CN107828918A - 尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重rt‑pcr检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重rt‑pcr检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT‑PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明的试剂盒包括NeLV‑正向引物、NeLV‑反向引物、NCLV‑正向引物和NCLV‑反向引物、随机引物、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反转录酶、PCR Buffer、dNTPs、Mgcl2、Taq DNA聚合酶、阳性及阴性对照品。本发明设计了检测尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的特异性引物，优化了二重RT‑PCR反应体系和反应程序，可实现同时检测尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒，不仅操作简便，省去了克隆、测序和序列比对步骤，而且具有特异、准确和灵敏的突出优点，在进出境口岸检疫和农业生产上应用前景广泛。

Description

尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR检测试剂盒 及其检测方法
技术领域
本发明涉及尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于进出境口岸检疫和农业生产上尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的同时快速检测。
背景技术
水仙(Narcissus tazetta L.)属于石蒜科(Amaryllidaceae)水仙属(Narcissus)多年生草本植物，是我国传统出口名花。病毒病是水仙上的主要病害之一，能够引起种球的产量和品质严重下降，造成水仙观赏价值降低。病毒侵染水仙主要引起种球变小、花箭减小、香气变淡、鳞茎退化和植株矮化等一系列症状，并且病毒复合侵染现象较多。尼润潜隐病毒(Nerine latent virus，NeLV)和水仙普通潜隐病毒(Narcissus common latentvirus，NCLV)是水仙上的2种重要病毒，都属于乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)成员。NeLV、NCLV病毒基因组为正义单链RNA，全长分别为8281nt和8539nt，含有6个开放阅读框。NeLV、NCLV病毒粒子形态均为线状，侵染水仙后，无明显的典型症状，常表现为隐症。由于水仙病毒病的防治十分困难，因此加强NeLV、NCLV检测，对于控制NeLV、NCLV的发生和扩散，保护水仙生产安全具有重要意义。
目前，针对水仙病毒检测的方法主要有生物学测定、电镜观察、血清学检测和分子生物学检测方法。由于NeLV、NCLV尚无明确的鉴别寄主，因此无法有效检测，而且该方法受人为因素的影响较大；电镜观察需要专门的仪器设备和操作技术人员，在实际应用上有一定的局限性；血清学检测具有操作简便、结果直观的优点，但缺点是需要稳定性好、特异性强的病毒抗体，NeLV、NCLV两种水仙病毒至今尚无商业化的血清学检测试剂盒。利用RT-PCR技术检测植物病毒具有快速、准确、特异性强、灵敏度高的优点，其中在RT-PCR基础上改进的多重RT-PCR能够一次检测多个靶病毒，显著提高了检测效率，近年来已用于多种植物病毒的检测鉴定。利用双重RT-PCR检测NeLV、NCLV，通过一次实验即可实现对NeLV、NCLV两种病毒的同时检测，准确鉴定NeLV、NCLV是单一侵染还是复合侵染。但迄今为止，关于NeLV、NCLV双重RT-PCR分子生物学检测方法未见报道，更未见专门用于同时检测NeLV、NCLV的双重RT-PCR试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何鉴定尼润潜隐病毒(Nerine latent virus，NeLV)和/或水仙普通潜隐病毒(Narcissus common latent virus，NCLV)。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了用于鉴定尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒的成套引物对。
本发明提供的成套引物对由特异引物对甲和特异引物对乙组成；
所述特异引物对甲由引物NeLV-F和引物NeLV-R组成；
所述特异引物对乙由引物NCLV-F和引物NCLV-R组成；
所述引物NeLV-F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物NeLV-R为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述特异引物对乙由用于扩增特异DNA片段乙的两条引物组成；所述特异DNA片段乙中具有水仙普通潜隐病毒基因组中引物NCLV-F和引物NCLV-R组成的引物对的靶序列；
所述引物NCLV-F为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物NCLV-R为如下b3)或b4)：
b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
上述成套引物对中，所述引物NeLV-F、所述引物NeLV-R、引物NCLV-F和所述引物NCLV-R的摩尔比为1:1:1:1。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了上述成套引物对的新用途。
本发明提供了上述成套引物对在如下c1)-c8)中任一所述的应用：
c1)制备用于鉴定尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒的产品；
c2)鉴定尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒；
c3)制备用于鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒的产品；
c4)鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒；
c5)制备用于鉴别尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的产品；
c6)鉴别尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒；
c7)制备用于检测待测样品中是否含有尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒的产品；
c8)检测待测样品中是否含有尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了含有上述成套引物对的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下d1)-d4)中任一种：
d1)鉴定尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒；
d2)鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒；
d3)鉴别尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒；
d4)检测待测样品中是否含有尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒。
本发明的试剂盒还包括随机引物(Random Primers)、RT Buffer(5×)、RNA酶抑制因子、反转录酶、PCR Buffer(10×)、dNTPs、Mgcl2、Taq DNA聚合酶、RNase-free ddH2O、含有尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的阳性对照样品及不含尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的阴性对照样品。
上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒的制备方法为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)上述成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；
(Ⅱ)上述成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。
上述方法中，所述各条引物的摩尔比为1:1:1:1。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒的方法。
本发明提供的鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒的方法包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用上述成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为218bp的条带，则所述待测病毒为尼润潜隐病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为479bp的条带，则所述待测病毒为水仙普通潜隐病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中不含有大小为218bp的条带且不含有大小为479bp的条带，则所述待测病毒不为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴别尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的方法。
本发明提供的鉴别尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的方法包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用上述成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为218bp的条带，则所述待测病毒为尼润潜隐病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为479bp的条带，则所述待测病毒为水仙普通潜隐病毒；
所述待测病毒为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测样品中是否含有尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒的方法。
本发明提供的检测待测样品中是否含有尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒的方法包括如下步骤：以待测样品的cDNA为模板，采用上述成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为218bp的条带，则所述待测样品含有尼润潜隐病毒；反之则所述待测样品不含有尼润潜隐病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为479bp的条带，则所述待测样品含有水仙普通潜隐病毒；反之则所述待测样品不含有水仙普通潜隐病毒。
上述方法中，所述RT-PCR扩增的体系如下：cDNA1μL、浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为2.5mmol/L dNTPs 0.125μL、10×PCR Buffer 2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl21.5μL、浓度为10μmol/L NeLV-F 0.5μL、浓度为10μmol/L NeLV-F0.5μL、浓度为10μmol/LNCLV-F 0.5μL、浓度为10μmol/L NCLV-R 0.5μL和ddH2O17.375μL；所述RT-PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性3min，然后94℃变性30s、54℃退火45s、72℃延伸45s，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min。
上述方法中，所述cDNA是以待测病毒或待测样品的RNA为模板进行反转录得到的。所述反转录的具体方法如下：将待测病毒或待测样品总RNA3μL、浓度为100μmol/L的随机引物1μL和RNase-free ddH2O 7μL混匀，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，然后再加入下列试剂：5×RT Buffer 5μL、浓度为10mmol/L dNTPs 2μL、浓度为200U/μL反转录酶1μL和浓度为40U/μL RNA酶抑制因子1μL，42℃水浴60min，70℃水浴10min后冷却至室温，合成cDNA。
为了解决上述技术问题，本发明最后还提供了上述特异引物对甲或特异引物对乙。
如下h1)-h6)任一所述的应用也属于本发明的保护范围：
h1)上述特异引物对甲在制备用于检测尼润潜隐病毒的产品中的应用；
h2)上述特异引物对甲在鉴定尼润潜隐病毒中的应用；
h3)上述特异引物对甲在鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒中的应用；
h4)上述特异引物对乙在制备用于检测水仙普通潜隐病毒的产品中的应用；
h5)上述特异引物对乙在鉴定水仙普通潜隐病毒中的应用；
h6)上述特异引物对乙在鉴定待测病毒是否为水仙普通潜隐病毒中的应用。
较现有技术而言，本发明所提供的尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒双重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法有益效果在于：
1)特异性强：本发明的NeLV、NCLV特异性引物是通过对已报道的NeLV、NCLV基因序列多重比对后，在保守区域设计，并分别以多种水仙病毒为研究对象，反复实验筛选后获得。能够从感染NeLV、NCLV的样品上扩增得到大小为218bp、479bp的特异性目的片段，而从健康样品未扩增到特异性目的片段；
2)灵敏度高：本发明的双重RT-PCR检测NeLV、NCLV的灵敏度，与两种病毒的单一RT-PCR灵敏度相当，表明双重RT-PCR能够用于微量病毒样品的检测；
3)检测效率高、操作简便：与传统RT-PCR相比，一次可以同时检测2个靶病毒，大大提高了检测效率，而且省去了克隆、测序和序列比对步骤，只需根据PCR产物的大小即可准确判断病毒种类，节约了检测时间和成本。
本发明根据水仙上已报道的2种香石竹潜隐病毒属病毒(NeLV、NCLV)基因序列设计、筛选出两对特异性引物，并通过退火温度、循环数、引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度等参数的优化确定了最佳反应体系和反应程序，提供了一种尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR检测试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒及检测方法不仅可用于NeLV、NCLV单一或复合侵染，还能够对进出境口岸检疫和农业生产上NeLV、NCLV同时进行快速检测，具有特异性强、灵敏度高、检测效率高、操作简便的优点。
附图说明
图1为实施例2的尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒双重RT-PCR检测试剂盒的检测结果。其中，1：阳性对照；2：含有尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的样品；3：阴性对照。
图2为实施例3的特异性的检测结果。其中，1：含有尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的样品；2：水仙普通潜隐病毒样品；3：尼润潜隐病毒样品；4：阴性对照。
图3为实施例4的灵敏度的检测结果。其中，1：100；2：10-1稀释；3：10-2稀释；4：10-3稀释；5：10-4稀释；6：10-5稀释；7：10-6稀释；8：阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR检测试剂盒
一、用于检测尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的成套引物对
本发明根据水仙上已报道的2种香石竹潜隐病毒属病毒(NeLV、NCLV)基因序列，设计、筛选出两对特异性用于检测尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的引物。
本发明设计的用于检测尼润潜隐病毒(Nerine latent virus，NeLV)的引物对由NeLV-正向引物和NeLV-反向引物组成，其扩增产物大小为218bp。引物序列如下：
NeLV-正向引物：5’-GTCCCGCCTGAATCAATAGCA-3’(序列1)；
NeLV-反向引物：5’-TTCGTCCCAATCATGTAGTTCC-3’(序列2)；
本发明设计的用于检测水仙普通潜隐病毒(Narcissus common latent virus，NCLV)的引物对由NeLV-正向引物和NeLV-反向引物组成，其扩增产物大小为479bp。引物序列如下：
NCLV-正向引物：5’-CCTGACCCCAGCAATCCTT-3’(序列3)；
NCLV-反向引物：5’-GGCCTCCGAATTAACCCCTC-3’(序列4)。
用于检测尼润潜隐病毒(Nerine latent virus，NeLV)的引物对和用于检测水仙普通潜隐病毒(Narcissus common latent virus，NCLV)的引物对组成本发明的用于检测尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的成套引物对。
二、尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR检测试剂盒的配置(10次检测量)
本发明的尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR检测试剂盒由如下1)-15)所示的试剂组成：
1)NeLV-正向引物：10μmol/L，5’-GTCCCGCCTGAATCAATAGCA-3’(序列1)，1管(20μL)；
2)NeLV-反向引物：10μmol/L，5’-TTCGTCCCAATCATGTAGTTCC-3’(序列2)，1管(20μL)；
3)NCLV-正向引物：10μmol/L，5’-CCTGACCCCAGCAATCCTT-3’(序列3)，1管(20μL)；
4)NCLV-反向引物：10μmol/L，5’-GGCCTCCGAATTAACCCCTC-3’(序列4)，1管(20μL)；
5)Random Primers(随机引物)：100μmol/L，1管(20μL)；
6)RT Buffer：5×，1管(100μL)；
7)RNA酶抑制因子：40U/μL，1管(20μL)；
8)反转录酶：200U/μL，1管(20μL)；
9)PCR Buffer：10×，1管(50μL)；
10)dNTPs：2.5mmol/L的1管(50μL)、10mmol/L的1管(50μL)，；
11)Mgcl2：25mmol/L，1管(100μL)；
12)Taq DNA聚合酶：5U/μL，1管(100μL)；
13)含有尼润潜隐病毒、水仙普通潜隐病毒的阳性对照样品，1管(1mL)；
14)不含尼润潜隐病毒、水仙普通潜隐病毒的阴性对照样品，1管(1mL)；
15)RNase-free ddH2O，1管(5mL)。
实施例2、尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR检测试剂盒的检测方法
一、尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR反应体系的建立及反应条件的优化
分别以含有尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的样品、水仙普通潜隐病毒样品和尼润潜隐病毒样品作为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒。具体步骤如下：
1)反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA 3μL、浓度为100μmol/L的随机引物1μL和RNase-free ddH2O 7μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×RTBuffer 5μL、浓度为10mmol/L dNTPs 2μL、浓度为200U/μL反转录酶1μL和浓度为40U/μLRNA酶抑制因子1μL，42℃水浴60min，70℃水浴10min后冷却至室温，合成cDNA；
2)双重RT-PCR反应体系：在PCR管中加入步骤1)合成的cDNA1μL，每管加入不同体积的浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶，浓度为2.5mmol/L dNTPs 0.125μL，10×PCR Buffer2.5μL，不同体积的浓度为25mmol/L MgCl2，不同浓度的NeLV-正向引物0.5μL，不同浓度的NeLV-反向引物0.5μL，不同浓度的NCLV-正向引物0.5μL，不同浓度的NCLV-反向引物0.5μL，加ddH2O至反应总体积为25μL；
3)将步骤2)建立的反应体系在下述条件下反应：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，不同温度下退火45s、72℃延伸45s，如此进行不同个数的循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；
上述步骤2)中的“不同体积”的Taq DNA聚合酶为0.25μL、0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL、3μL、3.5μL、4μL、4.5μL或5μL；
上述步骤2)中的“不同体积”的MgCl2为0.25μL、0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL、3μL、3.5μL、4μL、4.5μL或5μL；
上述步骤2)中的“不同浓度”为10μmol/L、9μmol/L、8μmol/L、7μmol/L、6μmol/L、5μmol/L、4μmol/L、3μmol/L、2μmol/L、1μmol/L、0.5μmol/L、0.25μmol/L、0.125μmol/L或0.0625μmol/L。每个病毒的正向引物和反向引物的浓度之间做了排列组合，如正向引物浓度为10μmol/L时，反向引物的浓度分别为10μmol/L、9μmol/L、8μmol/L、7μmol/L、6μmol/L、5μmol/L、4μmol/L、3μmol/L、2μmol/L、1μmol/L、0.5μmol/L、0.25μmol/L、0.125μmol/L或0.0625μmol/L，共14个浓度组合；不同病毒之间也按上述方法做了排列组合；
上述步骤3)中的“不同温度”为50℃、50.5℃、51℃、51.5℃、52℃、52.5℃、53℃、53.5℃、54℃、54.5℃、55℃、55.5℃、56℃、56.5℃、57℃、57.5℃、58℃、58.5℃、59℃、59.5℃或60℃；
上述步骤3)中的“不同个数”为5个、10个、25个、30个、35个或40个。
取PCR反应产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。结果表明：双重RT-PCR的最佳反应体系为：cDNA 1μL、浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为2.5mmol/L dNTPs 0.125μL、10×PCR Buffer 2.5μL、浓度为25mmol/LMgCl21.5μL、浓度为10μmol/L NeLV-正向引物0.5μL、浓度为10μmol/L NeLV-反向引物0.5μL、浓度为10μmol/L NCLV-正向引物0.5μL、浓度为10μmol/L NCLV-反向引物0.5μL和ddH2O17.375μL；最佳反应条件为：94℃预变性3min,然后94℃变性30s、54℃退火45s、72℃延伸45s，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min。
二、尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR检测试剂盒的检测方法
以含有尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的样品作为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒。具体步骤如下：
1)反转录反应：在PCR管中加入待测样品总RNA 3μL、浓度为100μmol/L的随机引物1μL和RNase-free ddH2O 7μL，70℃水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂：5×RTBuffer 5μL、浓度为10mmol/L dNTPs 2μL、浓度为200U/μL反转录酶1μL和浓度为40U/μLRNA酶抑制因子1μL，42℃水浴60min，70℃水浴10min后冷却至室温，合成cDNA；
2)双重RT-PCR反应：在PCR管中加入步骤1)合成的cDNA 1μL，每管加入浓度为5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、浓度为2.5mmol/L dNTPs 0.125μL、10×PCR Buffer2.5μL、浓度为25mmol/L MgCl21.5μL、浓度为10μmol/L NeLV-正向引物0.5μL、浓度为10μmol/L NeLV-反向引物0.5μL、浓度为10μmol/L NCLV-正向引物0.5μL、浓度为10μmol/L NCLV-反向引物0.5μL和ddH2O 17.375μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液在下述条件下反应：94℃预变性3min,然后94℃变性30s、54℃退火45s、72℃延伸45s，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min，反应结束；3)PCR扩增产物电泳检测：取PCR反应产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。
电泳检测结果如图1所示。从图中可以看出：待测样品的PCR扩增产物在218bp和479bp处均出现明亮的DNA条带。
实施例3、尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR检测试剂盒的特异性测定
分别以含有尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的样品、水仙普通潜隐病毒样品和尼润潜隐病毒样品作为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒。具体步骤同实施例2中的步骤1)-3)。
结果如图2所示。含有尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的样品的PCR扩增产物含有大小为218bp和479bp的DNA条带，尼润潜隐病毒样品的PCR扩增产物仅含有大小为218bp的DNA条带、水仙普通潜隐病毒的样品的PCR扩增产物仅含有大小为479bp的DNA条带，而从阴性对照上未扩增到任何特异性DNA条带。说明本发明的试剂盒具有较强的特异性。
实施例4、尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR检测试剂盒的灵敏度测定
将尼润潜隐病毒样品、水仙普通潜隐病毒样品的模板分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6倍后作为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒。具体步骤同实施例2中的步骤1)-3)。
结果如图3所示。由图3可知，本发明的方法可以分别检测稀释到10-2倍的尼润潜隐病毒样品、10-4倍的水仙普通潜隐病毒样品。说明本发明试剂盒具有很高的灵敏度。
实施例5、进出境水仙样品的尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的检测
选取50份我国田间水仙样品和30份口岸截获的水仙样品，共80份样品作为待测样品，其中，50份田间水仙样品共有单瓣水仙和复瓣水仙2个品种，30份口岸截获的水仙样品共有Tahiti、Dutch Master、Ice Follies、Pink Charm、Geranium、Las Vegas、BabyBoomer、Avalanche和Hawere 9个品种。
提取待测样品的RNA后采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒。具体步骤同实施例2中的步骤1)-3)。试验同时以单一引物的普通RT-PCR方法进行各个病毒的验证，采用NeLV-正向引物和NeLV-反向引物对尼润潜隐病毒进行检测，采用NeLV-正向引物和NeLV-反向引物对水仙普通潜隐病毒进行检测，具体步骤参照实施例2中的步骤1)-3)。
结果表明：本发明的方法检出的感染尼润潜隐病毒的样品有32份、感染水仙普通潜隐病毒的样品有11份，该检测结果与普通RT-PCR方法检测结果完全相符。说明本发明的方法检测结果准确可靠。
序列表
<110>福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的双重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
gtcccgcctg aatcaatagc a 21
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
ttcgtcccaa tcatgtagtt cc 22
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
cctgacccca gcaatcctt 19
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
ggcctccgaa ttaacccctc 20

Claims (10)

1.用于鉴定尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒的成套引物对，由特异引物对甲和特异引物对乙组成；
所述特异引物对甲由引物NeLV-F和引物NeLV-R组成；
所述特异引物对乙由引物NCLV-F和引物NCLV-R组成；
所述引物NeLV-F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物NeLV-R为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物NCLV-F为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物NCLV-R为如下b3)或b4)：
b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。
2.如权利要求1所述的成套引物对，其特征在于：
所述引物NeLV-F、所述引物NeLV-R、引物NCLV-F和所述引物NCLV-R的摩尔比为1:1:1:1。
3.权利要求1或2所述的成套引物对在如下c1)-c8)中任一所述的应用：
c1)制备用于鉴定尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒的产品；
c2)鉴定尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒；
c3)制备用于鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒的产品；
c4)鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒；
c5)制备用于鉴别尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的产品；
c6)鉴别尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒；
c7)制备用于检测待测样品中是否含有尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒的产品；
c8)检测待测样品中是否含有尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒。
4.含有权利要求1或2所述成套引物对的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下d1)-d4)中任一种：
d1)鉴定尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒；
d2)鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒；
d3)鉴别尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒；
d4)检测待测样品中是否含有尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒。
5.权利要求4所述试剂盒的制备方法，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；
(Ⅱ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。
6.一种鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用权利要求1或2所述的成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为218bp的条带，则所述待测病毒为尼润潜隐病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为479bp的条带，则所述待测病毒为水仙普通潜隐病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中不含有大小为218bp的条带且不含有大小为479bp的条带，则所述待测病毒不为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒。
7.一种鉴别尼润潜隐病毒和水仙普通潜隐病毒的方法，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用权利要求1或2所述的成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为218bp的条带，则所述待测病毒为尼润潜隐病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为479bp的条带，则所述待测病毒为水仙普通潜隐病毒；
所述待测病毒为尼润潜隐病毒或水仙普通潜隐病毒。
8.一种检测待测样品中是否含有尼润潜隐病毒和/或水仙普通潜隐病毒的方法，包括如下步骤：以待测样品的cDNA为模板，采用权利要求1或2所述的成套引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为218bp的条带，则所述待测样品含有尼润潜隐病毒；反之则所述待测样品不含有尼润潜隐病毒；
若所述RT-PCR扩增产物中含有大小为479bp的条带，则所述待测样品含有水仙普通潜隐病毒；反之则所述待测样品不含有水仙普通潜隐病毒。
9.权利要求1中所述的特异引物对甲或权利要求1中所述的特异引物对乙。
10.如下h1)-h6)任一所述的应用：
h1)权利要求1中所述的特异引物对甲在制备用于检测尼润潜隐病毒的产品中的应用；
h2)权利要求1中所述的特异引物对甲在鉴定尼润潜隐病毒中的应用；
h3)权利要求1中所述的特异引物对甲在鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒中的应用；
h4)权利要求1中所述的特异引物对乙在制备用于检测水仙普通潜隐病毒的产品中的应用；
h5)权利要求1中所述的特异引物对乙在鉴定水仙普通潜隐病毒中的应用；
h6)权利要求1中所述的特异引物对乙在鉴定待测病毒是否为水仙普通潜隐病毒中的应用。
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