaKaRa公司的pMD18-T克隆载体进行连接，连接体系为：pMD18-T vector 1μl，PCR回收产物3μl，SolutionⅠ5μl，ddH20 1μl；16℃恒温连接30min后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布Amp抗性的LB培养基上；37℃培养过夜，通过抗性筛选出正确的重组子。
(3)pMD18-T-N阳性重组子鉴定
用引物PRV-O-F和PRV-O-R对挑选的阳性克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的重组子命名为pMD18-T-N。
(4)重组质粒pMD18-T-N的提取
测序鉴定正确的重组子用LB肉汤进行增菌后采用TaKaRa公司的高纯度质粒小提试剂盒MiniBEST Plasmid Purification Kit提取质粒并测定浓度，计算拷贝数。
实施例3：巢式RT-PCR引物特性检测
(1)特异性试验：提取猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组当模板，对巢式RT-PCR所用到的两对引物PDCoV-O-F、PDCoV-O-R和PDCoV-I-F、PDCoV-I-R进行特异性检测，检验两对引物的特异性，结果如图1，2所示，两对引物均具有良好的特异性和较高的扩增效率。
(2)敏感性试验：对实施例2所获得的阳性质粒进行10倍倍比稀释至个位数拷贝数，选取各稀释度质粒当做模板用引物PDCoV-O-F、PDCoV-O-R进行第一次PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖胶检测，结果如图3所示，第一次PCR扩增电泳结果显示，外侧引物可检测到基因拷贝数的数量级为102，且扩增特异性好。扩增产物作为相应梯度的模板用引物PDCoV-I-F、PDCoV-I-R做第二次PCR扩增，扩增产物用1％琼脂糖胶进行检测，结果如图4所示，经过巢式RT-PCR两次扩增后所能检测到的最低1个数量级的基因拷贝数。
(3)干扰试验：对特异性试验中用到的基因组与腹泻基因组取等量进行混合，用引物PDCoV-O-F、PDCoV-O-R和PDCoV-I-F、PDCoV-I-R分别进行PCR扩增，检验引物的抗干扰性，能否从混合基因组模板中扩增出目的条带，结果如图5和图6所示，两对引物均能从混合模板中扩增出特异性条带，显示引物抗干扰性较好。
(4)符合率试验：为验证巢式引物对各地区猪丁型冠状病毒检测的敏感性，提取了HKU15-44、HKU15-155、CH-A、HB-BD等毒株的基因组，测定浓度后计算出拷贝数，梯度稀释至个位数拷贝数，经过两轮巢式RT-PCR扩增后，各类基因组均能检测到1个数量级的基因拷贝数，证明本发明方法切实可行。
实施例4：巢式RT-PCR可靠性试验
1、临床样品采集：2018年5月从河南某家规模化猪场采集小猪血样42份，3000r/min离心20分钟，收集样本血清，使用Trizol RNA提取液提取RNA。
2、PCR扩增与电泳检测：按实施例1的步骤(3)进行两轮PCR扩增。对扩增后的产物进行电泳检测，42份血清样本共检测到31份阳性，测序结果显示31份阳性产物均为猪丁型冠状病毒基因，证明该方法检测的结果具有可靠性。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 长江大学
<120> 一种通用型猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggtcccag aggaaatctt a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttggtaggt ggctcatagg t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagacctca ggagcgtgga a 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgagtaggag aaggtaaggg tga 23

Claims (8)

1.一种猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR特异性引物，其特征在于，所述引物根据检测猪丁型冠状病毒的高度保守的特异性序列设计两对特异性引物，所述两对引物，分别为一对外侧引物PDCoV-O-F、PDCoV-O-R和一对内侧引物PDCoV-I-F、PDCoV-I-R，具体为：
PDCoV-O-F：5'-CAGGTCCCAGAGGAAATCTTA-3'(SEQ ID NO.1)；
PDCoV-O-R：5'-TTTGGTAGGTGGCTCATAGGT-3'(SEQ ID NO.2)；
PDCoV-I-F：5'-GAAGACCTCAGGAGCGTGGAA-3'(SEQ ID NO.3)；
PDCoV-I-R：5'-TGAGTAGGAGAAGGTAAGGGTGA-3'(SEQ ID NO.4)。
2.一种猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、使用Trizol RNA提取液提取待测样品RNA；
S2、第一轮PCR扩增：以S1提取的RNA为模板，利用权利要求1所述外侧引物进行第一轮PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，如果扩增出665bp大小目的条带则证明为阳性，否则为阴性；
S3、第二轮PCR扩增：以第一轮阴性的PCR扩增产物为模板，利用权利要求1所述内侧引物进行第二轮PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，如果扩增出353bp大小目的条带则证明所述样品中存在猪丁型冠状病毒。
3.根据权利要求2所述的一种猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于，所述S2中，PCR反应体系为：2×1 Step Buffer 12.5μl，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μl，20μmol/L的PDCoV-O-F与20μmol/L的PDCoV-O-R各1μl，RNA模板1μl，补加RNase Free dH2O至25μl。
4.根据权利要求2所述的一种猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于，所述S2中，PCR的反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min。
5.根据权利要求2所述的一种猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于，所述S3中，PCR反应体系为：Mix 12.5μl，20μmol/L的PDCoV-I-F与20μmol/L的PDCoV-I-R各1μl，模板1μl，补加RNase Free dH2O至25μl。
6.根据权利要求2所述的一种猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR检测方法，其特征在于，所述S3中，PCR的反应条件为：94℃预变性2min，98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环，72℃延伸6min。
7.权利要求1所述特异性引物在制备鉴别猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的鉴别猪丁型冠状病毒巢式RT-PCR试剂盒，其特征在于，还包括扩增试剂、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有猪丁型冠状病毒665bp基因片段的重组质粒，所述阴性对照为RNase-free water。
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