CN102146483B

CN102146483B - 甲鱼虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN102146483B
Application number: CN201010113166.6A
Authority: CN
Inventors: 何俊强; 刘宗晓; 郑晓聪; 刘荭; 高隆英; 兰文升
Original assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2030-02-10
Also published as: CN102146483A

Abstract

本发明公开了甲鱼虹彩病毒(STIV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法和试剂盒，其中所用的外引物分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列。本发明为甲鱼虹彩病毒的检测提供快速、敏感、特异的检测方法，可以进行病毒的现场即时检测，为甲鱼健康养殖及国际贸易的发展提供技术支持。

Description

甲鱼虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒的检测方法和检测试剂盒，特别是涉及甲鱼虹彩病毒(STIV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法和试剂盒。

背景技术

虹彩病毒(Iridovirus)是一类对鱼类、两栖类和爬行类水生动物具有广泛感染性的致病病原，由虹彩病毒所致疾病给世界水产养殖业造成了巨大的经济损失。近年来，许多国家相继报道了在患病鱼、蛙和龟等水生经济动物中分离到虹彩病毒。虹彩病毒科(Iridovirudae)分为5个属：虹彩病毒属(Iridovirus)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)、蛙病毒属(Ranavirus)和淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)、肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)(也称细胞肥大病毒属)。

甲鱼虹彩病毒(STIV)又称中华鳖病毒，属于虹彩病毒科蛙病毒属病毒。病毒呈典型的虹彩病毒形状，大小为直径120-160nm。病毒能在CO、CK、BF-2、EPC和FHM等细胞株上增殖，但不能在CHSE、R1、RTG-2、PG等细胞株中增殖。病毒的最适复制温度为25-30℃，病毒对氯仿、酸性条件(pH3)、碱性条件(pH10)以及高温(60℃，30min)敏感，IUDR(5-iodo-2-deoxyuridine)能抑制病毒的复制。病毒人工感染健康中华鳖，发病死亡率超过40％(Chenet al.，1999)。

甲鱼虹彩病毒的诊断方法有：细胞分离培养、电镜观察、免疫学方法、分子生物学等方法，各有优缺点。细胞分离培养被认为是病毒分离鉴定的黄金法则，可靠性强但操作时间较长：电镜观察在水生动物的病毒鉴定中一直扮演着非常重要和直观的角色，通过对感染病毒的细胞或组织(肝、脾、肾、脑等)电镜观察不但可以看到直接的包涵体和病毒的形态特征，对病毒进行初步的分类和诊断，同时，还可以通过对不同感染阶段的连续电镜观察，了解病毒在宿主组织里的增殖过程和增殖方式；免疫学方法包括中和实验、间接荧光抗体试验(IFAT)和酶连免疫试验(ELISA)。分子生物学方法如PCR和实时荧光PCR目前被广泛应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是日本学者Notomi等于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其原理是针对靶基因的6个区域，设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶-Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase，在恒温63℃左右反应1h，即可完成核酸扩增反应，通过直接观察反应产物的颜色可以进行结果判定。LAMP技术因其具有高特异性、高效率和快速反应的特点，目前被广泛应用于动植物及人类病原体的检测。在水生生物的病原检测方面，LAMP已经应用于检测迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)(Yeh et al.，2005)；对虾白斑综合征病毒(WSSV)；锦鲤疱疹病毒(KHV)(Gunimaladevi et al.，2004)、虹彩病毒(RSIV)；传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)(Gunimaladevi etal.，2005)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)(Soliman and El-Matbouli，2006)；鲤春病毒血症病毒(SVCV)(Liu et al.，2008；Shivappa et al.，2008)等。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种甲鱼虹彩病毒(STIV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种甲鱼虹彩病毒(STIV)的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种甲鱼虹彩病毒(STIV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法，所述方法包括利用特异性引物，以病毒核酸为模板进行环介导等温扩增反应，所述特异性引物包括一对内引物和一对外引物，所述外引物分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列，

Seq ID No.1：

正向外引物(F3)：5’-CGTTTAGCGGCAACATTGG-3’；

Seq ID No.2：

反向外引物(B3)：5’-TTTCTTTGCGGCC CTCTG-3’。

所述内引物分别含有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示的序列，

Seq ID No.3：正向内引物(FIP)：

5’-TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG-3’；

Seq ID No.4：反向内引物(BIP)

5’-CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA-3’。

所述环介导等温扩增反应的恒温温度为60℃～64℃，扩增反应的时间为60min-120min。优选的，环介导等温扩增反应的恒温温度为63℃，反应的时间为60min。

本发明进一步公开了一种甲鱼虹彩病毒(STIV)的检测试剂盒，所述试剂盒包括含有Seq ID No.1至Seq ID No.4所示序列中至少一种的引物序列，

Seq ID No.1：

5’-CGTTTAGCGGCAACATTGG-3’

Seq ID No.2：

5’-TTTCTTTGCGGCC CTCTG-3’

Seq ID No.3：

5’-TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG-3’

Seq ID No.4：

5’-CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA-3’。

在本发明具体的实施方式中，所述检测试剂盒用于环介导等温扩增反应，所述试剂盒包括分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列一对外引物。

优选的，所述检测试剂盒还包括分别含有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示序列一对内引物。

由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

本文建立了甲鱼虹彩病毒的环介导等温扩增检测技术，为甲鱼虹彩病毒的检测提供快速、敏感、特异的检测方法，可以进行病毒的现场即时检测，为甲鱼健康养殖及国际贸易的发展提供技术支持。

附图说明

图1a为本发明实施例1中LAMP的反应温度优化实验结果图，左图中显示1-6为绿色，7、8为橙色；

1-8：反应温度分别为59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃；M为分子量对照(从上到下分别为2000、1000、750、500、250和100bp)；8：阴性对照。

图1b为本发明实施例1中LAMP最佳反应时间的优化实验结果图，右图中3、4为绿色，1、2为橙；

1-4：反应时间分别为30min，45min，60min，75min。

图2a为本发明实施例1中LAMP的特异性实验结果图，图中显示，6为较深绿色，5为浅绿色，其余为橙色；

1为阴性对照；2-8分别为VNNV、VHSV、IPNV、TFV、9701株、IHNV和PFRV。

图2b为本发明实施例1中LAMP的特异性实验结果图，图中显示，2-5为浅绿色，其余为橙色；

1为阴性对照；2-8分别BIV、TFV、9506株、SSS0604、RSIV、LCDV和SGIV。

图3a为本发明实施例1的LAMP灵敏度检测实验结果图，图中显示NC为橙色，其余依稀释度为由深至浅的绿色；

1-8：分别采用10倍系列稀释的病毒核酸作为模板

图3b为本发明实施例1采用PCR的灵敏度实验结果图；

1为分子量标记(从上至下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；2-9分别为病毒稀释10^-1-10^-8。

图3c为本发明实施例1采用real-time PCR的灵敏度实验结果图；

1-8病毒分别稀释10^-1-10^-8。

具体实施方式

甲鱼虹彩病毒(STIV)是引起甲鱼“红脖子病”的重要病原，发病死亡率超过40％。本研究根据STIV胸肝激酶基因的保守序列，设计了两条内引物和两条外引物，建立了STIV环媒恒温扩增技术(LAMP)检测方法。对LAMP扩增条件进行了优化，结果表明最佳反应条件为63℃反应60min，扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳或者picogreen荧光染料检测。LAMP对蛙病毒属毒株具有特异性，狗鱼弹状病毒(PFRV)、传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)和鱼病毒性神经坏死病病毒(VNNV)等鱼类病毒都没有扩增。LAMP检测限比常规PCR高100倍，比实时荧光PCR低10倍。甲鱼虹彩病毒(STIV)环介导等温扩增检测方法具有快速、灵敏、简便、高效的优点，可以用于快速检测。

实施例1

1.材料和方法

1.1病毒

甲鱼虹彩病毒来自：本实验室从甲鱼中分离的甲鱼虹彩病毒(STIV9701株)。传染性造血器官坏死病毒(IHNV)由英国环境、渔业和养殖科学中心的B.Hill教授惠赠，病毒性出血性败血症病毒(VHSV)由挪威的国家兽医研究所Roar Gudding博士提供。狗鱼弹状病毒(PFRV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、鱼病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、淋巴囊肿病毒(LCDV)、新加坡石斑病毒(SGIV)、虎蛙病毒(TFV)、伯勒虹彩病毒(BIV)等由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心水生动物实验室保存。

1.2LAMP引物

根据虹彩病毒科蛙病毒属代表种FV-3的胸苷激酶基因(GenBank Ac.No.AY837779)的高度保守区域，使用primer explore V3软件(http://primerexplorer.jp)，设计4条特异性引物(两条内引物和两条外引物)，引物序列分别为：

正向内引物(FIP)(Seq ID No.3)：

5’-TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG-3’；

反向内引物(BIP)(Seq ID No.4)：

5’-CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA-3’.

正向外引物(F3)(Seq ID No.1)：

5’-CGTTTAGCGGCAACATTGG-3’；

反向外引物(B3)(Seq ID No.2)：

5’-TTTCTTTGCGGCC CTCTG-3’。

引物在宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.3病毒DNA的提取

病毒DNA的提取按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA ExtractionKit Ver 3.0操作说明书进行，荧光PCR和常规PCR灵敏度比较试验用同批次提取的DNA。

1.4LAMP的反应体系

RT-LAMP采用25μl反应体系，包括：各1μL(40pmol)的内引物FIP和BIP，各1μL(5pmol)外引物F3和B3，1μL(8U)Bst DNA多聚酶(New England Biolabs，英国)，2.5μL10倍缓冲液，5μL(5mol)甜菜碱(SIGMA，德国)，0.6μL(20μmol)MgSO₄，3.5μL(20μmol)dNTP(TAKARA，大连)，2.5μL病毒核酸作为模板，5.9μL DEPC水。

将反应体系分别在59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃恒温反应60min，之后85℃反应2min灭活酶，以确定最佳反应温度。

为了确定不同温度下扩增产物的浓度，在ABI7500实时荧光PCR仪(Applied Biosystems，美国)上进行溶解曲线分析程序(90℃15sec，60℃1min，90℃15sec)，以CT值最小的反应温度为最佳反应温度。

将反应体系在确定好的最佳反应温度下分别反应30、45、60、75min以优化反应时间。

扩增产物的检测可以通过凝胶电泳法或荧光染料法。电泳法：取5μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果，因为LAMP扩增反应形成各种不同长的茎环状结构，若电泳可见从点样孔的拖尾现象(Smear)以及很多不同扩增长度的条带则表明发生了扩增反应。荧光染料法：在20μL扩增产物中加入1μL 10×PicoGreen(Invitrogen，美国)，混合均匀，肉眼观察颜色变化。若发生扩增反应，则颜色变绿；若保持橙色不变，则没有发生扩增反应。

1.5LAMP特异性实验

为了检测LAMP特异性，将其他主要的水生动物病毒，包括IHNV、VHSV、IPNV、PFRV、VNNV、RSIV、LCDV、SGIV等进行LAMP反应，观察反应结果。

1.6LAMP、常规PCR和实时荧光PCR灵敏度的比较

将病毒核酸进行10倍系列稀释，并分别作为模板进行LAMP、常规PCR和实时荧光PCR反应，比较其检测限。

2.结果

2.1LAMP检测条件的确定

通过LAMP的温度和反应时间优化实验，其反应时间和反应温度得到优化。反应温度的优化实验结果见图1a，电泳检测结果与染色观察的结果完全一致。结果显示在60-64℃均有扩增，染色观察和电泳结果完全一致。63℃为最佳反应温度。反应时间的优化实验结果见图1b，电泳观察和染色观察的结果都表明60min为最佳反应时间。由此，最佳的LAMP反应条件为：63℃，60min。

2.2LAMP特异性实验

LAMP特异性实验表明：9701株(STIV)、TFV、BIV、9506株和SSS0604同属于虹彩病毒科蛙病毒属的毒株，在这些毒株中均有扩增。但在其它病毒如VNNV、VHSV、IPNV、IHNV、PFRV、LCDV、RSIV和SGIV中无扩增。见图2a，b。

2.3.LAMP灵敏度检测及与常规PCR、实时荧光PCR的比较

LAMP的灵敏度实验表明，其最低检测极限为10^-7的稀释度，而常规PCR、实时荧光PCR的检测限分别为10^-5、10^-8。(图3a，b，c)。

3.讨论

目前对甲鱼虹彩病毒进行细胞分离培养被认为是病毒分离鉴定的黄金法则，最后需要通过PCR扩增后测序分析或酶切分析来确证。其可靠性强但操作时间较长。是PCR方法、实时荧光PCR方法作为初筛诊断方法虽然现在被广泛使用，但在特异性、简便程度、温度和试剂仪器要求等方面有缺点，故难以在一般的养殖场现场检测上实现。

本文建立了甲鱼虹彩病毒的LAMP快速检测方法，相对上述方法具有一定的优点。首先，LAMP采用4对引物(其中一对引物长度超过40bp)共识别目的片段6个特异性的区域，只有在引物组完全与靶序列匹配结合的情况下才能进行扩增，因此使具有较高的特异性。其次，LAMP扩增反应在等温条件下进行，不需要昂贵的热循环加热仪器，没有了核酸的变复性过程，节约了时间，仅一台水浴锅就能进行检测，这使得LAMP方法可以很容易的在农场进行检测。第三，该方法可以用PicoGreen荧光染料进行结果判定，不需要凝胶电泳，因此检测更快速便捷。

本研究根据甲鱼虹彩病毒的TK基因设计引物，表现了较好的特异性。仅仅与同属中给予序列最为相似的病毒有交叉反应。PFRV、IPNV、VHSV、IHNV、VNNV等鱼类病毒都没有扩增。同时与同属虹彩病毒科的LCDV、SGIV、RSIV都没有扩增反应，表明引物的设计满足检测特异性的需要。

本研究方法-环介导等温扩增方法(LAMP)作为对甲鱼虹彩病毒初筛诊断灵敏度较高，比常规PCR高100倍，比实时荧光PCR低10倍。相对于PCR和实时荧光PCR来说，但其设备简单，技术要求不高，只需常规水浴锅在63℃即可进行，通过加入dsDNA染料后目测可以实现对扩增结果的判断。时间上这比常规PCR(5-6h)和实时荧光PCR(1.5-2h)能更早得到反应结果，因此该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面拥有更大的优势。在养殖场等现场设备不足，技术人员缺乏的条件下，该方法正好补充了这方面的空白。如果进行进一步优化、研制检测试剂盒，特别适合作为养殖场的现场检测，这将会在甲鱼养殖中病原的早期诊断及预防控制方面发挥重要的作用。

实施例2

一种甲鱼虹彩病毒的检测试剂盒，该试剂盒包括以下两对引物：

正向内引物(FIP)(Seq ID No.3)：

5’-TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG-3’；

反向内引物(BIP)(Seq ID No.4)：

5’-CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA-3’.

正向外引物(F3)(Seq ID No.1)：

5’-CGTTTAGCGGCAACATTGG-3’；

反向外引物(B3)(Seq ID No.2)：

5’-TTTCTTTGCGGCC CTCTG-3’。

该试剂盒还包括使用说明书。该试剂盒可用于甲鱼虹彩病毒LAMP检测。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120>甲鱼虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法和试剂盒

<130>DHC0910509

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cgtttagcgg caacattgg 19

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tttctttgcg gccctctg 18

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tggaaaagtc ttcgggcacc acgcaagtcc acactcctca g 41

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctgtttgaga tggccctgga ggtctcgctc tggatgagca ta 42

Claims

1. 甲鱼虹彩病毒（STIV）的非诊断目的的环介导等温扩增（LAMP）检测方法，所述方法包括利用特异性引物，以病毒核酸为模板进行环介导等温扩增反应，所述特异性引物包括一对内引物和一对外引物，其特征在于：所述外引物分别是Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列，

Seq ID No .1：

正向外引物（F3）：5’-CGTTTAGCGGCAACATTGG-3’;

Seq ID No.2：

反向外引物（B3）：5’-TTTCTTTGCGGCC CTCTG -3’ ；

所述内引物分别是Seq ID No.3和Seq ID No.4所示的序列，

Seq ID No .3：正向内引物（FIP）：

5’-TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG -3’；

Seq ID No .4：反向内引物（BIP）

5’-CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA -3’。

2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的恒温温度为60℃～64℃。

3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的时间为60min～120min。

4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的恒温温度为63℃，反应的时间为60min。

5. 甲鱼虹彩病毒（STIV）的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下引物序列，

Seq ID No .1：

5’-CGTTTAGCGGCAACATTGG-3’

Seq ID No.2：

5’-TTTCTTTGCGGCC CTCTG -3’

Seq ID No .3：

5’-TGGAAAAGTCTTCGGGCACCACGCAAGTCCACACTCCTCAG -3’

Seq ID No .4：

5’-CTGTTTGAGATGGCCCTGGAGGTCTCGCTCTGGATGAGCATA -3’。