CN103215383A - 辣椒轻斑驳病毒反转录-环介导等温扩增检测用引物及其应用 - Google Patents
辣椒轻斑驳病毒反转录-环介导等温扩增检测用引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于辣椒轻斑驳病毒反转录-环介导等温扩增检测的引物、检测方法及其应用，所述引物为PMMoV-F3、PMMoV-B3、PMMoV-FIP和PMMoV-BIP，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1～4所示。本发明还进一步提供了检测辣椒轻斑驳病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用本发明特异性引物进行RT-LAMP扩增，判断样品中是否含有辣椒轻斑驳病毒。本发明引物特异性好，检测方法快速准确，灵敏度高，适合于进出境植物检疫、种子健康检查及农业生产上辣椒轻斑驳病毒的快速检测诊断，应用前景广泛。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及辣椒轻斑驳病毒反转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测引物、检测方法及其应用。
背景技术
辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus, PMMoV）是一种正单链RNA的杆状病毒，属于杆状病毒科（Virgaviridae）、烟草花叶病毒属（Tobamovirus）成员，在世界范围内广泛分布，是辣椒上最重要的可经种子传播的病原之一。PMMoV虽然在辣椒叶片上产生轻微或没有产生症状，但能引起果实退绿斑驳、畸型、变小，偶尔坏死，严重影响辣椒的产量和品质。此外，该病毒还可能是一个能够同时感染人类的植物病毒，已有报道指出该病毒与人的发热、腹部疼痛、瘙痒有关，并引起免疫反应。在我国，1989年报道在辽宁的辣椒上发生，1994年报道在新疆石河子辣椒上危害，而后发生危害的报道很少。但近5年来，先后在陕西、北京、宁夏、山东青岛、河北保定等地的辣椒上发现该病毒，具有危害地区越来越广、危害面积也在逐年增加的趋势。
环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种在等温条件下高特异性、高灵敏性、快速地扩增DNA的核酸扩增方法。与传统的分子检测方法相比，该方法具有以下几个方面的优点：1）一般情况下，LAMP方法比传统的PCR方法具有更高的灵敏度高；2）由于LAMP通过4对引物与靶序列上的6个特异部位准确结合来产生扩增效应，因此能获得比PCR更高的特异性；3）LAMP是恒温扩增反应，没有PCR反应中温度变化的耗时，通常在30 min-60 min内即可完成反应过程；4）LAMP反应只需要恒温孵育器（或恒温水浴槽），设备简单，不需要更为昂贵的PCR仪；5）产物检测便捷多样，即可根据反应体系中是否形成白色的焦磷酸镁沉淀来定性判断，也可加入染料后进行颜色反应判定，或琼脂糖凝胶电泳判定，或利用LAMP实时浊度仪或实时荧光PCR系统进行实时检测判定。LAMP自从2000年诞生以来，已在植物病害检测中得到越来越广泛的应用，包括植物病原细菌、病毒、寄生虫等有害生物、转基因的检测中。
目前，除了利用传统的鉴别寄主、生理生化特征、电镜技术等常规方法进行PMMoV的检测鉴定外，还可以利用已建立的RT-PCR、实时荧光RT-PCR、基于DIG标记cDNA探针的分子杂交等分子检测方法，但还没有有关RT-LAMP方法的报道。本发明根据PMMoV基因组序列的保守区域设计引物，经条件优化后，建立了PMMoV的RT-LAMP方法，为PMMoV的快速检测提供一种新的分子检测方法。
发明内容
本发明目的在于提供用于辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP检测的引物序列及其应用。所述RT-LAMP检测，即辣椒轻斑驳病毒反转录-环介导等温扩增检测。
本发明的目的是通过以下方法实现的。
本发明通过分析已报道的PMMoV基因序列，设计特异性引物。所述的引物对由1对外引物和1对内引物组成，其外引物序列为PMMoV-F3：如SEQ ID NO：1所示，即为5’- CAGGTGGACTTCGGTCTT -3’、PMMoV-B3：如SEQ ID NO：2所示，即为5’- CAAGCTTTGAAAGGTACAGT -3’；其内引物为PMMoV-FIP：如 SEQ ID NO：3所示，即为5’- ATTTCCCCCGATATCATATGTCGTGGAACTAGAATACTTGATGATGC-3’、 PMMoV-BIP: 如SEQ ID NO：4所示，即为5’- GTCGTGACTACGTTCATTGCTGTCAATGCTATCCTTTTGAGC-3’。
本发明还进一步提供了应用上述引物的RT-LAMP检测方法，其以样品总RNA为模板，进行RT-LAMP扩增，反应结束后根据是否产生典型的梯状条带判定结果。
本发明的反应条件可由两步RT-LAMP法或一步RT-LAMP法进行，其特征在于：
（1）两步RT-LAMP法的反转录反应和LAMP扩增反应两个过程分开进行，反转录反应的温度为42℃，LAMP扩增温度为65 ℃；
（2）一步RT-LAMP法的反转录反应和LAMP扩增反应同时进行，一步RT-LAMP法的反应温度为60 ℃。
RNA反转录体系为20 μL，4.0 μL总RNA, 2 μL PMMoV-CP2（10 μmol/L），5.0 μL DEPC处理水,70℃水浴5 min，冰浴5 min后加入4 μL 5×M-MLV缓冲液，0.5 μL M-MLV 反转录酶（200 U/μL），1 μL dNTP (各10 mmol/L)，0.5 μL RibolockTM RNase Inhibitor（40 U/μL），补充DEPC处理水至20 μL，轻轻混匀后42℃水浴1h，70 ℃灭活10 min，合成第一链cDNA，-20 ℃保存备用。
LAMP反应体系为25 μL，包括Bst DNA聚合酶大片段（8 U/μL）1.0 μL，10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5 μL，cDNA模板2 μL， MgSO4（100 mmol/ L）1 μL，甜菜碱（Betaine）（5 mol/L）5 μL， dNTP （10 mmol/L）1 μL，10 μmol/L PMMoV-FIP和BIP各4 μL，10 μmol/L PMMoV-F3和B3 各0.5 μL，加灭菌水补充至25 μL。反应条件为65 ℃孵育1 h。取5 μL扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在凝胶成像仪上观察、拍照。
一步RT-LAMP反应体系为25 μL，包括0.5 μL 的M-MLV反转录酶（200 U/μL）或0.125 μL的AMV反转录酶（10 U/μL），Bsm DNA聚合酶大片段（8 U/μL）1.0 μL，10×缓冲液2.5 μL，0.5 μL RibolockTM RNase Inhibitor（40 U/μL），2 μL总RNA，MgSO4（100 mmol/ L）1 μL，甜菜碱（Betaine）（5 mol/L）5 μL， dNTP （10 mmol/L）1 μL，10 μmol/L PMMoV-FIP和BIP各4 μL，10 μmol/L PMMoV-F3和B3 各0.5 μL，加灭菌水补充至25 μL。反应条件为60 ℃孵育1 h。取5 μL扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在凝胶成像仪上观察、拍照。
进一步，还可以将本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。
所述的引物在辣椒轻斑驳病毒检测中的应用不限于以上所述，例如把反转录和LAMP扩增组成一步RT-LAMP检测方法。
本发明具有以下优点：本发明根据辣椒轻斑驳病毒基因组序列设计引物，该组引物可用于辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP检测。本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否有辣椒轻斑驳病毒，为进出口安全提供了保证。
附图说明
图1是辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP方法的不同分离物检测结果。M：DNA Marker；1为Agdia的PMMoV阳性对照样品（Lot NO：C1689）；2为Adgen的PMMoV阳性对照样品（PV-0165）；3为厦门分离物；4为台湾分离物。
图2是不同反应条件下利用M-MLV反转录酶的辣椒轻斑驳病毒一步RT-LAMP检测结果。M：DNA Marker；1~2为42℃孵育30 min后60 ℃孵育1 h；3~4为42℃孵育20 min后60 ℃孵育1 h；5~6为42℃孵育10 min后60 ℃孵育1 h；7~8为42℃孵育5 min后60 ℃孵育1 h；9~10为60 ℃孵育1 h。
图3是不同反应条件下利用AMV反转录酶的辣椒轻斑驳病毒一步RT-LAMP检测结果。M：DNA Marker；1~2为42℃孵育30 min后60 ℃孵育1 h；3~4为42℃孵育20 min后60 ℃孵育1 h；5~6为42℃孵育10 min后60 ℃孵育1 h；7~8为42℃孵育5 min后60 ℃孵育1 h；9~10为60 ℃孵育1 h。
图4是辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP方法的特异性检测结果。M： DNA Marker；1为PMMoV病叶，2-9分别为CGMMV、TMV、ZGMMV、ORSV、ToMV、健康甜椒叶片、健康辣椒叶片、空白对照。
图5是辣椒轻斑驳病毒常规RT-PCR灵敏性试验结果。M： DNA Marker；1∶10-1倍稀释（体积比，下同）；2∶10-2倍稀释；3∶10-3倍稀释；4∶10-4倍稀释；5∶10-5倍稀释；6∶10-6倍稀释；7∶10-7倍稀释；8∶10-8倍稀释；9∶10-9倍稀释；10∶10-10倍稀释。
图6是辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP灵敏性试验结果。M： DNA Marker；1∶10-1倍稀释；2∶10-2倍稀释；3∶10-3倍稀释；4∶10-4倍稀释；5∶10-5倍稀释；6∶10-6倍稀释；7∶10-7倍稀释；8∶10-8倍稀释；9∶10-9倍稀释；10∶10-10倍稀释。
图7是甜椒种子中辣椒轻斑驳病毒的RT-LAMP检测结果。M： DNA Marker；P：PMMoV阳性样品；1~6：甜椒种子；N：健康甜椒种子。
图8是甜椒叶片中辣椒轻斑驳病毒的RT-LAMP检测结果。M： DNA Marker；1~16：甜椒病叶样品；17：健康甜椒叶片。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。
实施例1 辣椒轻斑驳病毒两步及一步RT-LAMP方法的建立
1. 引物设计和合成
根据PMMoV基因序列保守区域设计特异性引物，由外引物（PMMoV-F3、PMMoV-B3）和内引物（PMMoV-FIP、PMMoV-BIP）组成。
外引物（正向）序列为：
PMMoV-F3（SEQ ID NO：1）：5’- CAGGTGGACTTCGGTCTT -3’
PMMoV-B3(SEQ ID NO：2)：5’- CAAGCTTTGAAAGGTACAGT-3’
内引物（反向）序列为：
PMMoV-FIP（SEQ ID NO：3） ：5’- ATTTCCCCCGATATCA
TATGTCGTGGAACTAGAATACTTGATGATGC -3’
PMMoV-BIP （SEQ ID NO：4）：5’- GTCGTGACTACGTTCATTG
CTGTCAATGCTATCCTTTTGAGC-3’
2. 总RNA的提取
1）取0.1 g发病叶片于研钵中，加入1 ml的Trizol试剂研磨，移入灭菌的1.5 ml离心管中；
2）室温下保持5 min，加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡15 s，然后在室温下保持10 min后，4 ℃，12000 g离心15 min；
3）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加入0.5 ml异丙醇，颠倒混匀，室温下保持10 min；
4）4 ℃，12000 g离心10 min；
5）倒掉上清液，加入1 ml 75%的乙醇洗涤沉淀，然后4 ℃，7500 g离心5 min（如沉淀悬浮起来，则用12000 g），弃去乙醇；
6）沉淀于室温下充分干燥后，溶于50 μL ddH2O（DEPC处理）中，55 ℃水浴10 min后，-20℃保存备用。
3. 辣椒轻斑驳病毒两步RT-LAMP方法的建立
RNA反转录体系为20 μL，4.0 μL总RNA, 2 μL PMMoV-CP2（10 μmol/L），5.0 μL DEPC处理水,70℃水浴5 min，冰浴5 min后加入4 μL 5×M-MLV buffer，0.5 μL M-MLV 反转录酶，1 μL dNTP (各10 mmol/L)，0.5 μL RibolockTM RNase Inhibitor，补充DEPC处理水至20 μL，轻轻混匀后42℃水浴1h，70 ℃灭活10 min，合成第一链cDNA，-20 ℃保存备用。
反应体系为25 μL，包括Bst DNA聚合酶大片段（8 U/μL）1.0 μL，10×Bst缓冲液2.5 μL，cDNA模板2 μL，MgSO4（100 mmol/ L）1 μL，甜菜碱（Betaine）（5 mol/L）5 μL， dNTP （10 mmol/L）1 μL，10 μmol/L PMMoV-FIP和BIP各4 μL，10 μmol/L PMMoV-F3和B3 各0.5 μL，加灭菌水补充至25 μL。65 ℃孵育1 h。
取5 μL扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在凝胶成像仪上观察、拍照。以是否产生梯状条带来判定样品中是否含有辣椒轻斑驳病毒。
4. 两步RT-LAMP方法用于检测不同PMMoV分离物
对不同辣椒轻斑驳病毒的分离物进行RT-LAMP检测，结果在含有PMMoV的不同分离物中均产生典型的梯状条带，检测结果如图1所示。表明建立的RT-LAMP方法适用于不同PMMoV分离物的检测。
5. 辣椒轻斑驳病毒一步RT-LAMP方法的建立
反应体系为25 μL，包括0.5 μL 的M-MLV反转录酶（200 U/μL）或0.125 μL的AMV反转录酶（10 U/μL），Bsm DNA聚合酶大片段（8 U/μL）1.0 μL，10×Bsm缓冲液2.5 μL，0.5 μL RibolockTM RNase Inhibitor（40 U/μL），2 μL总RNA，MgSO4（100 mmol/ L）1 μL，甜菜碱（Betaine）（5 mol/L）5 μL， dNTP （10 mmol/L）1 μL，10 μmol/L PMMoV-FIP和BIP各4 μL，10 μmol/L PMMoV-F3和B3 各0.5 μL，加灭菌水补充至25 μL。
42℃下分别孵育30、20、10、5或0 min后，然后60 ℃孵育1 h。
用M-MLV 反转录酶检测结果如图2，AMV 反转录酶检测结果如图3。表明无论是M-MLV 反转录酶还是AMV反转录酶，结合Bsm DNA聚合酶大片段，均可以无需经42℃下分别孵育，所发明的引物可用于PMMoV一步RT-LAMP检测。
实施例2 辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP的特异性检测
取含有PMMoV、CGMMV、TMV、ZGMMV、ORSV、ToMV等病毒的病叶，以及健康的甜椒、辣椒叶片，按实施例1方法提取总RNA、反转录、然后进行LAMP扩增，凝胶电泳检测结果。结果PMMoV病叶中产生典型的梯状条带，而CGMMV、TMV、ZGMMV、ORSV、ToMV等病毒的病叶，以及健康的甜椒、辣椒叶片均未产生梯状条带，检测结果如图4所示。表明建立的RT-LAMP方法具有良好的特异性，可用于PMMoV的检测。
实施例3 辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP的灵敏性检测
将含PMMoV的总RNA进行10倍系列稀释，按实施例1方法进行反转录、LAMP扩增，以检测该方法的相对灵敏度。检测结果如图5和图6所示。表明建立的RT-LAMP方法的检测灵敏性比普通RT-PCR方法灵敏度提高103倍。
实施例4 甜椒种子中辣椒轻斑驳病毒的RT-LAMP检测
按实施例1两步RT-LAMP方法对一批含有PMMoV的甜椒种子进行RT-LAMP检测。检测结果如图7所示。表明建立的RT-LAMP可用于种子中PMMoV的检测。
实施例5 甜椒叶片中辣椒轻斑驳病毒的RT-LAMP检测
按实施例1两步RT-LAMP方法对一批含有PMMoV的甜椒叶片进行RT-LAMP检测。检测结果如图8所示。表明建立的RT-LAMP方法可用于叶片中PMMoV的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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<120> 辣椒轻斑驳病毒反转录-环介导等温扩增检测用引物及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CAGGTGGACT TCGGTCTT 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
CAAGCTTTGA AAGGTACAGT 20
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ATTTCCCCCG ATATCATATG TCGTGGAACT AGAATACTTG ATGATGC 47
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GTCGTGACTA CGTTCATTGC TGTCAATGCT ATCCTTTTGA GC 42
Claims (5)
1.一种辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP检测引物，由PMMoV-F3、PMMoV-B3、PMMoV-FIP和PMMoV-BIP引物组成，其特征在于核苷酸序列为：
PMMoV-F3：5’- CAGGTGGACTTCGGTCTT -3’
PMMoV-B3：5’- CAAGCTTTGAAAGGTACAGT -3’
PMMoV-FIP ：5’- ATTTCCCCCGATATCATATGTCGTGGAAC
TAGAATACTTGATGATGC -3’
PMMoV-BIP ：5’- GTCGTGACTACGTTCATTGCTGTCAATGC
TATCCTTTTGAGC-3’。
2.一种利用权利要求1检测引物检测辣椒轻斑驳病毒的RT-LAMP方法，其特征在于该方法以样品总RNA为模板，进行RT-LAMP扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据是否产生典型的梯状条带判定结果。
3.如权利要求2所述的方法，其反应条件可由两步RT-LAMP法或一步RT-LAMP法进行，其特征在于：
（1）两步RT-LAMP法的反转录反应和LAMP扩增反应两个过程分开进行，反转录反应的温度为42℃，LAMP扩增温度为65 ℃；
（2）一步RT-LAMP法的反转录反应和LAMP扩增反应同时进行，一步RT-LAMP法的反应温度为60 ℃。
4.一种含有权利要求1所述辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP检测引物的试剂盒。
5.一种权利要求1所述的引物在辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP检测中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130724 |