CN104513867A

CN104513867A - 基于环介导等温扩增技术检测啤酒花矮化类病毒的引物组、试剂盒和方法

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Publication number: CN104513867A
Application number: CN201410851964.7A
Authority: CN
Inventors: 吴兴海; 张成标; 魏晓棠; 甘琴华; 封立平; 历艳; 王简; 宋涛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-12-29
Filing date: 2014-12-29
Publication date: 2015-04-15

Abstract

本发明公开了一种基于环介导等温扩增技术检测啤酒花矮化类病毒的引物组、试剂盒和方法，引物组包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，其序列分别为SEQ ID NO:1～4；试剂盒包含如下组分：1）环介导等温扩增反应液A；2）阳性对照样品；3）空白对照样品；4）显色剂；方法包括下列步骤：1）待检样品RNA提取；2）啤酒花矮化类病毒环介导等温扩增；3）显色检测。本发明提供的快速检测啤酒花矮化类病毒的分子生物学方法，与现有技术相比，具有简便易行、检测高效性、灵敏度高、准确性高、特异性强等特点。

Description

基于环介导等温扩增技术检测啤酒花矮化类病毒的引物组、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及一种基于环介导等温扩增技术检测啤酒花矮化类病毒的引物组、试剂盒和方法，属于生物检测试剂技术领域。

背景技术

类病毒是迄今已知的引起植物病害的最小致病因子，为环状RNA分子，其全长基因组由246～399个核苷酸组成，能引起许多经济作物产生严重病害。根据其序列和结构的同源性、复制特性分为2个组，分别为马铃薯纺锤块茎类病毒组(PSTVd)和鳄梨日斑类病毒组(ASBVd)。啤酒花矮化类病毒( Hop stunt vroid)属于马铃薯纺锤块茎类病毒科啤酒花矮化类病毒属，通常含307个左右核苷酸。1970年，日本的Yamamoto 等人首次在矮化的啤酒花上发现了啤酒花矮化类病毒。1985年,日本的Sano首次在葡萄上发现了HSVd, 经过15年的研究，认为HSVd的初侵染源为葡萄, 在进化过程中逐渐适应了新的寄主。目前国内外已报道的HSVd寄主包括黄瓜、葡萄、桃、李、扁桃、杏等草本及木本植物。中国已经在啤酒花、桃、李、杏、葡萄、扁桃等植物上报道了HSVd。因此，建立啤酒花矮化类病毒的新型检测鉴定方法，对于提高啤酒花矮化类病毒的检疫检验效率、防止啤酒花矮化类病毒的传入、传出，保护我国农业的安全生产，促进我国农产品的顺利出口，具有十分重要的意义。植物类病毒由于不显性侵染比较普遍，症状表现受环境温度的影响较大，而且几种鉴别植物对不同类病毒的反应症状相似，故难于应用生物测定的方法。由于类病毒不能产生任何蛋白质，所以也不能使用检测病毒的电镜、血清学方法。因此，选用分子生物学方法对啤酒花矮化类病毒进行检测。

在现有的核酸检测方法中，常用的有聚合酶链式反应（常规PCR和实时荧光PCR），该方法灵敏、特异，但需要高品质热循环仪，而且因为温度循环导致较长。其他新开发的核酸扩增方法，比如NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）、3SR(self-sustained sequence replication)、SDA（strand displacement amplification）等，在扩增循环，都有各自的创新点。NASBA和3SR使用一系列转录和反转录过程来循环以避免高温变性作用，SDA则使用限制性内切酶和修饰过的模板来循环扩增。虽然它们的敏感性都很高，可以检测并扩增小于10个拷贝的核酸样本，但是它们还有各自需要克服的缺点。技术要求、材料要求、技术本身特异性缺陷等方面严重束缚了这些技术的推广应用。因此，有必要提供一种更便捷，检测灵敏度更高的检测啤酒花矮化类病毒的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题的是提供一种用于检测啤酒花矮化类病毒的环介导等温扩增的引物组、试剂盒和检测方法，即利用环介导等温扩增方法检测啤酒花矮化类病毒的引物和试剂盒，本发明可以克服其他检测方法在病毒检测的局限性，为啤酒花矮化类病毒的检测提供有效工具，能够快速、特异性强、灵敏度高而且低成本的检测啤酒花矮化类病毒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供的啤酒花矮化类病毒RT-LAMP检测引物组，包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，它们的碱基序列分别为SEQ ID NO:1～4。

本发明提供的检测试剂盒，包含如下组分：

1）环介导等温扩增反应液A：

包含2×RT-LAMP Mix 12.5 μL、AMV-Bst混合液1.5 μL、RNase-Free Water 2.8 μL、RT-LAMP检测引物组6.2 μL，FIP和BIP各2.5 μL、终浓度均为1μM；F3和B3 引物各0.6 μL，终浓度均为0.25 μΜ;引物F3、B3、FIP和BIP分别具有序列表SEQ ID NO:1～4的碱基序列；

2）B反应液阳性对照样品：含啤酒花矮化类病毒RNA模板,作为阳性模板。

3）C反应液空白对照样品：为去离子水。

4）显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。

本发明还提供一种使用以上试剂盒，检测样品中啤酒花矮化类病毒的方法，依次包括下列步骤：

1）待检样品RNA提取

采取Trizol 法或RNA提取试剂盒抽提RNA模板。

2）啤酒花矮化类病毒环介导等温扩增

A:在反应管中依次加入待检模板RNA 2 μL和环介导等温扩增反应液A 23 μL，充分混匀。

B:在63 ℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60 min。

C:80 ℃终止反应，5 min取出待检。

扩增时，应设立2个对照：阳性对照（B反应液代替RNA模板）、空白对照（C反应液代替RNA模板）

3）显色检测

在每个反应管中加入1μL显色剂D，直接用肉眼观察颜色变化，在阳性对照和空白对照都成立的情况下（即B液出现扩增，加入显色剂后，扩增反应液颜色变为绿色；C液无扩增，加入显色剂后，扩增反应液颜色为橙色），如果样品的反应管中扩增反应液颜色变为橙色，说明待检样品不含啤酒花矮化类病毒，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有啤酒花矮化类病毒。

上述啤酒花矮化类病毒RT-LAMP检测方法在番茄、辣椒上的应用。

本发明提供的快速检测啤酒花矮化类病毒的分子生物学方法，具有灵敏度高、特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：

1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程。

2、检测高效性：该检测方法所用检测时间不足1小时，而PCR扩增时间较长，一般需要2小时以上，这样能大大提高了检测的效率。

3、灵敏度高：以啤酒花矮化类病毒RNA为模板，该方法的检测下限为10 fg/μL,是常规PCR的100倍。

4、准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源本底RNA 和杂质的影响，不需要从样本中纯化RNA，可直接利用发病组织或病残体提取RNA快速检测，大大提高了检测的准确度。

5、特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大幅提高，假阳性出现的概率也随之降低。

附图说明

图1是RT-LAMP特异性实验图。1：啤酒花矮化类病毒；2：阴性对照；3：苹果锈果类病毒；4：梨泡状溃疡类病毒；5：桃潜隐花叶病毒；6：苹果茎痘病毒；7：葡萄黄斑类病毒-2。

图2是RT-LAMP灵敏性实验图。其中1~8：1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5 、1×10^-6、1×10^-7、1.56×10^-8 ng/μLHSVd感病材料总RNA。

图3是RT-PCR灵敏性实验图。其中1~8：1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5 、1×10^-6、1×10^-7、1.56×10^-8 ng/μL HSVd感病材料总RNA。

具体实施方式

本发明采用环介导等温扩增（LAMP）技术，并根据啤酒花矮化类病毒全长基因序列设计了相应的RT-LAMP检测引物组，包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，由此发明了用于检测啤酒花矮化类病毒的RT-LAMP检测方法及试剂盒。应用本发明的检测方法及试剂盒，仅需通过对葡萄、啤酒花等疑似感染植株样品进行RNA提取并进行环介导等温扩增，即可快速检测出是否感染啤酒花矮化类病毒，方便基层快速、准确、简便地进行病害诊治，进而采取适当的防治措施，减少病害带来的损失。

实施例1 特异性实验

（1）引物设计

LAMP方法，只有当2对引物与目的片段的六个区域都匹配上时才能进行扩增。本发明根据NCBI核酸序列数据库中KJ754184.1 (山东分离物)、HM357802 .1（辽宁分离物），在保证扩增的兼并性和通用性的前提下通过比较分析基因高度保守区，设计LAMP 外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，设计完成后将引物在数据库的Primer-Blast模块下进行比对验证，最后选取以下RT-LAMP检测引物组：

外侧引物对F3和B3

上游引物F3：TGGAGTAGAGGCTCTGCC（见序列表SEQ ID NO:1），

下游引物B3：TCTTTGCATGCCTTTTGCG（见序列表SEQ ID NO:2）。

内侧引物对FIB和BIP，

上游引物FIP：GTCGCGTCTCCAAGAAGAGCC-CGAAACACCATCGATCGTCC（见序列表SEQ ID NO:3），

下游引物BIP: CTGCTCGGTTCGCTCCAACC-AGGGGCTCAAGAGAGGATC（见序列表SEQ ID NO:4）。

（2）病毒RNA的提取

取0.1 g啤酒花矮化类病毒、苹果锈果类病毒、梨泡状溃疡类病毒、桃潜隐花叶病毒、苹果茎痘病毒、葡萄黄斑类病毒-2样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000 g，离心10min。取上清，15℃~30℃，放置5min；加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），约15s。15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000 g，离心15min。小心吸取约为600 μL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500 μL异丙醇混合上清液，15℃~30℃，放置10min。2℃~8℃，12000 g，离心10min。去除上清液，沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗涤；2℃~8℃，7500 g，离心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μL ~50 μL无RNase的水中，即为待检模板RNA。

（3）六种类病毒环介导等温扩增

A:分别在反应管中依次加入六种类病毒的待检模板RNA 2 μL和环介导等温扩增反应液A 23 μL，充分混匀。

B:在63 ℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60 min。

C:80 ℃终止反应，5 min取出待检。

（3）显色检测

加入显色剂D进行显色反应，管3~管7，即苹果锈果类病毒、梨泡状溃疡类病毒、桃潜隐花叶病毒、苹果茎痘病毒、葡萄黄斑类病毒-2的RNA模板均无扩增，反应液颜色没有变化依然为橙色。阳性对照管管1（以反应液B为模板RNA）反应液颜色变为绿色，空白对照管管2（以反应液C为模板RNA）反应液颜色为橙色。凝胶见图1。

该组引物经在线BLAST的结果证实，具有很高的特异性，不会与其他病毒交叉反应。啤酒花矮化类病毒属于马铃薯纺锤块茎类病毒科，因此研究选择了同科近似种病毒梨泡状溃疡类病毒及其他四种葡萄、李、桃上常见的类病毒为测试毒种。经验证，除啤酒花矮化类病毒RNA出现扩增，反应管反应液变为绿色外，其余病毒均无扩增，反应管均为橙色，与预期相符，证明该组引物的良好特异性，与上述毒株均无交叉反应。

实施例2 敏感性实验

（1）用DEPC水将HSVd类病毒RNA模板液向下做10倍梯度稀释，依次为1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5 、1×10^-6、1×10^-7、1.56×10^-8ng/μL，各取2 μL为模板分别进行LAMP及RT-PCR扩增反应。扩增引物组包含：

外侧引物对F3和B3

上游引物F3：TGGAGTAGAGGCTCTGCC（见序列表SEQ ID NO:1），

下游引物B3：TCTTTGCATGCCTTTTGCG（见序列表SEQ ID NO:2）。

内侧引物对FIB和BIP，

（2）病毒RNA的提取

取0.1 g不同稀释浓度的样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000 g，离心10min。取上清，15℃~30℃，放置5min；加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），约15s。15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000 g，离心15min。小心吸取约为600 μL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500 μL异丙醇混合上清液，15℃~30℃，放置10min。2℃~8℃，12000 g，离心10min。去除上清液，沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗涤；2℃~8℃，7500 g，离心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μL ~50 μL无RNase的水中，即为待检模板RNA。

（3）不同浓度的啤酒花矮化类病毒环介导等温扩增

A:分别在反应管中依次加入不同稀释倍比的待检模板RNA 2 μL和环介导等温扩增反应液A 23 μL，充分混匀。

B:在63 ℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60 min。

C:80 ℃终止反应，5 min取出待检。

（4）RT-PCR扩增及检测

RT-PCR扩增体系参照TIANGEN公司的Quant一步法RT-PCR试剂盒说明配置，反应条件为50 ℃反转录30 min；94 ℃预变性2 min; 94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环反应35次；65 ℃延伸10 min。

取1.5 g琼脂糖，于100 mL 电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL～6 mL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。

（5）显色检测

加入显色剂D进行显色反应，管1-管5即1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5 ng/μL的RNA样品均出现阳性扩增，反应液颜色变为绿色，其检测限可达到fg级；电泳结果显示，啤酒花矮化类病毒使用RT-PCR方法能够得到10^-3稀释倍数，只有pg级水平。这说明本发明的LAMP方法的检测灵敏度高出PCR方法100倍（见图2和图3）。

实施例3：实际样品检测及对比实验

将从山东、新疆等地田间采集的具有典型HSVd类症状的病样及实验室留样（进境法国、意大利葡萄苗等），分别采用LAMP、RT-PCR进行检测，比较两种方法的效果，以进一步评估LAMP方法的可靠性。

1、实际样品LAMP检测

1）病毒RNA的提取

取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000 g，离心10min。取上清，15℃~30℃，放置5min；加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），约15s。15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000 g，离心15min。小心吸取约为600 μL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500 μL异丙醇混合上清液，15℃~30℃，放置10min。2℃~8℃，12000 g，离心10min。去除上清液，沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗涤；2℃~8℃，7500 g，离心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μL ~50 μL无RNase的水中，即为待检模板RNA。

（3）不同来源样品的啤酒花矮化类病毒环介导等温扩增

B:在63 ℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60 min。

C:80 ℃终止反应，5 min取出待检。

（4）RT-PCR扩增及检测

（5）LAMP产物及PCR产物检测

LAMP产物加入显色剂D进行显色反应，PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示：利用上述LAMP和RT-PCR方法同时检测实际样品，所有不同地理来源的啤酒花矮化类病毒样品检测结果均为阳性，两种方法的符合率100%，但LAMP对设备要求更低，便捷性更高。

本发明所建立的检测方法能快速、准确的检测出啤酒花矮化类病毒，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为该病所引起的不同病害的早期预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态、社会和经济效益都具有现实而深远的意义。

<110> 张成标

<120> 基于环介导等温扩增技术检测啤酒花矮化类病毒的引物组、试剂盒和方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer F3

<400> 1

ggttaagctc actaaggaaa g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer B3

<400> 2

tcactttgct taataacctt ca 22

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer FIP

<400> 3

tgctaccaga ttctgatctt cctattgttg ctttgttgac acaa 44

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BIP

<400> 4

ttcaacttca agactttttg tctggtcagg aatgtcagac atgaa 45

Claims

1.一种环介导等温扩增的引物组，其特征在于，所述的引物组包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP，其序列分别为SEQ ID NO:1～4。

2.权利要求1所述的引物组在检测啤酒花矮化类病毒中的应用。

3.权利要求1所述的引物组在制备检测啤酒花矮化类病毒的试剂盒中的应用。

4.一种检测啤酒花矮化类病毒的环介导等温扩扩增试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含如下组分：

1）环介导等温扩增反应液A：

2×RT-LAMP Mix 12.5 μL、AMV-Bst混合液1.5 μL、RNase-Free Water 2.8 μL、RT-LAMP检测引物组6.2 μL，FIP和BIP各2.5 μL、终浓度均为1μM；F3和B3 引物各0.6 μL，终浓度均为0.25 μΜ；引物F3、B3、FIP和BIP分别具有序列表SEQ ID NO:1～4的碱基序列；

2）B反应液是阳性对照样品：含啤酒花矮化类病毒RNA模板，作为阳性模板；

3）C反应液是空白对照样品：为去离子水；

4）显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。

5.一种应用权利要求4所述的试剂盒检测样品中啤酒花矮化类病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤：

1）待检样品RNA提取

采取Trizol 法或RNA提取试剂盒抽提RNA模板，

2）啤酒花矮化类病毒环介导等温扩增

A:在反应管中依次加入待检模板RNA 2 μL和环介导等温扩增反应液A 23μL，充分混匀；

B:在63 ℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60 min；

C:80 ℃终止反应，5 min后取出待检；

扩增时，设立2个对照：阳性对照和空白对照；

3）显色检测

在每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，如果样品的反应管中扩增反应液颜色变为橙色，说明待检样品不含啤酒花矮化类病毒，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有啤酒花矮化类病毒。