CN105400782A - 同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式rt-pcr方法 - Google Patents

同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式rt-pcr方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105400782A
CN105400782A CN201510901924.3A CN201510901924A CN105400782A CN 105400782 A CN105400782 A CN 105400782A CN 201510901924 A CN201510901924 A CN 201510901924A CN 105400782 A CN105400782 A CN 105400782A
Authority
CN
China
Prior art keywords
epidemic diarrhea
porcine epidemic
diarrhea virus
pcr
primers
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510901924.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105400782B (zh
Inventor
刘新生
方玉珍
王永录
张永光
潘丽
吕建亮
周鹏
张中旺
邵军军
赵付荣
陈豪泰
丁耀忠
孙跃峰
常慧芸
张�杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN201510901924.3A priority Critical patent/CN105400782B/zh
Publication of CN105400782A publication Critical patent/CN105400782A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105400782B publication Critical patent/CN105400782B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合，所述引物组合由4个特异性引物组成，分别为：上游引物F1、上游引物F2、上游引物F3、下游引物UR；并提供了使用上述引物组合的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法。本发明的有益效果为：本发明提供的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式RT-PCR方法，可以通过一种方法，在一次试验中同时鉴定并区别目前已报道出现的全部三种猪流行性腹泻病毒毒株，是世界上首次建立的一种能够同时检测三种不同基因型猪流行性腹泻病毒流行毒株的检测方法，为今后该病毒的鉴别及临床诊断提供新的、有效的检测方法。

Description

同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式RT-PCR方法
技术领域
本发明涉及病毒毒株鉴定技术领域，具体涉及同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式RT-PCR方法。
背景技术
目前，国内外对于猪流行性腹泻病毒的检测已有许多种方法，包括ELISA，RT-PCR及荧光定量PCR，但都是针对猪流行性腹泻病毒原始毒力株和变异株中的某一种或两种毒株所设计、建立的。因此，目前的方法只能检测或区分这两种基因型的毒株。但目前的研究报道显示当前世界范围内已经发现并鉴定了三种基因型的猪流行性腹泻病毒毒株，且还没有任何一种检测方法能够同时区别这三种病毒毒株。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种能够同时检测并鉴定目前世界范围内出现的三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式RT-PCR方法，为该病毒的鉴别、诊断提供帮助。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合，所述引物组合由4个特异性引物组成，分别为：
上游引物F1：5’-ATGGTACGTTGCTAGTGCGTA-3’；
上游引物F2：5’-TGGTGAAATCCAGAGTGTCAAT-3’；
上游引物F3：5’-CCAGCTTATATGCAGGATGGAA-3’；
下游引物UR：5’-TACCATGCACCAAAGTGGAATCAT-3’。
本发明的第二个目的是提供了同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，包括以下步骤：
1）提取样品总RNA；
2）反转录得到样本cDNA；
3）利用上述的引物F1和UR进行第一轮PCR扩增，区分出S197aa缺失株；
4）分别利用上述的引物F2和UR、引物F3和UR进行第二轮PCR扩增，区分出原始毒力株和变异株。
用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒，参照使用说明书提取样品总RNA。用AMV反转录酶在42℃反转录1小时合成cDNA。反应体系为25μl，内含反转录缓冲液5μl、dNTP3μl、AMV反转录酶0.5μl、下游引物2μl、RNA酶抑制剂0.5μl、无菌水4μl和RNA模板10μl。
进一步的，上述的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，所述步骤3）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl22.5μl、dNTP1μl、权利要求1所述的上游引物F1和下游引物UR各1μl、TaqDNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃35秒、60℃35秒、72℃30秒，共30个循环，最后72℃延伸1分钟。
通过第一轮RT-PCR可分别特异性扩增出三种病毒株的大小不同的片段，其中原始毒力株可扩增出大小为884bp的核酸片段，变异株可扩增出大小为875bp的核酸片段，S197aa缺失株则可扩增出大小为293bp的核酸片段。通过第一轮PCR反应，可区分出S197aa缺失株和其它两个毒株，结果如图1所示。
进一步的，上述的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，所述步骤4）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl22.5μl、dNTP1μl、权利要求1所述的上游引物F2和下游引物UR、上游引物F3和下游引物UR各1μl、TaqDNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃20秒、55℃20秒、72℃15秒，共25个循环，最后72℃延伸1分钟。
利用F2和UR特异性扩增原始毒力株时，可扩增得到大小为650bp的核酸片段，而变异株不产生条带。而利用F3和UR特异性扩增变异株时，可扩增得到大小为358bp的核酸片段，而原始毒力株不产生条带。通过第二次扩增，可利用F2和UR，F2和UR这两个引物对，进一步地区分出原始毒力株和变异株，结果如图2所示。
三种猪流行性腹泻病毒毒株是通过样品采集，分离并鉴定的猪流行性腹泻病毒流行毒株，其分子特点及基因组序列以上传至GenBank中，序列号分别为：PC177(KM392229),PC22A(KM392224)andIowa106(KM392232)。
本发明的有益效果为：本发明提供的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式RT-PCR方法，可以通过一种方法，在一次试验中同时鉴定并区别目前已报道出现的全部三种猪流行性腹泻病毒毒株，是世界上首次建立的一种能够同时检测三种不同基因型猪流行性腹泻病毒流行毒株的检测方法，为今后该病毒的鉴别及临床诊断提供新的、有效的检测方法。
附图说明
图1为本发明方法中第一轮PCR反应结果图。
图2为本发明方法中第二轮PCR反应结果图。
图3为本发明的引物设计思路图。
图4为本发明提供的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法的特异性检测结果。
图5为本发明提供的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法的敏感性检测结果。
具体实施方式
实施例1：
同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合，所述引物组合由4个特异性引物组成，分别为：
上游引物F1：5’-ATGGTACGTTGCTAGTGCGTA-3’；
上游引物F2：5’-TGGTGAAATCCAGAGTGTCAAT-3’；
上游引物F3：5’-CCAGCTTATATGCAGGATGGAA-3’；
下游引物UR：5’-TACCATGCACCAAAGTGGAATCAT-3’。
F1、F2、F3、UR分别如序列表中序列1-4所示。
本发明的引物设计思路如图3所示。
使用了上述引物组合的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，包括以下步骤：
1）提取样品总RNA；
2）反转录得到样本cDNA；
3）利用上述的引物F1和UR进行第一轮PCR扩增，区分出S197aa缺失株；
4）分别利用上述的引物F2和UR、引物F3和UR进行第二轮PCR扩增，区分出原始毒力株和变异株。
用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒，参照使用说明书提取样品总RNA。用AMV反转录酶在42℃反转录1小时合成cDNA。反应体系为25μl，内含反转录缓冲液5μl、dNTP3μl、AMV反转录酶0.5μl、下游引物2μl、RNA酶抑制剂0.5μl、无菌水4μl和RNA模板10μl。
所述步骤3）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl22.5μl、dNTP1μl、权利要求1所述的上游引物F1和下游引物UR各1μl、TaqDNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃35秒、60℃35秒、72℃30秒，共30个循环，最后72℃延伸1分钟。
通过第一轮RT-PCR，利用引物F1/UR组合，可分别特异性扩增出三种病毒株的大小不同的片段，其中原始毒力株可扩增出大小为884bp的核酸片段，变异株可扩增出大小为875bp的核酸片段，S197aa缺失株则可扩增出大小为293bp的核酸片段。通过第一轮PCR反应，可区分出S197aa缺失株和其它两个毒株，结果如图1所示。
所述步骤4）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl22.5μl、dNTP1μl、权利要求1所述的上游引物F2和下游引物UR、上游引物F3和下游引物UR各1μl、TaqDNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃20秒、55℃20秒、72℃15秒，共25个循环，最后72℃延伸1分钟。
利用F2和UR特异性扩增原始毒力株时，可扩增得到大小为650bp的核酸片段，而变异株不产生条带。而利用F3和UR特异性扩增变异株时，可扩增得到大小为358bp的核酸片段，而原始毒力株不产生条带。通过第二次扩增，可利用F2和UR，F2和UR这两个引物对，进一步地区分出原始毒力株和变异株，结果如图2所示。
三种猪流行性腹泻病毒毒株是通过样品采集，分离并鉴定的猪流行性腹泻病毒流行毒株，其分子特点及基因组序列以上传至GenBank中，序列号分别为：PC177(KM392229),PC22A(KM392224)andIowa106(KM392232)。
特异性检测过程的描述：如图4所示，其中M为DNAmarker，1-9分别是PEDVS197aa缺失株，原始毒力株，变异株,三个毒株1:1:1混合物，10:1:1混合物，1:10:1混合物，1:1:10混合物，猪传染性胃肠炎病毒（TGEV），猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）。图4A是利用F1/UR组合进行第一轮RT-PCR，结果显示，只有PEDVS197aa缺失株（1）和含有PEDVS197aa缺失株的混合物（4-7）会扩增出大小为293bb左右的核酸片段，而原始毒力株、变异株及它们的混合物则会扩增出大小为0.88kb左右的核酸片段。而同病毒属内的两种其它猪腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）则不产生任何条带；图4B是利用F2/UR组合进行第二轮RT-PCR，结果显示，只有原始毒力株及其混合物（2、4、5、6、7）会扩增出650bp大小的核酸片段，其它毒株不会产生任何条带；图4C是利用F3/UR组合进行第二轮RT-PCR，结果显示，只有变异株及其混合物（3、4、5、6、7）会扩增出358bp大小的核酸片段，其它毒株不会产生任何条带。以上结果显示三对不同的引物组合对其相对应的毒株具有很高的特异性。
敏感性检测过程的描述：如图5所示，其中M为DNAmarker，1-6分别是PEDV不同毒株的原始毒液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液、10000倍稀释液及100000倍稀释液。图5A、B、C中的毒株分别是S197aa缺失株、原始毒力株及变异株，所用引物组合分别是F1/UR、F2/UR及F3/UR。敏感性检测结果显示，引物组合F1/UR、F2/UR及F3/UR对S197aa缺失株、原始毒力株及变异株的敏感性分别达到10-4倍稀释、10-3倍稀释及10-5倍稀释，具有较高的敏感性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式RT-PCR方法
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列（引物F1）
<400>1
atggtacgttgctagtgcgta21
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列（引物F2）
<400>2
tggtgaaatccagagtgtcaat22
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列（引物F3）
<400>3
ccagcttatatgcaggatggaa22
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列（引物UR）
<400>4
taccatgcaccaaagtggaatcat24

Claims (4)

1.同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合，其特征在于，所述引物组合由4个特异性引物组成，分别为：
上游引物F1：5’-ATGGTACGTTGCTAGTGCGTA-3’；
上游引物F2：5’-TGGTGAAATCCAGAGTGTCAAT-3’；
上游引物F3：5’-CCAGCTTATATGCAGGATGGAA-3’；
下游引物UR：5’-TACCATGCACCAAAGTGGAATCAT-3’。
2.同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取样品总RNA；
2）反转录得到样本cDNA；
3）利用权利要求1所述的引物F1和UR进行第一轮PCR扩增，区分出S197aa缺失株；
4）分别利用权利要求1所述的引物F2和UR、引物F3和UR进行第二轮PCR扩增，区分出原始毒力株和变异株。
3.根据权利要求2所述的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，其特征在于，所述步骤3）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl22.5μl、dNTP1μl、权利要求1所述的上游引物F1和下游引物UR各1μl、TaqDNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃35秒、60℃35秒、72℃30秒，共30个循环，最后72℃延伸1分钟。
4.根据权利要求2所述的同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒的通用型半套式RT-PCR方法，其特征在于，所述步骤4）中，PCR反应体系为25μl，内含PCR缓冲液5μl、MgCl22.5μl、dNTP1μl、权利要求1所述的上游引物F2和下游引物UR、上游引物F3和下游引物UR各1μl、TaqDNA聚合酶0.5μl、无菌水11μl和cDNA模板3μl；PCR反应条件为95℃预变性2分钟，然后95℃20秒、55℃20秒、72℃15秒，共25个循环，最后72℃延伸1分钟。
CN201510901924.3A 2015-12-09 2015-12-09 同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式rt-pcr方法 Active CN105400782B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510901924.3A CN105400782B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式rt-pcr方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510901924.3A CN105400782B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式rt-pcr方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105400782A true CN105400782A (zh) 2016-03-16
CN105400782B CN105400782B (zh) 2018-09-07

Family

ID=55466543

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510901924.3A Active CN105400782B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式rt-pcr方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105400782B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109735661A (zh) * 2019-03-07 2019-05-10 长江大学 一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式pcr检测方法
CN116987823A (zh) * 2023-08-01 2023-11-03 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种鉴别猪暂时热病毒的半套式rt-pcr检测引物组、试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101270381A (zh) * 2008-05-14 2008-09-24 肖水清 一种口腔致病菌的多重pcr快速检测方法
CN102399872A (zh) * 2011-10-27 2012-04-04 苏州科贝生物技术有限公司 一种检测K-ras基因突变的方法及试剂盒
EP2565280A2 (en) * 2008-09-30 2013-03-06 Abbott Laboratories Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101270381A (zh) * 2008-05-14 2008-09-24 肖水清 一种口腔致病菌的多重pcr快速检测方法
EP2565280A2 (en) * 2008-09-30 2013-03-06 Abbott Laboratories Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples
CN102399872A (zh) * 2011-10-27 2012-04-04 苏州科贝生物技术有限公司 一种检测K-ras基因突变的方法及试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TOMOICHIRO OKA等: "Cell culture isolation and sequence analysis of genetically diverse US porcine epidemic diarrhea virus strains including a novel strain with a large deletion in the spike gene", 《VETERINARY MICROBIOLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109735661A (zh) * 2019-03-07 2019-05-10 长江大学 一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式pcr检测方法
CN116987823A (zh) * 2023-08-01 2023-11-03 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种鉴别猪暂时热病毒的半套式rt-pcr检测引物组、试剂盒及其应用
CN116987823B (zh) * 2023-08-01 2024-04-23 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种鉴别猪暂时热病毒的半套式rt-pcr检测引物组、试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105400782B (zh) 2018-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chaouch Loop‐mediated isothermal amplification (LAMP): an effective molecular point‐of‐care technique for the rapid diagnosis of coronavirus SARS‐CoV‐2
Ding et al. Development of a multiplex RT‐PCR for the detection of major diarrhoeal viruses in pig herds in China
Fan et al. Clinical validation of two recombinase-based isothermal amplification assays (RPA/RAA) for the rapid detection of African swine fever virus
Loeffelholz et al. Comparison of the FilmArray Respiratory Panel and Prodesse real-time PCR assays for detection of respiratory pathogens
Gutiérrez-Aguirre et al. Sensitive detection of multiple rotavirus genotypes with a single reverse transcription-real-time quantitative PCR assay
Reijans et al. RespiFinder: a new multiparameter test to differentially identify fifteen respiratory viruses
CN104561377A (zh) 呼吸系统常见病原体的实时荧光多重pcr快速检测试剂盒
García‐Arroyo et al. Benefits and drawbacks of molecular techniques for diagnosis of viral respiratory infections. Experience with two multiplex PCR assays
Huang et al. Detection of new bunyavirus rna by reverse transcription–loop-mediated isothermal amplification
CN104726566A (zh) 多重pcr检测肠道新发原虫试剂盒及检测方法
CN105671210A (zh) 基于lamp技术检测李痘病毒的引物、试剂盒及检测方法
WO2016179509A1 (en) Improved compositions and methods for detection of viruses
KR20160053214A (ko) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법
Xu et al. Rapid detection of measles virus using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification coupled with a disposable lateral flow device
CN103210093B (zh) 一种检测消化道病原体的方法
CN105400782A (zh) 同时鉴定三种猪流行性腹泻病毒毒株的引物组合和通用型半套式rt-pcr方法
Hou et al. Rapid detection of bovine viral diarrhea virus using recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick assays in bulk milk/Brzo otkrivanje uzrocnika virusnog proljeva goveda u mlijeku iz spremnika pomocu kombinacije metoda umnozene rekombinazne polimeraze i test-traka za" lateral flow" analizu
CN108060272A (zh) 一种快速区分猪德尔塔冠状病毒和猪嵴病毒的多重pcr检测引物组及试剂盒
CN104099430A (zh) H7n9亚型禽流感病毒诊断环介导等温扩增试剂盒及使用方法
CN108060271B (zh) 基于环介导的等温扩增登革热病毒检测方法
Zandi et al. Partial sequence conservation of SARS‐CoV‐2 NSP‐2, NSP‐12, and Spike in stool samples from Abadan, Iran
Zhang et al. Rapid and sensitive detection of PRRSV by a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay
Alves et al. Clinical validation of colorimetric RT-LAMP, a fast, highly sensitive and specific COVID-19 molecular diagnostic tool that is robust to detect SARS-CoV-2 variants of concern
Huang et al. A novel real-time multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction for the detection of HIV-1 RNA by using dual-specific armored RNA as internal control
CN105567867B (zh) 人类免疫缺陷病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant