CN105441437B

CN105441437B - 检测水稻黑条矮缩病毒的qRT-PCR及其应用

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Publication number: CN105441437B
Application number: CN201510767186.8A
Authority: CN
Inventors: 李新海; 周羽; 翁建峰; 郝转芳; 李明顺; 张德贵; 雍洪军; 张世煌
Original assignee: Northeast Agricultural University; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Northeast Agricultural University; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2018-09-11
Anticipated expiration: 2035-11-11
Also published as: CN105441437A

Abstract

本发明提供了检测水稻黑条矮缩病毒的qRT‑PCR及其应用，属于PCR检测技术领域。本发明首先通过对水稻黑条矮缩病毒基因组序列的比对，确定了保守区段，并以该保守区为靶序列设计了用于检测水稻黑条矮缩病毒的引物对和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示，本发明还提供了对水稻黑条矮缩病毒进行实时荧光定量检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，能够实现对作物早期感染水稻黑条矮缩病毒的定量检测，且成本低廉，具有良好的经济价值和应用前景。

Description

检测水稻黑条矮缩病毒的qRT-PCR及其应用

技术领域

本发明涉及PCR检测技术领域，特别是涉及用于检测水稻黑条矮缩病毒的靶序列、实时荧光定量RT-PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行水稻黑条矮缩病毒检测的方法和试剂盒。

背景技术

玉米粗缩病(Maize rough dwarf disease,MRDD)是世界性的玉米病毒病害，也是危害玉米最严重的病害之一。玉米粗缩病的典型症状是叶片变宽变短，叶夹角变小，叶色深绿，叶鞘及苞叶出现蜡白色突起，有明显的粗糙感；整个植株节间变粗、缩短，植株矮小、发育不良或畸形；根系不发达，不能抽雄或无花粉、雌穗变小或不能抽穗结实，发病严重的植株可能提前枯死，导致绝产。

玉米粗缩病病原主要为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)，南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)，玉米粗缩病毒(Maize roughdwarf virus,MRDV)和马德里约柯托病毒(Mal de Rio Cuarto virus,MRCV)。在亚洲导致玉米粗缩病的病原是RBSDV或SRBSDV；在欧洲，病原是MRDV；在南美洲，病原是MRCV。以上病毒是以灰飞虱(Laodelphax striatellus,SBPH)或白背飞虱(Sogatella furcifera)为介体持久性传播的病毒，同时也是水稻黑条矮缩病(Rice black-streaked dwarf disease,RBSDD)和小麦绿矮病(Wheat green dwarf disease,WGDD)等病害的主要病原。在我国黄淮海等地区导致MRDD的主要病原是RBSDV。RBSDV完整病毒粒子为等轴的20面球体，直径约为70-80nm，其基因组由10条线性双链RNA(dsRNA)组成，10条双链dsRNA按在PAGE电泳中迁移率由慢到快分别命名为S1-S10，大小从4.5kb到1.8kb。

目前，常用的检测植物病毒的方法主要包含：分子方法检测，电镜观察，血清学检测以及生物学接种试验等。但以上检测方法只能在RBSDV侵染植物的后期检测到，且只能半定量的确定有或者无，不能准确定量RBSDV的拷贝数。人工接种实验发现，RBSDV的最佳接种时间是在玉米的三叶期，但常规检测方法需至少在人工接种25天以上才能检测到RBSDV，使得发病初期机制及RBSDV侵染玉米的基础研究等受到限制。

国内外已有应用TaqMan探针荧光定量PCR技术检测病毒拷贝数的研究。TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3’-5’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。TaqMan探针法的定量PCR反应体系包含一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5’端标记有报告基因(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3’端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，一起检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’-5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团原来淬灭基团，其能量不能够被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到改扩增反应存在的线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量，即拷贝数。相对于SYBRGreenI的方法，TaqMan方法具有特异性高，重复性好等优点。此检测方法极大地提高了检测的灵敏度，且精确性好，甚至可检测单拷贝情况，且检测简便，快速，可重复性高。为了提高水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)早期感染检测的准确性，有必要建立灵敏度更好、特异性更好的检测方法来检测RBSDV。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测水稻黑条矮缩病毒的特异、灵敏、快速、简便的方法及其应用。

为实现上述目的，本发明通过对多年多点水稻黑条矮缩病毒基因核苷酸区段进行测序和比对，确定了保守区S5区段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该靶序列是检测水稻黑条矮缩病毒的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性区段也可以作为检测水稻黑条矮缩病毒的遗传标记物。本发明根据该保守序列，通过反复对比、筛选，设计了用于检测该遗传标志物的特异性引物对和探针。

在本发明的一个实施方式中，优选的特异性引物对的序列为：

S5-F：ATCAGACGAAAATATTGGACGTA(SEQ ID NO.1)(S5中位置：1989-2011)

S5-R：AATCACGTATTGAGTAACTGAACC(SEQ ID NO.2)(S5中位置：2077-2100)

Taqman荧光探针序列为：

S5-P：AAACCAAGCAGCAAAACACGTCA(SEQ ID NO.3)(S5中位置：2020-2042)

5’端用FAM标记，3’端用TAMARA标记。

本发明提供了上述特异性引物对和Taqma荧光探针在检测水稻黑条矮缩病毒中的应用。

本发明提供了上述特异性引物对和Taqma荧光探针在制备检测水稻黑条矮缩病毒试剂盒中的应用。

本发明提供了上述特异性引物对和Taqman荧光探针在防治作物病虫害中的应用。在本发明的实施例中，所述作物为玉米。

进一步地，本发明提供了含有上述特异性引物对和Taqman荧光探针的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为无菌水，所述阳性模板为水稻黑条矮缩病毒基因组RNA。

含有上述特异性引物对和荧光探针的试剂盒可通过Taqman法荧光定量PCR实现对水稻黑条矮缩病毒的特异、快速检测。

具体地，该试剂盒基于实时荧光定量RT-PCR方法，对待测样本提取基因组RNA后以其为模板，利用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的特异性引物对和SEQ ID NO.3所示的荧光探针进行实时荧光定量RT-PCR，检测待测样本中的水稻黑条矮缩病毒。

更进一步地，本发明提供了上述试剂盒在防治作物病虫害中的应用。在本发明的实施例中，所述作物为玉米。

本发明提供一种检测水稻黑条矮缩病毒的方法，对待测样本提取基因组RNA后以其cDNA为模板，利用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的特异性引物对和SEQ ID NO.3所示的荧光探针进行实时荧光定量RT-PCR，检测待测样本中的水稻黑条矮缩病毒。

所述实时荧光定量RT-PCR的反应体系为：

反应条件为:

预变性1个循环95℃15min；95℃30sec，60℃30sec，共40个循环。

所述待测样本为玉米、水稻或小麦。

本发明提供的上述检测水稻黑条矮缩病毒的方法在防治作物病虫害中的应用也属于本发明的保护范围。

基于本法的上述检测水稻黑条矮缩病毒的方法，根据扩增曲线判定结果，并根据Ct值计算样品中病毒含量。在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值小于36的标本为阳性结果；Ct值大于36或无Ct值的标本为阴性结果；

Ct值在35-36之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于35判定为阳性扩增，超过35或无Ct值判定为阴性扩增。

采用本发明的特异性引物对和Taqman荧光探针运用Taqman荧光定量RT-PCR方法检测水稻黑条矮缩病毒，检测灵敏度能达到1个拷贝/μl。

本发明根据水稻黑条矮缩病毒基因组保守区序列设计引物和探针，可以通过qRT-PCR进行水稻黑条矮缩病毒基因组的定量检测，检测灵敏度、特异性均优于现有技术，并能够实现早期检测作物感染水稻黑条矮缩病毒的情况。本发明通过水稻黑条矮缩病毒基因组S5区段标准品构建标准曲线，可以进行水稻黑条矮缩病毒基因拷贝数的定量检测，检测结果精确。本发明发现在人工接种RBSDV 3天后，采用本发明的qRT-PCR就能有效检测到玉米感染了RBSDV，远远小于常规RT-PCR检测方法需要在人工接种25天后才能检测到RBSDV的时间，因此本发明方法极大的缩减了检测成本提高了检测效率，便于早期病株的筛选，可用于作物此类病虫害的防治，具有良好的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为本发明方法检测RBSDV的扩增曲线图。图中曲线1-3为B73接种RBSDV 20d的荧光定量检测曲线三次重复；4-6为B73接种RBSDV 6d的荧光定量检测曲线三次重复；7-9为B73接种RBSDV 3d的荧光定量检测曲线三次重复；10-12为B73接种RBSDV 1.5d的荧光定量检测曲线三次重复。

图2为本发明方法检测RBSDV的标准曲线图。

图3为本发明方法退火温度优化图，图中1-6分别为：56.7℃；60.1℃；58.1℃；55.7℃；62.3℃；64.3℃。

图4为本发明方法检测玉米粗缩病和玉米矮花叶病扩增曲线，图中1-3检测玉米粗缩病；4-6检测玉米矮花叶病。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 水稻黑条矮缩病毒保守序列的选择与特异性引物的设计

通过多年多点的水稻黑条矮缩病毒基因核苷酸序列测序和比对，确定保守区S5区段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该靶序列是检测水稻黑条矮缩病毒的遗传标记物。

本发明于2012-2013年在北京(I)、河北唐山(II)和保定(III)、山东济南(IV)和济宁(V)、河南郑州(VI)和信阳(IX)、江苏盐城(VII)和南京(VIII)采集表现典型症状的玉米粗缩病和水稻黑条矮缩病样品共计21份(12IM-1、13IM-1、13IIM-1、13IIIM-1、13IIIR-1、13IVM-1、13VM-1、13VM-2、13VM-3、13VR-1、13VR-2、13VR-3、13VIM-1、13VIM-2、13VIR-1、13VIIM-1、13VIIM-2、13VIIM-3、13VIIIM-1、13VIIIR-1、13IXM-1)，采用26对RBSDV基因组S1-S10特异性引物扩增。结果显示，RBSDV-S5的保守区域最多。比对所有样品的S5区段，确定与其它样品S5区段相似性较高的13IIIM-1样品S5序列为保守区S5序列(SEQ ID NO.4)。

根据S5保守序列，通过反复对比、筛选，设计了用于检测该遗传标志物的特异性引物对和探针。

本发明的引物设计遵循以下原则：避免引物自身或之间形成4个以上连续配对，无环状发卡结构；18-24bp长；Tm值55-65℃，GC含量在40％-60％之间，两个引物Tm值相差不超过2℃；3’端不出现A，且不出现三个或三个以上连续相同碱基；引物后5个核苷酸不能有超过2个G和C；扩增片段长度在50-150bp最佳。

本发明探针设计遵循以下原则：尽量靠近上游引物；长度20-30bp；检测折叠和二级结构；Tm值65-70℃，GC含量40％-70％，5’端无G，C含量高于G；

本发明通过筛选获得的用于扩增水稻黑条矮缩病毒各血清型特异性的保守靶序列的特异性引物对的序列为：

S5-F：ATCAGACGAAAATATTGGACGTA(S5中位置：1989-2019)

S5-R：AATCACGTATTGAGTAACTGAACC(S5中位置：2077-2100)

Taqman荧光探针序列为：

S5-P：AAACCAAGCAGCAAAACACGTCA(S5中位置：2020-2042)

5’端用FAM标记，3’端用TAMARA标记。

针对目标基因，本实施例还设计了另外2对引物和对应的探针(见下方)，但扩增效果均不如S5-F、S5-R、S5-P的检测效果，因此本实施例选用上述引物和探针为检测水稻黑条矮缩病毒的最佳引物对和探针。

针对目的基因保守序列另外设计的引物和探针：

S5-F-1：CATCAGAAGAAATGTGTATGCCTT(第2510-第2533)

S5-R-1：CCGAGATTTCTGAGTCGCAAC(第2637-第2657)

S5-P-1：GGCAGATTGGGAATTGACGATGA(第2551-第2573)

S5-F-2：GCAGCAAAACACGTCAGT(第2027-第2044)

S5-R-2：AGCTGCTCCTTCATGCTT(第2140-第2157)

S5-P-2：TCAATACGTGATTCCAGAATGGCT(第2088-第2111)

实施例2 水稻黑条矮缩病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

以水稻黑条矮缩病毒总RNA反转录的cDNA为模板，以S5-11(序列：ACGCAAACCTTATTTCCGATTC；S5中位置：1842-1864)和S5-12(序列：GCATCTAAGGAGACACAGAACCC；S5中位置：3117-3139)引物进行RT-PCR扩增，目的条带切胶回收，将其连接至pEASY-Blunt Cloning Kit克隆载体，再将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选、PCR鉴定阳性克隆，提取重组质粒，测序分析，测序结果和目的片段完全一致的即为重组质粒。

以S5-11和S5-12(表1)为引物扩增重组质粒，常规KOD-Plus-NEO(TOYOBO)PCR体系(50μl)，扩增条件：94℃5min，94℃30s，56℃30s，68℃30s，35循环，68℃12min，12℃保存，获得的目的片段纯化后作为标准品。

计算拷贝数，分别10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍稀释，采用S5-F和S5-R引物进行实时荧光定量RT-PCR扩增，绘制标准品的标准曲线。拷贝数(copies/μl)＝浓度(g/μl)×6.02×10²³/转录物长度(bp)/340。

表1 RNA标准品扩增引物

以S5-11和S5-12为引物扩增重组质粒，获得的目的片段纯化后作为标准品，计算拷贝数，分别10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸倍稀释，采用实施例1确定的最优特异性引物对S5-F和S5-R引物进行实时荧光定量RT-PCR扩增，绘制标准品的标准曲线，见图2。

一般一条标准曲线取5-6个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复3-5次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。倍比梯度稀释方法：

1μl原液(标准品i)+9μl稀释缓冲液，得标准品ii

1μl标准品ii+9μl稀释缓冲液，得标准品iii

1μl标准品iii+9μl稀释缓冲液，得标准品iv

1μl标准品iv+9μl稀释缓冲液，得标准品v

1μl标准品v+9μl稀释缓冲液，得标准品vi

1μl标准品vi+9μl稀释缓冲液，得标准品vii

1μl标准品vii+9μl稀释缓冲液，得标准品viii

标准曲线拷贝数及Ct值详见表2，计算标准曲线为Y＝-4.06X+42.81。根据RBSDV-S5片段建立病毒检测标准曲线(图2)，用于计算植株病毒拷贝数。

表2 拷贝数及Ct值对应表

TransZol^TM Up(Transgen Biotech)法提取单株玉米叶片总RNA，采用Fast QuantRT Kit(With gDNase)(Tiangen)试剂盒反转录。稀释并调整各样品cDNA浓度，浓度均为100ng/μl。

根据如下反应体系进行实时荧光定量RT-PCR：

反应条件为：预变性95℃15min；95℃30sec，60℃30sec，共40个循环。

采用Bio-Rad公司IQ5荧光定量PCR仪及Bio-Rad IQ5分析软件进行试验和数据分析。

对退火温度进行优化，在55-65℃范围内对退火温度进行优化。

退火温度优化结果显示(图3)，退火温度在60℃最合适。

实施例3 水稻黑条矮缩病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法的特异性评价

田间取玉米矮花叶病和玉米粗缩病病症明显的植株，提取叶片RNA，反转录后采用实施例2中的方法进行检测，结果显示玉米矮花叶病病株均呈阴性，而玉米粗缩病病株均呈阳性，如图4所示。说明本发明实施例2建立的水稻黑条矮缩病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性良好，能够特异性检测玉米粗缩病病株的病原RBSDV。

实施例4 本发明的实时荧光定量RT-PCR检测玉米中水稻黑条矮缩病毒

采用实施例2建立的水稻黑条矮缩病毒的实时荧光定量RT-PCR检测经人工接种了RBSDV的玉米中的RBSDV感染量。

采用集团网箱接种法在玉米三叶期进行水稻黑条矮缩病毒的人工接种，分别在接种后1.5d、3d、6d、20d单株取玉米叶片，同处理下未接种玉米叶片作为对照。样品保存于-80℃冰箱。

TransZol^TM Up(Transgen Biotech)法提取单株玉米叶片总RNA，采用Fast QuantRT Kit(With gDNase)(Tiangen)试剂盒反转录。

针对人工接种后1.5d、3d、6d、20d的RNA样品进行扩增，可以单株鉴定植株苗期的带毒情况，并确定RBSDV的RNA拷贝数。

利用实时荧光定量RT-PCR分别对未接种、无毒灰飞虱接种和带毒灰飞虱接种B73的0d、1.5d、3d、6d、20d样品按编号检测携带RBSDV情况。结果显示，接种0d、未接种和无毒灰飞虱接种的所有时间样品均检测不到病毒(图1)；带毒灰飞虱接种1.5d的B73病毒含量很低或检测不到，接种的B73在3d、6d、20d的B73均检测到病毒，且三次重复结果一致(图1)。

标准曲线显示所有RNA标准品的Ct值基本在一条直线上，没有任何一个标准品出现大的偏差，根据计算公式Y＝-4.06X+42.81，可以计算获得未知玉米样品中RBSDV RNA的准确拷贝数。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.用于检测水稻黑条矮缩病毒的引物和荧光探针组合，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的引物和荧光探针组合在检测水稻黑条矮缩病毒中的应用。

3.含有权利要求1所述的引物和荧光探针组合的试剂盒。

4.权利要求3所述的试剂盒在检测水稻黑条矮缩病毒中的应用。

5.一种检测水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组RNA后以其为模板，利用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的特异性引物对和SEQ ID NO.3所示的荧光探针进行实时荧光定量RT-PCR，检测待测样本中的水稻黑条矮缩病毒。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR的反应条件为预变性95℃15min；95℃30sec，60℃30sec，共40个循环。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样本为玉米、水稻或小麦。