CN106566895B - 一种同时检测鲤科疱疹病毒ι型、ⅱ型和ⅲ型的pcr引物、试剂盒及用途 - Google Patents

一种同时检测鲤科疱疹病毒ι型、ⅱ型和ⅲ型的pcr引物、试剂盒及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的PCR引物、试剂盒及用途。所述引物为CyHV‑F和CyHV‑R，序列如SEQ ID NO:1和2所示。采用本发明的引物进行检测，不与其它病毒发生交叉反应，假阳性率低，可同时快速、准确、简便检测并区分三种类型鲤科疱疹病毒CyHV‑Ⅰ、CyHV‑Ⅱ和CyHV‑Ⅲ。为鲤科疱疹病毒病的早期诊断和预防防治提供分子生物学技术依据。具有广泛适用性和实用性。

Description

一种同时检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的PCR引物、试剂 盒及用途
技术领域
本发明涉及水产养殖动物病原检测技术，尤其涉及一种同时检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的PCR引物、试剂盒及用途。
背景技术
近年来，CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ已给世界范围内的鲤科鱼养殖业造成巨大的经济损失。鲤科疱疹病毒Ⅰ型(Cyprinid herpesvirusⅠ,CyHV-Ⅰ)又称为鲤痘疱疹病毒(Carppox herpesvirus)或上皮癌疱疹病毒( Herpesvirus epithelioma)，常引起鲤痘疮病(Fish pox)。早在1563年有记载CyHV-Ⅰ引起的鲤痘疮病。20世纪初该病流行于欧洲。1957年在我国上海一养殖鱼池中发现该病。CyHV-Ⅰ主要危害1龄以上的鲤鱼，对鲫鱼、鲤与金鱼杂交种等也有危害，对于同池混养的草鱼、青鱼、鲢等鱼类没有危害。
鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）又名金鱼造血器官坏死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus,GFHNV)，感染引起的鲫鱼疱疹病毒病是目前发现的唯一感染异育银鲫的病毒性疾病，传播范围广，传染性强，发病快，死亡率极高，可通过水平和垂直传播，是我国水产养殖业危害最为严重的病毒病之一。该病首先在1992-1993年于日本养殖的金鱼中被鉴定出，也是首次报道，曾给日本金鱼养殖业造成巨大的经济损失。该病毒2009年在我国江苏地区首次出现，濒死的鲫鱼症状为鳃丝出血。2011和2012年，CyHV-Ⅱ同样感染了我国养殖的异育银鲫，给我国鲫鱼养殖业造成了巨大的经济损失。2013年在江苏、广州、北京、武汉等地养殖的异育银鲫中也检测出CyHV-Ⅱ，表明CyHV-Ⅱ在我国已有较广泛的分布。
鲤疱疹病毒Ⅲ型又称锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)，1997年在以色列首次导致养殖动物发病，之后在瑞典、美国、新加坡、南非、马来西亚、印度尼西亚等地均有发病。我国于2000年在广东省爆发了该病，KHV可感染鲤鱼除幼鱼外所有龄期鱼。
目前CyHV-Ⅰ和CyHV-Ⅲ 病毒病较少爆发，主要是CyHV-Ⅱ病毒病爆发较多。对于CyHV-Ⅱ病毒的检测主要是电子显微镜观察和分子生物学诊断方法。由于缺少适合培养CyHV-Ⅱ的细胞系，因此 CyHV-Ⅱ诊断大多先对发病鱼组织进行组织学检查后再经电镜观察进行确证。
传统病毒病的诊断需要进行病毒分离，细胞培养，电镜观察以及免疫检测等方法，缺乏对病毒的快速、准确、敏感的检测方法。PCR检测方法操作简单、特异性好、快速、敏感，能提早检测出处于潜伏期的病鱼，以便能及时预防并采取相应措施，将该病的损失尽量降低。PCR 法由于其可以检测到组织中极微量的病毒 DNA，是目前较为精确检测 CyHV-Ⅱ 感染的分子生物学方法。目前还未见报道基于分子生物学技术可以同时快速检测并区分鲤科疱疹病毒3种病毒型的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以同时快速、准确、简便检测并区分三种类型鲤科疱疹病毒CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ和CyHV-Ⅲ的方法。为鲤科疱疹病毒病的早期诊断和预防防治提供分子生物学技术依据。
为实现上述目的， 本发明提供一种用于同时快速检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的PCR引物，其特征在于，所述引物为CyHV-F和CyHV-R，序列如SEQ ID NO:1和 2所示。
本发明的另一个方面，提供一种用于同时快速检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的PCR检测试剂盒，其特征在于，含有所述的引物。
本发明的另一个方面，提供一种用所述PCR引物或所述PCR检测试剂盒检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的用途。
本发明的另一个方面，提供一种用所述PCR引物或所述PCR检测试剂盒检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的方法。
进一步，所述检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的方法，其特征在于，步骤为：
提取DNA，
PCR扩增检测，采用PCR引物或权利要求2的PCR检测试剂盒进行PCR扩增；阳性对照为SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核酸序列混合作为模板，阴性对照为：不含有鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型任一病毒的任意DNA核酸序列；
结果判定：
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为182 bp时，结果为CyHV-Ⅰ或CyHV-Ⅲ阳性；如果没有182 bp条带，则为CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅲ阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为302 bp时，结果为CyHV-Ⅱ病毒阳性；如果没有302 bp条带，则为CyHV-Ⅱ病毒阴性；
当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效；
当阳性对照无条带时，表明引物或者试剂盒中相关试剂降解，引物或试剂盒失效。
进一步，所述PCR检测的PCR反应体系为：10倍浓度的含镁离子的Taq DNA聚合酶缓冲液2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，各引物终浓度为0.4 μM，提取好待检测的DNA 模板10ng-100 ng，纯水补齐至25μL。
进一步，所述PCR检测的PCR反应条件为：95℃ 3分钟，1个循环；95℃ 30秒，58℃30秒，72℃ 20秒，35个循环；72℃ 10分钟，1个循环；4℃ 保存。
本发明根据鲤科疱疹病毒CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ编码胸腺嘧啶脱氧核苷激酶ORF140的保守核酸序列，设计用于检测CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ的特异性引物。本发明通过对所设计的引物进行兼并碱基引物修饰后，可同时对CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ病毒具有非常高的灵敏性和特异性。
本发明所述引物序列如下：
鲤科疱疹病毒
上游引物：CyHV-F: CACCTCTTGTTTTCSGCCAAC SEQ ID NO:1
下游引物：CyHV-R: AGGTCMGGCCTGGGCAGACC SEQ ID NO:2
本发明实施例所用的阳性质控品
阳性质控品：包括鲤科疱疹病毒CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ的核酸DNA。其中CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ和CyHV-Ⅲ分别为人工合成含有上述引物扩增目的片段的如下序列：
CyHV-Ι:CACCTGCTCTTCTCCGCCAACAGGTGGGAGCTGGTGCCCCTGATGAAGCAGAAGCTGGAACGGGGGACGAGCCTGGTGTTGGACAGGTACGCATTCTCCGGTGTGGCATTCAGCAGCGCGAAACCTGACATGCCCGTGGAGTGGTGCATGGGACCAGATGTGGGTCTACCCAAGCCTGACCT SEQ ID NO:3；
CyHV-Ⅱ:CACCTCTTGTTTTCGGCCAACAGATGGGAACTGGAGCCTCTGATCCGTTCAAAGATAGAGTCCGGTGTAACTCTGGTGGTGGACAGGTACGCCTTCTCGGGTATCTGTTTCACAGCTGCCAAGGTGTGTGGTGGTGGTAGCAGCAGCAACTCGAAAGTAGCTCCTCTGGAGTGTGTCAACTCGAAAGTAGAACAAGAGTCTGCTCGGGCTCTGGAGTGTATCAACTCGAAAGTAGAAGAAGAAGAGTCTGCTGTTCTTGAGTGGTGCAAAAACTCGGACAGAGGTCTGCCCAGGCCGGACCT SEQ ID NO:4；
CyHV-Ⅲ:
CACCTCCTGTTCTCGGCCAACCGATGGGAAGCCGCCTCCGACCTGAAGCGCAAGCTGATGAAGGGTACCACCATCGTGCTCGACCGCTACGCGTTCTCCGGCGTAGCCTTCACGGCGGCGAAGCCCGGGTTCGAGCTCGAGTGGTGTAAGCGAACCGACGTGGGTCTGCCCAAGCCCGACCT SEQ ID NO:5。
本发明提供了一种依赖于PCR的分子检测方法及检测试剂盒，为鲤科疱疹病毒CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ的同时检测提供一种快速、简便、准确的检测方法及试剂盒。通过对引物的设计与筛选，使得检测的灵敏度更高，特异性更好，检测限低至10拷贝/μL，提高了检测水平。所建立的PCR体系可重复性好，稳定性强。该试剂盒为鲤科疱疹病毒CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ的检测提供更有效的检测方法，具有广泛的应用前景。
本发明所选的病毒PCR特异性引物均是针对鲤科疱疹病毒CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ病毒的专用检测引物，特异性强。是本发明的申请人经大量试验验证后，筛选出的一对具有较高特异性的引物，具有非常好的敏感性且检测限低、成本低、效率高。
本发明涉及鲤科疱疹病毒CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ三种不同类型的病毒，在对三种病毒的核酸进行充分比对后，申请人选择了在三种病毒之间保守性较好的序列，且不与其它病毒发生交叉反应，假阳性率低，能够即时特异性的检测出不同类型的鲤疱疹病毒株，具有广泛适用性和实用性。
附图说明
图1为PCR体系中CyHV-Ⅰ病毒检测的敏感性实验结果图；
图2为PCR体系中CyHV-Ⅱ病毒检测的敏感性实验结果图；
图3为PCR体系中CyHV-Ⅲ病毒检测的敏感性实验结果图；
图4为PCR体系中同时检测CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ的敏感性实验结果图；
图5为PCR体系中对CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ 病毒特异性检测实验结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：检测鲤科疱疹病毒CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ试验
1）试剂
10×Taq Buffer：Tris-HCl 100 mM，KCl 500 mM，MgCl2 20 mM，dNTPs 2 mM，Taq酶1 U/μL；
引物：CyHV-F、CyHV-R，各10 μM，纯水，阳性质控品DNA 10μg/ml；
引物序列分别为：
上游引物：CyHV-F: CACCTCTTGTTTTCSGCCAAC SEQ ID NO:1
下游引物：CyHV-R: AGGTCMGGCCTGGGCAGACC SEQ ID NO:2
阳性质控品：包括鲤科疱疹病毒CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ病毒的核酸DNA。其中CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ和CyHV-Ⅲ分别为人工合成（铂尚生物技术（上海）有限公司，以下均同此）含有上述引物扩增目的片段的如下序列：
CyHV-Ι:CACCTGCTCTTCTCCGCCAACAGGTGGGAGCTGGTGCCCCTGATGAAGCAGAAGCTGGAACGGGGGACGAGCCTGGTGTTGGACAGGTACGCATTCTCCGGTGTGGCATTCAGCAGCGCGAAACCTGACATGCCCGTGGAGTGGTGCATGGGACCAGATGTGGGTCTACCCAAGCCTGACCT SEQ ID NO:3；
CyHV-Ⅱ:CACCTCTTGTTTTCGGCCAACAGATGGGAACTGGAGCCTCTGATCCGTTCAAAGATAGAGTCCGGTGTAACTCTGGTGGTGGACAGGTACGCCTTCTCGGGTATCTGTTTCACAGCTGCCAAGGTGTGTGGTGGTGGTAGCAGCAGCAACTCGAAAGTAGCTCCTCTGGAGTGTGTCAACTCGAAAGTAGAACAAGAGTCTGCTCGGGCTCTGGAGTGTATCAACTCGAAAGTAGAAGAAGAAGAGTCTGCTGTTCTTGAGTGGTGCAAAAACTCGGACAGAGGTCTGCCCAGGCCGGACCT SEQ ID NO:4；
CyHV-Ⅲ:
CACCTCCTGTTCTCGGCCAACCGATGGGAAGCCGCCTCCGACCTGAAGCGCAAGCTGATGAAGGGTACCACCATCGTGCTCGACCGCTACGCGTTCTCCGGCGTAGCCTTCACGGCGGCGAAGCCCGGGTTCGAGCTCGAGTGGTGTAAGCGAACCGACGTGGGTCTGCCCAAGCCCGACCT SEQ ID NO:5。
阴性质控品：不含CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ这三种病毒的任何DNA质粒。
以上三种病毒核酸片段分别转入载体后，挑取阳性克隆菌落培养并提取质粒测其浓度后作为阳性质控品。
检测方法及步骤：
病毒核酸DNA的提取：
取疑似鲤科疱疹病毒疾病发病组织约100 mg，加入400 μL裂解液（15 mmol/LNaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA,1% SDS,pH8.0）研磨均匀，加入蛋白酶K，终浓度为100μg/ml，震荡混匀后于55℃温育1-2h。在反应液中加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇（25:24:1）混匀，去除残余蛋白，10000 r/min离心10 min后取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇（24:1）混匀，10000 r/min离心10 min，转移上层水相，加入1/10体积3 mol/L乙酸钠(pH 5.2),再加入2倍体积无水乙醇,混匀，12000 r/min离心5 min ，沉淀用75％冷乙醇洗涤2次，室温晾干后加入50 μL TE，于-20℃保存备用。
PCR扩增检测：
所述的PCR反应体系为25 μL，反应体系中包含有10倍浓度的含镁离子的Taq DNA聚合酶缓冲液2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，各引物终浓度为0.4 μM，提取好待检测的DNA模板1 μL(10 ng-100 ng)，纯水补足至25 μL，同时按上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品1 μL进行扩增。
将各反应管放入PCR仪的反应槽内，设定PCR仪反应程序，运行PCR反应。检测鲤科鱼类是否感染CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ或CyHV-Ⅲ。
设定PCR反应条件为：95℃ 3分钟，1个循环；95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 20秒，35个循环；72℃ 10分钟，1个循环；4℃ 保存。
扩增产物检测与分析：1.5%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并成像分析。
结果判定：
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为182 bp时，结果为CyHV-Ⅰ或CyHV-Ⅲ阳性；如果没有182 bp条带，则为CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅲ阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为302 bp时，结果为CyHV-Ⅱ病毒阳性；如果没有302 bp条带，则为CyHV-Ⅱ病毒阴性；
当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效；
当阳性对照无条带时，表明引物或者试剂盒中相关试剂降解，引物或试剂盒失效。
实施例2：同时检测鲤科疱疹病毒CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ的PCR检测引物、试剂盒及检测方法作进一步的效果检测。
一、敏感性实验
将上述人工合成的阳性质控品进行稀释，依次稀释为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL，分别作为PCR模板进行敏感性实验。结果见图1-3。
图1为PCR体系中CyHV-Ⅰ病毒检测的敏感性实验结果图，其中泳道M为TakaraDL2000 DNA Marker，泳道1-10分别为阳性质控品（从1到10依次为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL）），泳道11为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-10均有约182 bp清晰的扩增条带，CyHV-Ⅰ病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL。
图2为PCR体系中CyHV-Ⅱ病毒检测的敏感性实验结果图，其中泳道M为TakaraDL2000 DNA Marker，泳道1-10分别为阳性质控品（从1到10依次为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL），泳道11为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-10均有约302 bp清晰的PCR扩增条带，CyHV-Ⅱ病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL。
图3为PCR体系中CyHV-Ⅲ病毒检测的敏感性实验结果图，其中泳道M为TakaraDL2000 DNA Marker，泳道1-10分别为阳性质控品（从1到10依次为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL），泳道11为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-10均有约182 bp清晰的PCR扩增条带，CyHV-Ⅲ病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL。
图4为PCR体系中同时检测CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ的敏感性实验结果图，其中泳道M为Takara DL2000 DNA Marker，泳道1-10分别为阳性质控品（从1到10依次为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL），泳道11为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-10均有约182 bp、302 bp清晰的扩增条带，再次证明CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL。综上所述，可以得出采用本发明的引物及试剂盒，CyHV-Ⅰ病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL；CyHV-Ⅱ病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL；CyHV-Ⅲ病毒检测灵敏度达1×101拷贝/μL。由结果表明该PCR检测方法的灵敏度较高。
二、特异性实验
根据上述PCR检测方法，分别采用CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ、HPV、MBV、IHHNV的阳性质粒作模板以及阴性对照进行实验验证，其中HPV、MBV、IHHNV的阳性质粒均分别含有HPV、MBV、IHHNV的序列。以下序列可以人工合成得到。
HPV序列为：
CAATTAGAACGCATAGAAAACGCTAAGAAATACATAGAAGAAGTTATAGAAGAAACTAATCAAGAGTTAGAAAATCAAGAGAGACAAGAGGTAAGTGCGGCGGAGGCAGATACGATGAACACTGAAGCACCTGTCCCGATGGAAACTTCTGAATCAGGGACTACCGCCGCACCGCAGCAGCGAGCTGCAGCGGGCGGTGGCGGTAGTGGAGGTGGAGGCGAATCAGCAGGGTACGGGAGAAACTCTAGCGATTCATTCCAGCGCCACCGCAACAAACCTATCGATCT
SEQ ID NO:6；
MBV序列为：
ACCATAAGCTAGCATACGTCCTTTTGAATTTTTATACTGTTCTATGCATTTTGCAAGACCCTCTACCGATATGGTATCAATGTCTGGAGTTATATTATTTTTTATATAATTGAGTGTTTTTTGCTGACCTTTTGAAATTGCATTTTTATAGATAAATAAAGAATCATCGAGATCCTTCATTTATAATTGTCTTTATCTTTTTGTATAGCGTGTTAACGCTATAAAGATTTTCAAGATCTGCACTCCTT
SEQ ID NO:7；
IHHNV序列为：
TCACATTTACAGACACCCCATATTTAGAAATATTTAAGGATACTACTGGACTACATAATCAACTATCAACTAAGGAAGCCGACGTAACATTGGCAAAATGGATACAAAATCCCCAACTTGTGACCGTACAATCAACAGCAGCAAACTATGAAGACCCAATCCAACAATTTGGATTCATGGAACAAATGCGAACCGGTGACAGAAAAGCCTATACAATCCATGGTGACACTAGAAATTGGTATGGCGGAGAAATACCAACAACCGGACCCACCTTCATCCCAAAATGGGGTGGTCAATTAAAATGGGACAAACCATCCCTTGGAAACCTAGTCTACCCAGCAGACCACCATACAAACGACTGGCAACAGATCTTCATGAGAATGTCACCAATCAAAGGACCAAATGGAGACGAACTTAAACTTGGCTGC
SEQ ID NO:8。
实验结果表明，本发明试剂盒及检测方法特异性较好，未出现假阳性或假阴性，实验结果见图5。
图5为PCR体系中对CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ 病毒特异性检测实验结果图，其中泳道M为Takara DL2000 DNA Marker，泳道1为CyHV-Ⅰ阳性质控品，泳道2为CyHV-Ⅱ阳性质控品，泳道3为CyHV-Ⅲ阳性质控品，泳道4为HPV，泳道5为MBV，泳道6为IHHNV, 泳道7为PCR级纯水。引物均为CyHV引物（CyHV-F和CyHV-R），从图中可看出，CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅱ、CyHV-Ⅲ病毒检测结果为阳性，HPV、MBV、IHHNV、纯水等检测结果均为阴性，表明实验检测结果特异性较好。
综上所述，可以得出采用本发明的引物及试剂盒具有较好的特异性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家海洋局第三海洋研究所
<120> 一种同时检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的PCR引物、试剂盒及用途
<130> HYSS-16002-CNI
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cacctcttgt tttcsgccaa c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
aggtcmggcc tgggcagacc 20
<210> 3
<211> 182
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cacctgctct tctccgccaa caggtgggag ctggtgcccc tgatgaagca gaagctggaa 60
cgggggacga gcctggtgtt ggacaggtac gcattctccg gtgtggcatt cagcagcgcg 120
aaacctgaca tgcccgtgga gtggtgcatg ggaccagatg tgggtctacc caagcctgac 180
ct 182
<210> 4
<211> 302
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cacctcttgt tttcggccaa cagatgggaa ctggagcctc tgatccgttc aaagatagag 60
tccggtgtaa ctctggtggt ggacaggtac gccttctcgg gtatctgttt cacagctgcc 120
aaggtgtgtg gtggtggtag cagcagcaac tcgaaagtag ctcctctgga gtgtgtcaac 180
tcgaaagtag aacaagagtc tgctcgggct ctggagtgta tcaactcgaa agtagaagaa 240
gaagagtctg ctgttcttga gtggtgcaaa aactcggaca gaggtctgcc caggccggac 300
ct 302
<210> 5
<211> 182
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
cacctcctgt tctcggccaa ccgatgggaa gccgcctccg acctgaagcg caagctgatg 60
aagggtacca ccatcgtgct cgaccgctac gcgttctccg gcgtagcctt cacggcggcg 120
aagcccgggt tcgagctcga gtggtgtaag cgaaccgacg tgggtctgcc caagcccgac 180
ct 182
<210> 6
<211> 287
<212> DNA
<213> HPV病毒
<400> 6
caattagaac gcatagaaaa cgctaagaaa tacatagaag aagttataga agaaactaat 60
caagagttag aaaatcaaga gagacaagag gtaagtgcgg cggaggcaga tacgatgaac 120
actgaagcac ctgtcccgat ggaaacttct gaatcaggga ctaccgccgc accgcagcag 180
cgagctgcag cgggcggtgg cggtagtgga ggtggaggcg aatcagcagg gtacgggaga 240
aactctagcg attcattcca gcgccaccgc aacaaaccta tcgatct 287
<210> 7
<211> 248
<212> DNA
<213> MBV病毒
<400> 7
accataagct agcatacgtc cttttgaatt tttatactgt tctatgcatt ttgcaagacc 60
ctctaccgat atggtatcaa tgtctggagt tatattattt tttatataat tgagtgtttt 120
ttgctgacct tttgaaattg catttttata gataaataaa gaatcatcga gatccttcat 180
ttataattgt ctttatcttt ttgtatagcg tgttaacgct ataaagattt tcaagatctg 240
cactcctt 248
<210> 8
<211> 428
<212> DNA
<213> IHHNV病毒
<400> 8
tcacatttac agacacccca tatttagaaa tatttaagga tactactgga ctacataatc 60
aactatcaac taaggaagcc gacgtaacat tggcaaaatg gatacaaaat ccccaacttg 120
tgaccgtaca atcaacagca gcaaactatg aagacccaat ccaacaattt ggattcatgg 180
aacaaatgcg aaccggtgac agaaaagcct atacaatcca tggtgacact agaaattggt 240
atggcggaga aataccaaca accggaccca ccttcatccc aaaatggggt ggtcaattaa 300
aatgggacaa accatccctt ggaaacctag tctacccagc agaccaccat acaaacgact 360
ggcaacagat cttcatgaga atgtcaccaa tcaaaggacc aaatggagac gaacttaaac 420
ttggctgc 428

Claims (7)

1.一种用于同时快速检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的PCR引物，其特征在于，所述引物为CyHV-F和CyHV-R，序列如SEQ ID NO:1和2所示。
2.一种用于同时快速检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的PCR检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物。
3.一种用权利要求1的PCR引物或权利要求2的PCR检测试剂盒检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的非疾病诊断用途。
4.一种用权利要求1的PCR引物或权利要求2的PCR检测试剂盒检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的非疾病诊断方法。
5.权利要求4所述检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的非疾病诊断方法，其特征在于，步骤为：
提取DNA，
PCR扩增检测，采用权利要求1的PCR引物或权利要求2的PCR检测试剂盒进行PCR扩增；阳性对照为SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核酸序列混合作为模板，阴性对照为：不含有鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型任一病毒的任意DNA核酸序列；
结果判定：
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为182bp时，结果为CyHV-Ⅰ或CyHV-Ⅲ阳性；如果没有182bp条带，则为CyHV-Ⅰ、CyHV-Ⅲ阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为302bp时，结果为CyHV-Ⅱ病毒阳性；如果没有302bp条带，则为CyHV-Ⅱ病毒阴性；
当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效；
当阳性对照无条带时，表明引物或者试剂盒中相关试剂降解，引物或试剂盒失效。
6.权利要求5所述检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的非疾病诊断方法，其特征在于，所述PCR检测的PCR反应体系为：10倍浓度的含镁离子的Taq DNA聚合酶缓冲液2.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，各引物终浓度为0.4μM，提取好待检测的DNA模板10ng-100ng，纯水补齐至25μL。
7.权利要求5所述检测鲤科疱疹病毒Ι型、Ⅱ型和Ⅲ型的非疾病诊断方法，其特征在于，所述PCR检测的PCR反应条件为：95℃3分钟，1个循环；95℃30秒，58℃30秒，72℃20秒，35个循环；72℃10分钟，1个循环；4℃保存。
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