CN109735661A - 一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通用型猪流行性腹泻病毒巢氏PCR检测方法，其特征在于：通过编码猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白N中碱基序列得到两对巢式引物，分别为外侧引物PEDV‑O‑F、PEDV‑O‑R和内侧引物PEDV‑I‑F、PEDV‑I‑R。用两对引物进行两次PCR扩增，第一次PCR扩增使用反转录酶得到cDNA并进行扩增，第二次使用第一次PCR扩增产物进行扩增，每次PCR扩增产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳以检测猪流行性腹泻病毒。本发明提供的巢式PCR检测方法特异性强、灵敏度高、抗干扰性能好，且可靠性强，克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，而且与现有的核酸杂交、基因芯片等检测方法相比成本较低，检测周期短，实用性强。

Description

一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测方法

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种通用型猪流行性腹泻病毒式PCR检测方法。

背景技术

猪流行性腹泻病(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种接触性肠道传染病，其主要临床特征为呕吐、水样腹泻、脱水。临床变化和症状与猪传染性胃肠极为相似。1971年首发于英国，20世纪80年代初我国陆续发生本病。猪流行性腹泻病常以暴发性腹泻的形式发生在非免疫断奶仔猪(I型)或各种年龄的猪(Ⅱ型)。

猪流行腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒科冠状病毒属，为单股正链RNA病毒,基因组长约28kb，病毒粒子主要由纤突糖蛋白(S)，小膜蛋白(E)，膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)组成。到目前为止，还没有发现本病毒有不同的血清型。本病毒对乙醚、氯仿敏感。病毒粒子呈现多形性，倾向圆形，外有囊膜。从患病仔猪的肠灌液中浓缩和纯化的病毒不能凝集家兔、小鼠、猪、豚鼠、绵羊、牛、马、雏鸡、和人的红细胞。本病在临诊症状、流行病学和病理变化等方面均与猪传染性胃肠炎无明显差异，故确诊是较为困难，须进行实验室诊断。

近年来，国内外学者建立了免疫电镜、免疫荧光、间接血凝试验、ELISA、RT-PCR、中和试验等。近年来研究的侧重点主要是ELISA法和PCR法，这两种方法以其实用性强、高效、快速、准确而被广泛应用。但由于普通RT-PCR敏感性较低，本专利在常规RT-PCR基础上建立一种检测PEDV的巢式RT-PCR方法，以提高检测的敏感性及特异性。

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增目的片段。经过两次PCR扩增，可以极大程度的提高普通PCR的灵敏度，且二次PCR引物发生非特异性结合的概率极低。序列分析显示：流行毒株N蛋白氨基酸高度保守，可以作为临床诊断的靶抗原。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种快速简便的猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测方法，其具有特异性强、灵敏度高的特点。该技术克服了普通PCR检测灵敏度低，特异性差等问题，而且与现有的核酸杂交、基因芯片等检测方法相比成本较低，检测周期短。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1.猪流行性腹泻病毒的巢式PCR引物的设计：通过编码猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白N基因中碱基序列得到两对检测引物，所述两对检测引物，分别为外侧引物PEDV-O-F、PEDV-O-R和内侧引物PEDV-I-F、PEDV-I-R，序列如下：

PEDV-O-F：5'-GCAAACGGGTGCCATTATCTC-3'(SEQ ID NO.1)；

PEDV-O-R：5'-GCTCACGAACAGCCACATTAC-3'(SEQ ID NO.2)；

PEDV-I-F：5'-TTGGCATTTCTACTACCTCGGAACA-3'(SEQ ID NO.3)；

PEDV-I-R：5'-GCCTGACGCATCAACACCTTT-3'(SEQ ID NO.4)。

2.一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测方法的建立，包括以下步骤：

(1)提取待测样品基因组：用DNA/RNA提取试剂盒提取样品RNA；

(2)第一轮扩增：以步骤(1)提取的RNA为模板，利用外侧引物进行第一轮扩增，PCR反应体系为：2×1Step Buffer 12.5μl，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl，20μmol/L的PEDV-O-F与20μmol/L的PEDV-O-R各1μl，RNA模板1μl，补加RNase Free dH₂O至25μl；PCR反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增；

(3)第二轮扩增：以步骤(2)扩增产物为DNA模板，利用内侧引物进行第二轮扩增，PCR反应体系为：5U/μl的Ex Taq 0.125μl，10×Ex Taq Buffer 2.5μl，dNTP Mixture 2μl，20μmol/L的PEDV-I-F与20μmol/L的PEDV-I-R各1μl，模板2μl，补加RNase Free dH₂O至25μl；PCR反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

优选的，所述步骤(1)中待检测RNA从猪的血清、组织或腹泻样品中提取。

更加优选的，所述组织为肠道粘膜、脾脏或肺脏。

优选的，所述步骤(2)中目的条带指的是996bp条带。

优选的，所述步骤(3)中模板为步骤(2)中PCR产物稀释50倍。

优选的，所述步骤(3)中对扩增后的产物进行电泳检测，出现739bp条带即可判断为所述样品中存在猪流行性腹泻病毒。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.特异性强：本发明所提供的巢式PCR检测引物是针对猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白N基因中的碱基序列设计出的4条特异性引物，并且对多种病原菌进行验证，只有猪流行性腹泻病毒可以扩增出特异条带，具有针对猪流行腹泻病毒的特异性。

2.灵敏度高：本发明的巢式PCR检测方法对现有流行毒株检测的最低拷贝数可达到10¹个数量级，最低拷贝数为10¹，比普通PCR检测方法灵敏度高2-3个数量级。

3.抗干扰性能好：本发明所提供的巢式PCR检测引物均能从混合模板中扩增出特异性条带，显示引物抗干扰性较好。

4.结果可靠：提取某养殖场多分血清样品，经过两轮巢式PCR扩增后电泳检测，对检测呈阳性的样品进行测序，均为猪流行性腹泻病毒，证明了本发明方法的可靠性。

5.实用性强：可以采用的血清或腹泻样品提取RNA检测避免了猪只的处死，对带毒量较低的规模化猪场腹泻检测提供了便利。同时还适用于待检猪的脾脏、肺脏等样品，所述巢式PCR检测方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。

附图说明

图1为巢式PCR外侧引物特异性检测的凝胶电泳图，其中M为DL2000DNA Marker；1、2均为重组阳性质粒；3-7分别为猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV),猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；8为阴性对照(无DNA、RNA的ddH₂O)。

图2为巢式PCR内侧引物特异性检测的凝胶电泳图，M为DL2000DNA Marker；1、2均为重组阳性质粒；3-7分别为猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；8为阴性对照(无DNA、RNA的ddH₂O)。

图3为巢式PCR外侧引物敏感性检测的凝胶电泳图，M为DL2000DNA Marker；1-10中模板拷贝数依次为2.8×10⁹，2.8×10⁸，2.8×10⁷，2.8×10⁶，2.8×10⁵，2.8×10⁴，2.8×10³，2.8×10²，2.8×10¹，2.8。

图4为巢式PCR内侧引物敏感性检测的凝胶电泳图，1-9分别以第一次PCR产物为相应模板；，1-10中模板拷贝数依次为2.8×10⁹，2.8×10⁸，2.8×10⁷，2.8×10⁶，2.8×10⁵，2.8×10⁴，2.8×10³，2.8×10²，2.8×10¹，2.8。

图5为巢式PCR引物干扰性检测的凝胶电泳图，M为DL2000DNA Marker，1为外侧引物扩增混合的基因组，2为内侧引物扩增混合的基因组，3，4为阴性对照(无DNA、RNA的ddH₂O)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明做进一步的描述，但并不是限制本发明的范围，仅作示例说明。

实施例1：通用型猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测方法的建立

(1)取样与RNA提取

A：样本采集：收集样本血清，3000r/min离心20分钟，取200μL用DNA/RNA提取试剂盒提取RNA，测定浓度备用。

B：组织样品处理：取待检测猪只样本的组织器官肝、肺，剪碎后用RNA提取试剂盒提取RNA，测定浓度备用。

(2)PCR扩增与电泳检测

A：用外侧检测引物PEDV-O-F、PEDV-O-R进行第一次PCR扩增。PCR反应体系为：2×1Step Buffer 12.5μl，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl，20μmol/L的PEDV-O-F与20μmol/L的PEDV-O-R各1μl，模板RNA1μl，补加RNase Free dH₂O至25μl；反应条件：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无996bp条带则进行第二次扩增。

B：用内侧检测引物PEDV-I-F、PEDV-I-R对第一次扩增产物模板进行第二次扩增。内侧引物的最佳扩增条件如下：Ex Taq 0.125μl(5U/μl)，10×Ex Taq Buffer 2.5μl，dNTPMixture 2μl，20μmol/L的PEDV-I-F与20μmol/L的PEDV-I-R各1μl，以第一轮RT-PCR扩增产物稀释50倍作为模板，加2μl，补加RNase Free dH₂O至25μl；反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测是否有739bp条带。

(3)结果分析

根据巢式PCR扩增结果判定：在第一次PCR扩增后电泳检测到目标条带则报告为阳性，且检测样本带毒量较高；第二次PCR扩增后电泳检测到目标条带的也判断为阳性，表明样品带毒量相对较低；两轮巢式PCR后检测均无目的条带的则报告为阴性。

实施例2：重组阳性质粒pMD18-T-N构建

(1)N基因的克隆

提取猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组RNA，以该基因组RNA为模板，采用巢式PCR外侧引物PEDV-O-F和PEDV-O-R扩增N基因部分保守序列。PCR反应体系(25μl)为：2×1StepBuffer12.5μl，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μl，20μmol/L的PEDV-O-F与20μmol/L的PEDV-O-R各1μl，RNA模板1μl，补加RNase Free dH2O至25μl。反应条件：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min，PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，结果如图1所示，获得了一条约996bp的特异性DNA条带，与目标DNA片段大小相符。

(2)pMD18-T-N阳性质粒构建

将上述PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，然后与TaKaRa公司的pMD18-T克隆载体进行连接，连接体系为：pMD18-T vector 1μl，PCR回收产物3μl，SolutionⅠ5μl，ddH₂0 1μl；16℃恒温连接30min后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布Amp抗性的LB培养基上；37℃培养过夜，通过抗性筛选出正确的重组子。

(3)pMD18-T-N阳性重组子鉴定

用引物PRV-O-F和PRV-O-R对挑选的阳性克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的重组子命名为pMD18-T-N。

(4)重组质粒pMD18-T-N的提取

测序鉴定正确的重组子用LB肉汤进行增菌后采用TaKaRa公司的高纯度质粒小提试剂盒MiniBEST Plasmid Purification Kit提取质粒并测定浓度，计算拷贝数。

实施例3：巢式PCR引物特性检测

(1)特异性试验：提取猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组当模板，对巢式PCR所用到的两对引物PEDV-O-F、PEDV-O-R和PEDV-I-F、PEDV-I-R进行特异性检测，检验两对引物的特异性，结果如图1，2所示，两对引物均具有良好的特异性和较高的扩增效率。

(2)敏感性试验：对实施例2所获得的阳性质粒进行10倍倍比稀释至个位数拷贝数(4copy)，选取各稀释度质粒当做模板用引物PEDV-O-F、PEDV-O-R进行第一次PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖胶检测，结果如图3所示，第一次PCR扩增电泳结果显示，外侧引物可检测到基因拷贝数为10³，且扩增特异性好。扩增产物作为相应梯度的模板用引物PEDV-I-F、PEDV-I-R做第二次PCR扩增，扩增产物用1％琼脂糖胶进行检测，结果如图4所示，经过巢式PCR两次扩增后所能检测到的最低10¹个数量级的基因拷贝数。

(3)干扰试验：对特异性试验中用到的基因组与腹泻基因组取等量进行混合，用引物PEDV-O-F、PEDV-O-R和PEDV-I-F、PEDV-I-R分别进行PCR扩增，检验引物的抗干扰性，能否从混合基因组模板中扩增出目的条带，结果如图5所示，两对引物均能从混合模板中扩增出特异性条带，显示引物抗干扰性较好。

(4)符合率试验：为验证巢式引物对各地区流行腹泻病毒检测的敏感性，提取了V2332、CH-1R、R98、JXA1-R等毒株的基因组，测定浓度后计算出拷贝数，梯度稀释至个位数拷贝数，经过两轮巢式PCR扩增后，各类基因组均能检测到10¹个数量级的基因拷贝数，证明本发明方法切实可行。

实施例4：巢式PCR可靠性试验

1、临床样品采集：2018年5月从河南某家规模化猪场采集小猪血样42份，3000r/min离心20分钟，收集样本血清，按照TaKaRa公司的DNA/RNA提取试剂盒提取RNA。

2、PCR扩增与电泳检测：按实施例1的步骤(2)进行两轮PCR扩增。对扩增后的产物进行电泳检测，42份血清样本共检测到31份阳性，测序结果显示31份阳性产物均为猪流行性腹泻病毒基因，证明该方法检测的结果具有可靠性。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 长江大学

<120> 一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcaaacgggt gccattatct c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctcacgaac agccacatta c 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttggcatttc tactacctcg gaaca 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcctgacgca tcaacacctt t 21

Claims (7)

1.一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测引物，其特征在于：通过编码猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白N中碱基序列得到两对检测引物，所述两对检测引物，分别为外侧引物PEDV-O-F、PEDV-O-R和内侧引物PEDV-I-F、PEDV-I-R，序列如下：

PEDV-O-F：5'-GCAAACGGGTGCCATTATCTC-3'(SEQ ID NO.1)；

PEDV-O-R：5'-GCTCACGAACAGCCACATTAC-3'(SEQ ID NO.2)；

PEDV-I-F：5'-TTGGCATTTCTACTACCTCGGAACA-3'(SEQ ID NO.3)；

PEDV-I-R：5'-GCCTGACGCATCAACACCTTT-3'(SEQ ID NO.4)。

2.一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测方法，其特征在于：包含以下步骤：

S1、样品RNA的提取；

S2、第一轮扩增：以S1提取的RNA为模板，利用外侧引物进行第一轮扩增，PCR反应体系为：2×1 Step Buffer 12.5μl，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μl，20μmol/L的PEDV-O-F与20μmol/L的PEDV-O-R各1μl，RNA模板1μl，补加RNase Free dH₂O至25μl；PCR反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若无目的条带则进行第二次扩增；

S3、第二轮扩增：以S2扩增产物为DNA模板，利用内侧引物进行第二轮扩增，PCR反应体系为：5U/μl的Ex Taq 0.125μl，10×Ex Taq Buffer 2.5μl，dNTP Mixture 2μl，20μmol/L的PEDV-I-F与20μmol/L的PEDV-I-R各1μl，模板2μl，补加RNase Free dH₂O至25μl；PCR反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性10s，57℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

3.根据权利要求2所述的一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测方法，其特征在于：所述S1中，待检测RNA从猪的血清、组织或腹泻样品中提取。

4.根据权利要求3所述的一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测方法，其特征在于：所述组织为肠道黏膜、脾脏或肺脏。

5.根据权利要求2所述的一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测方法，其特征在于：所述S2中，目的条带指的是996bp条带。

6.根据权利要求2所述的一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测方法，其特征在于：所述S3中，模板为S2中PCR产物稀释50倍。

7.根据权利要求2所述的一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式PCR检测方法，其特征在于：所述S3中，对扩增后的产物进行电泳检测，出现739bp条带即可判断所述样品中存在猪流行性腹泻病毒。