CN103773895B - 一种同时检测水生动物五种dna病毒的多重荧光pcr试剂盒 - Google Patents

一种同时检测水生动物五种dna病毒的多重荧光pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同时检测水生动物五种 DNA 病毒的多重荧光 PCR 试剂盒，包括缓冲液，还包括 5 对荧光 PCR 引物和 5 条分子信标探针和 PCR 引物，所述 5 对荧光 PCR 引物和 5 条分子信标探针分别对应斑点叉尾 鮰 病毒、流行性造血器官坏死病病毒、金鱼造血器官坏死病病毒、锦鲤疱疹病毒和真鲷虹彩病毒；所述荧光 PCR 引物和分子信标探针包括 SEQ ID NO.3-17 的核苷酸序列；所述 PCR 引物包括 SEQ ID NO.1-2 的核苷酸序列。本发明制备的同时检测水生动物五种 DNA 病毒的多重荧光 PCR 试剂盒，可以实现对所有感染水生动物的 DNA 病毒一次性快速检测，灵敏性增强，减少了单个样品的检测费用。

Description

一种同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域的荧光PCR试剂盒，具体涉及一种同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒。
背景技术
我国是一个养殖业大国，也是一个水生动物及其产品进出口大国和消费大国，同时也是一个疫情疫病高发、频发的国家。随着可捕捞资源的急剧减少，水产养殖已成为我国为满足人民群众日益增长的蛋白质需求而不得不采用的重要举措。但病害损失严重制约着水产养殖业的健康可持续发展，养殖模式、生态环境变化以及病原体在多宿主间传播均影响水生动物疫病的流行，由病毒引起的疾病对现代水产品养殖造成了极大的危害，由于国内养殖方式高密度化，水生动物传染性疾病就像悬在养殖户头上的利剑，时时刻刻威胁着我国的渔业发展。同时，随着国际交往和国际贸易日趋频繁，水生动物及其产品的进出口贸易日渐增多，水生动物疫病传染的风险也随之加剧。近年来我国参与国际贸易活动与日剧增，每天有大量的水产品通关，满足了国内市场对海产品的需求，同样，国内养殖场的水产品也保障了供香港、澳门和通往国际市场的贸易供给。因此，国家的各个口岸是重要水生动物疫病传入和传出的高风险地区，水生动物疾病的检验检疫工作在防控流行病的传播中发挥着重要作用。水生动物疫病的病原检测要求检测方法具有灵敏、特异和经济的特点，但是，目前采用的分子生物学检测方法具有相对灵敏和特异的要求，面对各种病原的检测，所用方法只是针对一个标本，通过一个实验仅能对一个靶基因进行分析，不能将检测方法整合。如果采用多重PCR可以增加检测效率和降低检测经济成本，更重要的是提高检测方法的敏感性。
目前，世界各国严重关注的感染鱼类的病毒性传染病主要有13种，其中双链DNA病毒疫病有5种，快速和同步检出所有病毒是当前养殖鱼类和口岸水产品检测的迫切需求，由于病毒结构的差异，这是极具挑战的课题，DNA病毒与RNA病毒结构差异较大，同时检测这两大类病毒的难度也较大。经研究水生动物DNA病毒在DNA聚合酶基因的结构上有一定共性，可以尝试作为突破口，运用一种试剂盒同步检测所有DNA病毒。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒，以实现对所有感染水生动物的DNA病毒一次性快速检测，灵敏性增强，减少了单个样品的检测费用。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒，包括缓冲液，还包括5对荧光PCR引物和5条分子信标探针和PCR引物，所述5对荧光PCR引物和5条分子信标探针分别对应斑点叉尾鮰病毒、流行性造血器官坏死病病毒、金鱼造血器官坏死病病毒、锦鲤疱疹病毒和真鲷虹彩病毒；所述荧光PCR引物和分子信标探针包括SEQ ID NO.3-17的核苷酸序列；所述PCR引物包括SEQ IDNO.1-2的核苷酸序列。
优选的，所述分子信标探针SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17的核苷酸序列5'端和3'端分别与荧光基团和荧光淬灭基团相连。
优选的，所述5种分子信标探针分别为：
CCV-T：FAM-ACCCCGAAAATCCCAA-BHQ
EHNV-T：VIC-AGCCGCCCTCAAGAAC-BHQ
GFHNV-T：NED–CCGCCAGTAACATGGA-BHQ
KHV-T：TET-GGCGTCTAGCCTCAACC-BHQ
RSIV-T：CY5-ACGCAGAGGGGCTACC-BHQ。
本发明根据水生动物疫病的病原DNA病毒的特点,发现所有水生动物DNA病毒的DNA聚合酶基因尽管差异较大，但是仍然具有的同源区片段，在这些同源区域设计引物可以通过PCR将所有这些病毒的DNA聚合酶基因得到扩增，然后可以采用多重荧光定量PCR方法将各种病毒基因扩增产物甄别，能够检测携带上述病原的水生动物疫病。与传统PCR和普通荧光PCR相比检测范围得到扩展，灵敏性增强，减少了单个样品的检测费用，通过单只反应管可以对样品是否含有上述五种病原情况做出判断。
附图说明
图1为试剂盒制备及使用流程示意图。
图2为多重荧光PCR检测结果，其中1为GFHNV，2为RSIV，3为KHV，4为EHNV，5为CCV。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1：PCR引物的设计和制备
对斑点叉尾鮰病毒DNA聚合酶靶基因序列（NCBI序列检索号GenBank No.：NC_001493.1）、流行性造血器官坏死病病毒DNA聚合酶靶基因序列（NCBI序列检索号GenBank No.：FJ433873.1）、金鱼造血器官坏死病病毒DNA聚合酶靶基因序列（NCBI序列检索号GenBank No.：JQ815364.1）、锦鲤疱疹病毒DNA聚合酶靶基因序列（NCBI序列检索号GenBank No.：AY939862.1）和真鲷虹彩病毒DNA聚合酶靶基因序列（NCBI序列检索号GenBank No.：AB007366.1）基因进行比较分析，设计出针对上述五种DNA病毒DNA聚合酶同源区的PCR兼并引物，包括SEQ ID NO.1-2所述的核苷酸序列：
Han-forward primer:5'-GAYTTYGCNWSNYTNTAYCC-3'（SEQID NO.1）
Han-reverse primer:5'-TCNGTRTCNCCRTA-3'（SEQ ID NO.2）。
使用该引物做PCR可以将样品中痕量DNA片断进行扩增，使样品信号的到初级放大，经过测试，该引物可以对鱼类所有DNA病毒的聚合酶基因初步扩增。
实施例2：特异性引物及分子信标探针的合成
（一）特异性引物的设计
分别根据斑点叉尾鮰病毒、流行性造血器官坏死病病毒、金鱼造血器官坏死病病毒、锦鲤疱疹病毒和真鲷虹彩病毒DNA聚合酶靶基因序列合成5对特异性引物。
（二）分子信标探针靶序列的选择
对斑点叉尾鮰病毒、流行性造血器官坏死病病毒、金鱼造血器官坏死病病毒、锦鲤疱疹病毒和真鲷虹彩病毒DNA聚合酶靶基因序列的同源性进行比较，确定每种病毒杂交探针的选择范围，运用Primer5.0软件寻找所有可能的探针序列，筛选符合条件的探针序列，并运用BLAST软件分析探针的特异性，获得5条分子信标探针靶序列。
特异性引物和分子信标探针靶序列如下表1：
表1、特异性引物和分子信标探针靶序列对照表
（三）分子信标探针的合成及其结构
分子信标探针靶序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17的5’端和3’端分别与荧光基团和荧光淬灭基团相连，获得如下表2分子信标探针：
表2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.17修饰后的分子信标探针
检测对象 名称 分子信标探针序列（5'-3'）
斑点叉尾鮰病毒 CCV-T FAM-ACCCCGAAAATCCCAA-BHQ
流行性造血器官坏死病病毒 EHNV-T VIC-AGCCGCCCTCAAGAAC-BHQ
金鱼造血器官坏死病病毒 GFHNV NED–CCGCCAGTAACATGGA-BHQ
锦鲤疱疹病毒 KHV-T TET-GGCGTCTAGCCTCAACC-BHQ
真鲷虹彩病毒 RSIV-T CY5-ACGCAGAGGGGCTACC-BHQ
分子信标靶序列5'端和3'端分别与荧光基团和荧光淬灭基团相连的茎状结构(stem)，形成探针的两臂，两臂中间是与靶序列相连接的互补序列，形成环状结构(loop)，这种茎环结构的探针，由于茎序列的互补性，使得两个基团相距足够近，在光源的激发下，通过淬灭剂的淬灭作用，荧光剂所放射的荧光以热能的形式散发出去。当加入与探针完全互补的核酸靶分子后，探针的环状结构与靶分子完全互补，形成杂交体。杂交体的双链序列比探针分子茎状结构的双链更长更稳定，探针的构象改变，茎状结构双链被打开，荧光基团和淬灭剂分离。当给予激发光后，荧光基团就会产生荧光。这种方法可以解决非特异的问题，同时灵敏度高，反应快。
实施例3：水生动物DNA病毒检测
（一）样品制备
对待检疑似病鱼取样，取鱼体的肝脏、脾脏和肾脏等器官的组织样少许，用商业化的试剂盒抽提DNA，以提取的样品DNA为模板，做Touchdown PCR，获得纯化DNA样品。
Touchdown PCR反应体系如下表3：
表3、50μL反应体系的PCR反应的反应体系组成
按以下条件进行扩增：
95℃，4min；
94℃，1min，63℃，1min，72℃，1min，2个循环；
94℃，1min，62℃，1min，72℃，1min，2个循环；
94℃，1min，61℃，1min，72℃，1min，2个循环；
94℃，1min，60℃，1min，72℃，1min，2个循环；
94℃，1min，59℃，1min，72℃，1min，2个循环；
94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，2个循环；
94℃，1min，57℃，1min，72℃，1min，2个循环；
94℃，1min，56℃，1min，72℃，1min，2个循环；
94℃，1min，55℃，1min，72℃，1min，2个循环；
94℃，1min，54℃，1min，72℃，1min，2个循环；
94℃，1min，53℃，1min，72℃，1min，2个循环；
94℃，1min，53℃，1min，72℃，1min，12个循环；
72℃，7min。
（二）多重荧光PCR
反应体系如下表4：
表4、25μL反应体系的荧光PCR反应所需试剂组成
反应条件：
95℃反应10min；
95℃反应15s，
60℃反应1min，40个循环。
用基因扩增仪Gene Amp7500分析PCR反应结果。
（三）结果判断：
阳性：样品检测结果中Ct≦32,荧光PCR仪的峰图有明显指数增长期。
可疑：样品检测结果中32<Ct≦35荧光PCR仪的峰图有明显指数增长期，取样本重新进行DNA提取和检测，如果检测结果中Ct≦35，则判断为阳性，如果重测结果中Ct>35或者没有Ct值则判定为阴性。
阴性：样品检测结果中>35或者无Ct值。
经多次验证，对该试剂盒与单次荧光PCR比对实验，阳性和阴性结果完全一致，检出率与单次荧光PCR效果一致，通过实验验证该试剂盒完全能够代替单次PCR检测操作。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种同时检测水生动物五种DNA病毒的多重荧光PCR试剂盒，包括缓冲液，其特征在于，还包括5对荧光PCR引物和5条分子信标探针和PCR引物，所述5对荧光PCR引物和5条分子信标探针分别对应斑点叉尾鮰病毒、流行性造血器官坏死病病毒、金鱼造血器官坏死病病毒、锦鲤疱疹病毒和真鲷虹彩病毒；
所述荧光PCR引物和分子信标探针分别为SEQ ID NO.3-17的核苷酸序列；
所述PCR引物分别为SEQ ID NO.1-2的核苷酸序列；
所述5种分子信标探针分别为：
CCV-T ：FAM-ACCCCGAAAATCCCAA-BHQ
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