CN109295259A - 一种基于rpa技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法 - Google Patents

一种基于rpa技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109295259A
CN109295259A CN201811301320.5A CN201811301320A CN109295259A CN 109295259 A CN109295259 A CN 109295259A CN 201811301320 A CN201811301320 A CN 201811301320A CN 109295259 A CN109295259 A CN 109295259A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rpa
river crab
bunyavirus
primer
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811301320.5A
Other languages
English (en)
Inventor
沈怀舜
臧亚南
胡亚成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Original Assignee
Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences filed Critical Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority to CN201811301320.5A priority Critical patent/CN109295259A/zh
Publication of CN109295259A publication Critical patent/CN109295259A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法，属于水产动物病毒的分子检测技术领域，所述引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，用于检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒。以该引物对河蟹待测样本进行检测，若RPA扩增产物含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中含有了布尼亚病毒。该RPA引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。本发明提供了一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的方法，具有操作简单，稳定性好，为有效检测和鉴定河蟹布尼亚病毒提供一种成本低、快速、特异性强的现场诊断方法。

Description

一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测 方法
技术领域
本发明属于水产动物病毒的分子检测技术领域，涉及到一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法。
背景技术
河蟹学名中华绒螯蟹，又名大闸蟹，隶属于节肢动物门、甲壳纲、绒螯蟹属，河蟹适应性强，分布较广，主要分布于我国沿海诸省各大水系，由此形成长江水系、辽河水系、瓯江水系和闽江水系4个种群。河蟹是洄游性甲壳类动物，经济价值较高，河蟹肉质细嫩，蟹黄蟹膏不仅口感鲜美而且营养丰富，历来被人们视为水产珍宝，是世界各国水产增养殖的重要对象。
近年来河蟹市场需求量日益增加，其养殖规模不断扩大，养殖环境也越来越恶劣，病害发生越来越多。河蟹已知的病毒包括：呼肠孤病毒(EsRV816，905及2012)、布尼亚病毒(EsBV)、及白斑综合症病毒(WSSV)等几类。这些病毒都具有垂直传播的特性。这些病毒在一定条件下可以使河蟹致病，甚至致死。为河蟹养殖经济带来巨大的损伤。
其中，河蟹布尼亚病毒(Bunia virus)是一类具球形、有包膜和分节段负链RNA病毒，表面有糖蛋白突起，能自然感染于河蟹等节肢动物，从而引起河蟹传染病。河蟹布尼亚病毒是河蟹颤抖病的病原之一。该病毒造成河蟹活动力下降，饮食减少，严重者可导致河蟹死亡。目前，针对该病毒尚无有效的治疗方法，病毒的早期准确检测对疾病的预防和控制尤为重要，因此建立一种简便、快速、灵敏、准确的病毒检测方法对病毒病的防控具有重要意义。
目前应用较多病毒检测方法有聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR和荧光定量PCR等技术。但这些方法均需要昂贵的PCR仪或特殊仪器设备和专业的试验场地，同时PCR扩增的过程，操作复杂繁琐、耗时长，时效性低，并且需要具有一定分子生物学基础及操作技术的专业人员才能完成，不能满足水产养殖现场检测诊断的需求。
重组酶介导等温扩增(Recombinase Polymerase Amlification，RPA)技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，RPA技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的PCR技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于RPA技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法
技术方案
本发明第一个目的是提供一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物，所述引物包括上游引物RPA ESBV-1F和下游引物RPA ESBV-1R，所述上游引物RPA ESBV-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物RPA ESBV-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明第二个目的是提供上述引物在检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒中的应用。
本发明第三个目的是提供一种利用基于RPA试剂盒技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的RPA试剂盒，所述RPA试剂盒包括权利要求1所述的引物。
本发明第四个目的是提供一种利用基于RPA试剂盒技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的方法，具体包括以下步骤：
(1)cDNA制备：从待测河蟹肝胰脏或待测病原菌其他河蟹组织中提取病毒RNA，然后反转录成cDNA备用；
(2)RPA扩增及琼脂糖凝胶电泳：以步骤(1)中制备的cDNA作为模板，以权利要求3或4所述用权利要求3所述的RPA试剂盒内的试剂进行RPA扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物大小；
(3)结果判定：若所述RPA扩增产物含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中含有了布尼亚病毒，若所述RPA扩增产物不含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中不含有布尼亚病毒。
所述步骤(2)RPA扩增及琼脂糖凝胶电泳的具体步骤如下所示：
(1)配制47.5μl的混合反应液，包括29.5μl Rehydration Buffer,10μM的上游引物2.4μl，10μM的下游引物2.4μl，模板cDNA 1μl和dH2O 12.5μl；
(2)混合液混匀后转移至含有冻干酶粉的反应单元管中，用移液枪混匀，使管中颗粒全部悬浮，加入280mM醋酸镁溶液2.5μl，盖上管盖，快速混匀，在39℃金属浴反应4min，4min结束后，取出，剧烈翻转8-10次，混匀，重新放入金属浴上反应40min；RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1∶1)溶液，充分混匀后，11,000×g离心3min，取上清液10μL于1.0％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳检测电压180V，电流250A，检测时间20min，在凝胶成像系统上观察结果。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
1、本发明所设计的RPA检测专用引物对长度在30-35bp，比一般的PCR检测引物长。引物过短会降低重组率，影响RPA反应的扩增速度和检测灵敏度。
2、本发明提供了一组使用于河蟹布尼亚病毒RPA检测的引物对，将该引物对应用于河蟹布尼亚病毒的RPA检测中，具有简单便捷，快速检测，特异性强，灵敏度高等优点。
3、本发明检测方法无需对病毒进行分离纯化及培养，反应在39℃左右的恒温条件下即可实现模板核酸的扩增，也不需要通过高低温循坏实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备，非常适合基层对病原菌的快速检测需要。
4、本发明用于河蟹组织中布尼亚病毒的快速检测，RPA检测时间仅需40min，从病毒提取到获得检测结果的所有过程只需约2.5h即可完成，是一种用于检测河蟹感染布尼亚病毒的有效手段。
5、本发明检测方法用于河蟹发病前期检测及病害预测预防，对于确定防治期、有效防治病害具有非常重要的意义。
附图说明
图1是RPA引物扩增凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker500，1为引物RPA ESBV-1R-1F，2为RPA ESBV-2R-2F，3为阴性对照，4为控制对照。
图2是不同RPA反应温度下的凝胶电泳图。其中，泳道为Marker500、1为37℃、2为39℃、3为40℃、4为41℃、5为42℃。
图3是不同RPA反应时间下的凝胶电泳图。其中，泳道M为Marker500、1为10min、2为20min、3为30min、4为40min、5为50min。
图4是RPA与PCR反应灵敏度检测凝胶电泳图。其中，A为RPA反应、B为PCR反应；泳道为Marker500、1为1400pg/μL、2为100pg/μL、3为10pg/μL、4为1pg/μL、5为100fg/μL。
图5是RPA检测特异性凝胶电泳图。其中，M为Marker500、1为河蟹布尼亚病毒(ESBV)、2为河蟹呼肠孤病毒(ESRV)、3为河蟹呼肠孤-816病毒(ESRV-816)、4为河蟹呼肠孤-905病毒(ESRV-905)、5为河蟹诺达病毒(ESNV)、6为对虾白斑病毒(WWSV)、7为阴性对照。
具体实施方式
下列实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
若未特别指明，以下实施例均照常规实验条件进行操作，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例中使用RPA试剂盒为Basic试剂盒，购自英国TwistDxInc公司；其中，能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶是以冻干粉状态存在于试剂盒所提供的RPA反应管中，使用时直接用试剂盒所带的反应缓冲液稀释。整个RPA反应时在RPA反应管中进行。
实施例1
根据河蟹布尼亚病毒的序列，使用Primer Premier 5.0设计了一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物。所述引物包括上游引物RPA ESBV-1F和下游引物RPAESBV-1R，所述上游引物RPA ESBV-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物RPA ESBV-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
采用TRIzol法，从已知感染布尼亚病毒的河蟹中提取病毒RNA并反转录为cDNA。具体操作过程如下。
河蟹肝胰腺取适量(0.02g-0.05g)放入EP管中，并在管中放入小磁珠(每个EP管中加入2颗)，加入RNA Plus 1ml，放入匀浆机中2-3min，结束后静置5分钟；
将样品放入到4℃冷冻离心机内，12000r pm离心5min，取上清液600μL；
加200μL氯仿，大力摇晃15s，室温静置2-3min；
4℃，12000r pm离心15min，取上清液200μL；
加入500μL 100％异丙醇，上下颠倒5次混匀，室温放置10min；
4℃，12000r pm离心10min，去除上清液；
用1ml 75％乙醇洗涤RNA颗粒，用枪头吹打RNA颗粒，使洗涤充分；
4℃，7500r pm离心5min,去除上清液，重复上述步骤；
最后，向EP管中加入12-20μL DEPC水。
使用HiFiScript cDNA Synthesis Kit(Beijing Cwbiotech Company,Beijing,China)将提取的RNA反转录为cDNA。
实施例3
以实施例2得到的cDNA为模板，采用实施例1设计的一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物，在下述反应体系中进行RPA反应。
样品检测：配制47.5μl的混合反应液，包括29.5μl Rehydration Buffer,10μM的上游引物2.4μl，10μM的下游引物2.4μl，模板cDNA 1μl和ddH2O 12.5μl。混合液混匀后转移至含有冻干酶粉的反应单元管中，用移液枪混匀，使管中颗粒全部悬浮，加入280mM醋酸镁溶液2.5μl，盖上管盖，快速混匀，在37℃金属浴反应4min，4min结束后，取出，剧烈翻转8-10次，混匀，重新放入金属浴上反应30min。
阴性对照：操作步骤同样品检测，将1μl模板cDNA改为加入1μl灭菌ddH2O。
控制对照：操作步骤同样品检测，将将1μl模板cDNA改为加入1μl控制样cDNA。
RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1∶1)溶液，充分混匀后11,000×g离心3min，取上清液10μL于1.0％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上，根据条带大小判断结果。
电泳检测结果如图1所示。以实施例1设计的一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物进行RPA扩增反应后，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示该引物对能检测到大小为160bp的目标片段(泳道1)，目标条带清晰且没有杂带，能有效检测出布尼亚病毒。
泳道3的阴性对照未扩增出条带，泳道4的控制对照出现控制组的目标条带。
实施例4
采用实施例1设计的一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物，以实施例2提取的DNA为模板，按照实施例3反应体系进行RPA反应，并设定反应温度分别为37℃、39℃、40℃、41℃和42℃，检测不同温度对反应结果的影响。实验结果如图2所示，表明反应温度为39℃时条带明亮清析，因此最适宜的反应温度为39℃。
实施例5
采用实施例1设计的一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物，以实施例2提取的DNA为模板，按照实施例3反应体系进行RPA反应，设定反应温度为39℃，反应时间分别为10min、20min、30min、40min和50min，检测不同时间对反应结果的影响。实验结果如图3所示，表明最适宜的反应时间为40min。
实施例6
使用Nanodro 2000微量分光光度计测定出实施例2提取DNA的浓度为1400pg/μL。
将其依次稀释为100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL和100fg/μL，根据上述实施例采用的引物、反应体系和反应条件，对不同浓度的DNA进行RPA和PCR检测。
实验结果如图4所示，结果表明RPA检测浓度为100fg/μL，而PCR检测浓度为100fg/μL时仍能看到目标条带，说明PCR检测的灵敏度与RPA相差不大。但PCR检测过程需要2.5h，而RPA检测时间仅需40min，且不需要PCR仪等昂贵的仪器设备，操作程序简便，更有利在生产中推广应.
实施例7
为了验证本发明建立的一种基于RPA技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的方法对于河蟹布尼亚病毒的特异性，本实施例以多种不同病毒作为供试材料，提取病毒的RNA并反转录为cDNA，进行RPA反应。
选择ESRV、ESRV-816、ESRV-816、ESRV-905、ESNV、WWSV(提取DNA)进行特异性检测。
以上述六中病毒的cDNA，根据上述实施例1设计的引物，实施例4筛选出的反应温度和实施例5筛选出的反应时间，用实施例3方法进行RPA反应，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，所述检测条件为电压180V，电流250A，检测时间20min，检测RPA反应的特异性。若所述RPA扩增产物含有160bp的片段，则所述待测样品中含有布尼亚病毒，若所述RPA扩增产物不含有160bp的片段，则所述待测样品中不含有布尼亚病毒。
实验结果如图5所示，RPA扩增产物含有160bp的片段，而其他病毒cDNA扩增后在160bp位置均没有条带，该方法能特异性扩增出河蟹布尼亚病毒的目标片段，具有很好的特异性。
序列表
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 基于RPA技术的河蟹布尼亚病毒（ESBV）的检测方法及专用引物
<130> 2
<141> 2018-10-31
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctaagtctgt agtccataaa ctgactgagg 30
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctctcacagg tgtaccttct atattaatgt tcc 33

Claims (5)

1.一种基于RPA技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物RPA ESBV-1F和下游引物RPA ESBV-1R，所述上游引物RPA ESBV-1F的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述下游引物RPA ESBV-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种根据权利要求1所述引物在检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒中的应用。
3.一种基于RPA技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的RPA试剂盒，其特征在于：所述RPA试剂盒包括权利要求1所述的引物。
4.一种基于RPA技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的方法，具体包括以下步骤：
(1)cDNA制备：从待测河蟹肝胰脏或其他河蟹组织中提取病毒RNA，然后反转录成cDNA备用；
(2)RPA扩增及琼脂糖凝胶电泳：以步骤(1)中制备的cDNA作为模板，用权利要求3所述的RPA试剂盒进行RPA扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测RPA扩增产物大小；
(3)结果判定：若所述RPA扩增产物含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中含有了布尼亚病毒，若所述RPA扩增产物不含有大小为160bp的片段，则所述待测河蟹中不含有布尼亚病毒。
5.根据权利要求4所述的一种基于RPA技术检测或辅助检测河蟹布尼亚病毒的方法，其特征在于：
所述步骤(2)RPA扩增及琼脂糖凝胶电泳的具体步骤如下所示：
(1)配制47.5μl的混合反应液，包括29.5μl Rehydration Buffer,10μM的上游引物2.4μl，10μM的下游引物2.4μl，模板cDNA 1μl和dH2O 12.5μl；
(2)混合液混匀后转移至含有冻干酶粉的反应单元管中，用移液枪混匀，使管中颗粒全部悬浮，加入280mM醋酸镁溶液2.5μl，盖上管盖，快速混匀，在39℃金属浴反应4min，4min结束后，取出，剧烈翻转8-10次，混匀，重新放入金属浴上反应40min；RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1∶1)溶液，充分混匀后，11,000×g离心3min，取上清液10μL于1.0％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳检测电压180V，电流250A，检测时间20min，在凝胶成像系统上观察结果。
CN201811301320.5A 2018-11-02 2018-11-02 一种基于rpa技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法 Pending CN109295259A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811301320.5A CN109295259A (zh) 2018-11-02 2018-11-02 一种基于rpa技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811301320.5A CN109295259A (zh) 2018-11-02 2018-11-02 一种基于rpa技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109295259A true CN109295259A (zh) 2019-02-01

Family

ID=65145764

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811301320.5A Pending CN109295259A (zh) 2018-11-02 2018-11-02 一种基于rpa技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109295259A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102409109A (zh) * 2011-11-25 2012-04-11 浙江省疾病预防控制中心 新型布尼亚病毒荧光定量检测试剂盒及该病毒的检测方法
CN102477426A (zh) * 2010-11-26 2012-05-30 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种分离的核苷酸分子及在布尼亚病毒检测中的应用
CN104673933A (zh) * 2015-01-14 2015-06-03 浙江省疾病预防控制中心 新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及试剂盒
CN105063038A (zh) * 2015-09-01 2015-11-18 中华人民共和国伊犁出入境检验检疫局 一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号的rpa引物及试剂盒
CN107974513A (zh) * 2017-11-07 2018-05-01 西北民族大学 一种基于rpa的牛病毒性腹泻病毒检测试剂盒及其应用
CN108432675A (zh) * 2018-03-06 2018-08-24 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种中华绒螯蟹活体无损取样方法及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102477426A (zh) * 2010-11-26 2012-05-30 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种分离的核苷酸分子及在布尼亚病毒检测中的应用
CN102409109A (zh) * 2011-11-25 2012-04-11 浙江省疾病预防控制中心 新型布尼亚病毒荧光定量检测试剂盒及该病毒的检测方法
CN104673933A (zh) * 2015-01-14 2015-06-03 浙江省疾病预防控制中心 新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及试剂盒
CN105063038A (zh) * 2015-09-01 2015-11-18 中华人民共和国伊犁出入境检验检疫局 一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号的rpa引物及试剂盒
CN107974513A (zh) * 2017-11-07 2018-05-01 西北民族大学 一种基于rpa的牛病毒性腹泻病毒检测试剂盒及其应用
CN108432675A (zh) * 2018-03-06 2018-08-24 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种中华绒螯蟹活体无损取样方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
哈登楚日亚: "非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立", 《中国畜牧兽医2》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107245532B (zh) 一种鲫鱼冠状病毒hb93的数字rt-pcr检测引物及应用
CN110117677B (zh) 一种百香果黄瓜花叶病毒的pcr引物组合及检测方法
CN109234450B (zh) 一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-CPA检测引物及应用
CN104328222B (zh) 反转录pcr检测和分型登革病毒的试剂盒及其检测方法
CN109182536B (zh) 一种广地龙的环介导等温扩增检测引物及基于lamp技术鉴定广地龙的方法
CN104372104B (zh) 一种樟疫霉菌的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
CN110567951A (zh) 基于CRISPR-Cas12a技术的苹果茎沟病毒可视化检测体系及其检测方法
CN107201345B (zh) 一种鲫鱼冠状病毒hb93及rt‑pcr检测引物及应用
CN109735659A (zh) 一种利用rpa检测克氏原螯虾小rna病毒的引物及试剂盒与检测方法
CN104212915A (zh) 虾类偷死野田村病毒现场快速检测引物组及试剂盒
CN110283945A (zh) 大蒜病毒检测方法及引物
CN102146483B (zh) 甲鱼虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法和试剂盒
CN111635961B (zh) 锦鲤疱疹病毒检测试剂盒和检测方法
CN108384791A (zh) 一种北京库蠓的特异基因及其分子鉴定方法
CN107245533B (zh) 一种鲫鱼冠状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物及应用
CN107326101B (zh) 一种鲫鱼冠状病毒hb93的rt‑lamp检测引物及应用
CN109295259A (zh) 一种基于rpa技术用于检测河蟹布尼亚病毒的引物及检测方法
CN105296470A (zh) 一种阿胶及其衍生产品高纯度dna的提取试剂盒及其提取方法
CN102337356A (zh) 猪盖塔病病毒rt-pcr检测试剂盒及其应用
CN106566895B (zh) 一种同时检测鲤科疱疹病毒ι型、ⅱ型和ⅲ型的pcr引物、试剂盒及用途
CN112094854B (zh) 一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒
CN108866242A (zh) 用于鉴别不同血清型传染性支气管炎病毒活疫苗的半套式rt-pcr分型引物及试剂盒
CN104946796A (zh) 用于rt-lamp法检测番茄斑萎病毒的试剂盒及检测方法
CN108359745A (zh) 同步检测小麦矮缩病毒和小麦黄条纹病毒的双重rt-pcr方法
CN103215383A (zh) 辣椒轻斑驳病毒反转录-环介导等温扩增检测用引物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190201

RJ01 Rejection of invention patent application after publication