CN107974513A - 一种基于rpa的牛病毒性腹泻病毒检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于rpa的牛病毒性腹泻病毒检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于检测牛病毒性腹泻病毒的引物对，所述引物对为：UTR‑F：5’‑GAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAWA‑3’；UTR‑R：5’‑GGYYTCTGCWRCACCCTATCAGGCTGTRTYCRT‑3’；其中，W、Y、R为简并碱基，W为A或T，Y为C或T，R为A或G。本发明的RPA引物对可以有效扩增靶基因，特异性高，灵敏度为6×103copies/μl。本发明的RPA检测方法可以广泛应用于畜牧养殖业中牛腹泻病的诊断及BVDV病原的检测，在牛、猪、骆驼等养殖业及血清行业健康发展中具有重大意义。

Description

一种基于RPA的牛病毒性腹泻病毒检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种病毒检测试剂盒，特别是一种从动物组织或血液样品中检测其是否带有牛病毒性腹泻病毒的试剂盒。更确切讲，本发明是利用重组酶聚合反应(RPA)而研发的从动物组织或血液样品中进行检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的检测试剂盒。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV)，又称为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease Virus，BVD-MDV)，是一种世界范围广泛分布的危害动物健康的重要病原体。越来越多的研究表明，易感动物除牛外，绵羊、山羊、鹿、骆驼及其他野生反刍动物也是BVDV的易感宿主。BVDV引起的临床症状，主要包括牛病毒性腹泻、急慢性黏膜病、免疫耐受和持续性感染、免疫抑制、繁殖障碍、血小板减少和出血症等，致病机理复杂。由于缺乏有效的防控技术，BVDV在全球范围内普遍流行，是造成全球乳/牛业经济损失的重要病原。近年来，BVDV疫情呈现再次爆发趋势，给畜牧业和人类健康带来了严重危害。
BVDV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，与羊边界病毒(Border disease virus,BDV)及猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)同属黄病毒科瘟病毒属。近年来，通过对该病毒属成员的核苷酸序列遗传多态性和病毒蛋白产物功能和结构特点方面的深入研究，证明它们在基因组结构和抗原性方面有很高的相似性。BVDV基因组全长大约12.5kb，整个基因组由5’非翻译区(5′untranslated region,5′UTR)、一个大的开放阅读框(open reading frame,ORF)、3’非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)组成。ORF编码区编码一条长约4000个氨基酸的多聚蛋白前体多肽链，并由细胞和病毒基因编码的蛋白酶在翻译时和翻译后进行加工，至少生成12种成熟的蛋白质，它们在基因组上的位置从N端到C端依次为：NH2-Npro-capsid-Erns-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH。其中Capsid、Erns、E1和E2为BVDV的结构蛋白，构成BVDV的衣壳和囊膜，其余8种为病毒的非结构蛋白，在病毒的成熟和基因复制中发挥重要的调节功能。
目前，国内外检测、诊断BVDV的方法很多，常用的检测方法有病毒分离培养、中和试验、酶联免疫吸附试验、RT-PCR等，存在费时费力、准确性不高、非特异性反应或敏感性低等缺点。常规RT-PCR检测虽然提高了诊断的特异性，但敏感性不足、只能进行半定量或定性分析、在进行大量样品检测时易污染。实时荧光定量RT-PCR技术虽具有灵敏度高、重复性好、高通量性等优点，但存在易出现假阳性及设备要求高等缺点，不易在基层推广。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种病毒检测试剂盒，该试剂盒是利用重组酶聚合反应(RPA)而研发的从动物组织或血液样品中进行检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的检测试剂盒。
本发明的第一个目的是提供用于检测牛病毒性腹泻病毒的引物对，所述引物对为：
UTR-F：5’-GAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAWA-3’
UTR-R：5’-GGYYTCTGCWRCACCCTATCAGGCTGTRTYCRT-3’；
其中，W、Y、R为简并碱基，W为A或T，Y为C或T，R为A或G。
本发明的第二个目的是提供用于检测牛病毒性腹泻病毒的重组酶聚合酶扩增试剂，所述试剂包括干粉溶解缓冲液、醋酸镁和权利要求1所述的引物对。
本发明的第三个目的是提供用于检测牛病毒性腹泻病毒的重组酶聚合酶扩增试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对或权利要求1所述的扩增试剂。
作为优选，所述试剂盒还包括阳性对照；所述阳性对照为含有序列表中SEQ IDNo.2所示DNA片段的重组质粒。
在本发明中，所述阳性对照具体为将序列表中SEQ ID No.2所示DNA片段与PMD18-T质粒连接后得到的重组质粒。
本发明的第四个目的是提供所述的引物对、所述的检测试剂或所述的试剂盒在如下任一中的应用：
(1)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测牛病毒性腹泻病毒；
(2)制备用于检测或辅助检测牛病毒性腹泻病毒的产品；
(3)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染牛病毒性腹泻病毒；
(4)制备用于检测或辅助检测待测动物样品是否感染牛病毒性腹泻病毒的产品；
(5)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测病毒是否为牛病毒性腹泻病毒；
(6)制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为牛病毒性腹泻病毒的产品。
本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测动物样品是否感染牛病毒性腹泻病毒的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：
(1)从待测动物样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；
(2)按照下述方法中的一种确定待测动物样品是否感染牛病毒性腹泻病毒：
a、将扩增产物用SYBR Green染料染色，在UV365下检测，具有绿色荧光则待测动物样品感染牛病毒性腹泻病毒，而没有绿色荧光的则待测动物样品没有感染牛病毒性腹泻病毒；
b、若扩增产物含有246bp的DNA片段，则待测动物样品感染牛病毒性腹泻病毒，若无则待测动物样品没有感染牛病毒性腹泻病毒。
本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为牛病毒性腹泻病毒的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：
(1)从待测病毒中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；
(2)按照下述方法中的一种确定待测病毒是否为牛病毒性腹泻病毒：
a、将扩增产物用SYBR Green染料染色，在UV365下检测，具有绿色荧光则待测病毒为牛病毒性腹泻病毒，而没有绿色荧光的则待测病毒不是牛病毒性腹泻病毒；
b、若扩增产物含有246bp的DNA片段，则待测病毒为牛病毒性腹泻病毒，若无则待测病毒不是牛病毒性腹泻病毒。
在上述两种方法中，所述246bp的DNA片段为序列表中SEQ ID No.1所述DNA片段。
在实际应用中，判断扩增产物是否含有246bp的DNA片段时，可通过将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，看电泳图谱上是否含有大小为246bp的目的条带：电泳图谱上含有246bp的目的条带，则扩增产物中含有相应的246bp的DNA片段。
在实际应用中，判断扩增产物中是否含有序列表中SEQ ID No.1所述DNA片段，可通过对扩增产物进行核苷酸序列测定进行判断。
在上述两种方法中，进行重组酶聚合酶扩增时，反应条件为在37℃-39℃条件下，反应20-40min。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明检测牛病毒性腹泻病毒的方法操作简单，仪器要求低，可用于实验室快速检测，为牛病毒性腹泻病毒的防控工作提供一种新的可靠的技术支持。
(2)本发明的RPA简并引物对可以有效扩增靶基因，特异性高，灵敏度为6×103copies/μl。
(3)本发明的RPA检测方法可以广泛应用于畜牧养殖业中牛腹泻病的诊断及BVDV病原的检测，在牛、猪、骆驼等养殖业及血清行业健康发展中具有重大意义。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为应用RT-PCR方法获得的UTR目的片段。
图2为应用RPA检测BVDV的灵敏度实验结果。
图3为应用本发明的RPA检测BVDV方法特异性检测结果。
图4为应用SYBR Green染料检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
牛病毒性腹泻病毒的RPA检测试剂盒及检测方法
(一)牛病毒性腹泻病毒的RPA检测简并引物的筛选
为获得具有高效、准确、快速的一种检测BVDV病毒的方法，申请人通过比对BVDV不同株，根据GenBack中登录的BVDV的序列，其中14株BVDV I型，登录号分别为NC_001461、U86600、U86599、AF091605、AF268278、AB078952、AB078950、M96687、AJ585412、M96751、AF526381、DQ088995、EF101530和U63479；7株BVDV II型，登录号分别为AF002227、AY149216、AF502399、AY149215、FJ527854、GQ888686和AB567658。使用clustalx软件对上述序列进行比对分析，在其5’非翻译区设计一组特异性简并引物。
经筛选，得到简并引物的核苷酸序列为：
UTR-F：5’-GAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAWA-3’
UTR-R：5’-GGYYTCTGCWRCACCCTATCAGGCTGTRTYCRT-3’；
其中，W、Y、R为简并碱基，W为A或T，Y为C或T，R为A或G。
(二)牛病毒性腹泻病毒的RPA检测试剂盒及检测方法
(1)牛病毒性腹泻病毒的RPA检测试剂盒中各组分及含量：
其中，Rehydration Buffer为英国TwistDX公司的Twistamp Basic ImprovedFormulation试剂盒。
(2)牛病毒性腹泻病毒的RPA检测方法
a、牛病毒性腹泻病毒RNA的提取：取107个牛组织细胞，加入500μl Trizol冰上放置5min；加入100μl氯仿，吹打混匀，冰上放置5min，4℃，12000rpm，离心15min，取上层水相加入新的预冷的EP管中；加入250μl异丙醇，吹打混匀，冰上放置5min，4℃，12000rpm，离心10min，弃上清；加入500μl 75％乙醇，吹打混匀，4℃，8000rpm，离心5min，弃上清；冰上放置2-3min，加入50μl RNase free H2O,-80℃保存。
b、RNA反转录为cDNA
根据反转录试剂盒操作。
c、RPA鉴定：利用特异性引物UTR-F和UTR-R，进行RPA扩增：
配制以下RPA反应溶液：
将上述试剂加入一个PCR管中，摇匀。将上述的47.5μl反应液移至试剂盒中的反应管中，混匀，使其中的白色状物体完全混悬。加入2.5μlMg2+，混匀。反应开始。在39℃条件下反应5min。反应5min后，混匀，39℃条件下反应15min。
d、产物鉴定
按照以下两种方法中的一种进行产物鉴定：
将反应产物染色后在紫外灯下观察，根据反应产物在紫外光下是否产生荧光确定被检样品是否带有牛病毒性腹泻病毒，具体为：
取5μl RPA扩增产物于PCR管中，加入1μl稀释过100倍的SYBR Green染料，在UV365下检测，具有绿色荧光的即为BVDV阳性，而没有绿色荧光的则为阴性。
或者
将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据反应产物是否出现特定条带确定被检样品是否带有牛病毒性腹泻病毒，具体为：
取10μl RPA扩增产物用于琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果中如出现大小为246bp的条带即为BVDV阳性，若无则为阴性。
实施例2
牛病毒性腹泻病毒的RPA检测方法的灵敏度分析
(1)标准质粒构建
通过引物用RT-PCR方法获得牛病毒性腹泻病毒目的片段(图1所示，246bp)，上游简并引物为：UTR-F：5’-GAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAWA-3’，下游简并引物为：UTR-R：5’-GGYYTCTGCWRCACCCTATCAGGCTGTRTYCRT-3’，目的片段核苷酸序列为：gaggctagccatgcccttagtaggactagcatagcgaggggggtagcaacagtggtgagttcgttggatggcttaagccctgagtacagggtagtcgtcagtggttcgacgccttaacatgaaggtctcgagatgccacgtggacgagggcacgcccaaagcacatcttagcccgagcgggggtcgctcggacgaaaacagtttgatcaactgctacgaatacagcctgatagggtgctgcagagg。
图1为应用RT-PCR方法获得的UTR目的片段。M为marker，1和2为RT-PCR结果，3为阴性对照。
将目的片段插入PMD18-T载体中，构建标准质粒PMD18-T-UTR，使用质粒小量提取试剂盒提取PMD18-T-UTR，测浓度(浓度为162μg/ml)、测序，-20℃保存。
(2)标准质粒倍比稀释
根据以下公式计算出标准品的拷贝数为6×109copies/μl，将该质粒作为标准质粒母液。
拷贝数copies/μl＝6.02×1023×(浓度)ng/μl×10-9/DNA length×660。
将上述标准品梯度稀释，分别稀释成6×109copies/μl、6×108copies/μl、
6×107copies/μl、6×106copies/μl、6×105copies/μl、6×104copies/μl、
6×103copies/μl、6×102copies/μl、6×101copies/μl、6×100copies/μl。
(3)应用本发明的RPA检测方法进行检测
使用本发明的RPA检测方法对系列浓度标准品进行RPA检测，体系为50μl。RPA试剂盒包括干粉溶解缓冲液(Rehydration buffer)29.5μl，正向简并引物(Forward primer，10μM)2.4μl，反向简并引物(Reserve primer 10μM)2.4μl，模板3.2μl，无RNA酶ddH2O 10.0μl，醋酸镁2.5μl。RPA检测条件为：在39℃条件下，反应20min。同时以水作为阴性对照。
(4)进行琼脂糖凝胶电泳，检测本发明的RPA检测方法的灵敏度。结果见图2。
图2为应用RPA检测BVDV的灵敏度实验结果。其中，M为marker，1-10分别为将PMD18-T-UTR梯度稀释6×109-6×100，11为阴性对照。
由图2可以看出，本发明RPA检测方法的灵敏度为6×103copies/μl。
实施例3
牛病毒性腹泻病毒的RPA检测试剂盒的特异性分析
选取牛源病毒4种：牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒和呼肠孤病毒；选取4株牛病毒性腹泻病毒I型：C24V、GSTZ、Av69和S183；选取1株牛病毒性腹泻病毒II型：BVDV-2。
应用本发明的RPA检测试剂盒和检测方法分别对上述几种病原进行检测，同时以实施例2中的标准品为阳性对照，以水为阴性对照。检测结果见图3。
图3为应用本发明的RPA检测BVDV方法特异性检测结果。其中，1和2阴性对照，3-6分别为牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒和呼肠孤病毒，7-11分别为BVDV C24V、BVDVGSTZ、BVDV Av69、BVDV S183、BVDV-II。
由图3可以看出，7-11泳道出现大小为246bp的条带，而3-6泳道没有出现条带。故本发明的RPA试剂盒和检测方法能够特异性的检测牛病毒性腹泻病毒，对于牛病毒性腹泻病毒I型和II型均能检测。
实施例4
应用SYBR Green染料，检测牛病毒性腹泻病毒的RPA检测试剂盒的灵敏性和特异性。
选取实施例2制备的质粒标准品6×108copies/μl、6×107copies/μl、6×106copies/μl、6×105copies/μl、6×104copies/μl、6×103copies/μl、6×102copies/μl、6×101copies/μl、6×100copies/μl，选取牛源病毒4种：牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒和呼肠孤病毒，以水为阴性对照。应用本发明的RPA检测试剂盒和检测方法进行检测。
取10μl反应液加入SYBR Green染料，在UV365下检测，结果见图4.
图4为应用SYBR Green染料检测结果。其中，1-9为稀释拷贝数6×109-6×100copies/μl，10-13为牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒和呼肠孤病毒，14-16为阴性对照。
图4可以看出1-6有荧光，可以检测到6×103copies/μl，7-16没有荧光。
实施例5
动物样品中牛病毒性腹泻病毒的RPA检测
随机采样60份牛血清或牛组织细胞，采用Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，进行RPA扩增，同时以实施例2中的标准品为阳性对照，以水为阴性对照。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
同时使用现有技术中的PCR和ELISA检测BVDV方法进行检测。
RPA扩增方法为：
按照下述配方配制RPA反应溶液：
将上述试剂加入一个PCR管中，摇匀。将上述的47.5μl反应液移至试剂盒中的反应管中，混匀，使其中的白色状物体完全混悬。加入2.5μl Mg2+，混匀。反应开始。在39℃条件下反应5min。反应5min后，混匀。在39℃条件下反应15min即可。
RPA产物检测：使用琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果中如出现大小为246bp的条带即为BVDV阳性，若无则为阴性。检测结果见表1。
表1应用不同方法检测BVDV的结果
由表1可知，本发明的RPA方法与现有技术中的PCR和ELISA检测结果一致，故本发明的RPA检测试剂盒和检测方法能够用于BVDV的检测。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西北民族大学
<120> 一种基于RPA的牛病毒性腹泻病毒检测试剂盒及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 246
<212> DNA
<213> 人工序列(Bovine Viral Diarrhea virus)
<400> 1
gaggctagcc atgcccttag taggactagc atagcgaggg gggtagcaac agtggtgagt 60
tcgttggatg gcttaagccc tgagtacagg gtagtcgtca gtggttcgac gccttaacat 120
gaaggtctcg agatgccacg tggacgaggg cacgcccaaa gcacatctta gcccgagcgg 180
gggtcgctcg gacgaaaaca gtttgatcaa ctgctacgaa tacagcctga tagggtgctg 240
cagagg 246

Claims (9)

1.用于检测牛病毒性腹泻病毒的引物对，其特征在于：所述引物对为：
UTR-F：5’-GAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCAWA-3’
UTR-R：5’-GGYYTCTGCWRCACCCTATCAGGCTGTRTYCRT-3’；
其中，W、Y、R为简并碱基，W为A或T，Y为C或T，R为A或G。
2.用于检测牛病毒性腹泻病毒的重组酶聚合酶扩增试剂，其特征在于：所述扩增试剂包括干粉溶解缓冲液、醋酸镁和权利要求1所述的引物对。
3.用于检测牛病毒性腹泻病毒的重组酶聚合酶扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对或权利要求1所述的扩增试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照；所述阳性对照为含有序列表中SEQ ID No.2所示DNA片段的重组质粒。
5.权利要求1所述的引物对、权利要求2所述的检测试剂或权利要求3或4所述的试剂盒在如下任一中的应用：
(1)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测牛病毒性腹泻病毒；
(2)制备用于检测或辅助检测牛病毒性腹泻病毒的产品；
(3)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染牛病毒性腹泻病毒；
(4)制备用于检测或辅助检测待测动物样品是否感染牛病毒性腹泻病毒的产品；
(5)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测病毒是否为牛病毒性腹泻病毒；
(6)制备用于检测或辅助检测待测病毒是否为牛病毒性腹泻病毒的产品。
6.一种检测或辅助检测待测动物样品是否感染牛病毒性腹泻病毒的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：包括以下步骤：
(1)从待测动物样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；
(2)按照下述方法中的一种确定待测动物样品是否感染牛病毒性腹泻病毒：
a、将扩增产物用SYBR Green染料染色，在UV365下检测，具有绿色荧光则待测动物样品感染牛病毒性腹泻病毒，而没有绿色荧光的则待测动物样品没有感染牛病毒性腹泻病毒；
b、若扩增产物含有246bp的DNA片段，则待测动物样品感染牛病毒性腹泻病毒，若无则待测动物样品没有感染牛病毒性腹泻病毒。
7.一种检测或辅助检测待测病毒是否为牛病毒性腹泻病毒的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：包括以下步骤：
(1)从待测病毒中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行重组酶聚合酶扩增，得到扩增产物；
(2)按照下述方法中的一种确定待测病毒是否为牛病毒性腹泻病毒：
a、将扩增产物用SYBR Green染料染色，在UV365下检测，具有绿色荧光则待测病毒为牛病毒性腹泻病毒，而没有绿色荧光的则待测病毒不是牛病毒性腹泻病毒；
b、若扩增产物含有246bp的DNA片段，则待测病毒为牛病毒性腹泻病毒，若无则待测病毒不是牛病毒性腹泻病毒。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述246bp的DNA片段为序列表中SEQID No.1所述DNA片段。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：进行重组酶聚合酶扩增时，反应条件为在37℃-39℃条件下，反应20-40min。
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