CN110628952A - 斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测引物、试剂盒、方法及其应用 - Google Patents

斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测引物、试剂盒、方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测引物、试剂盒、方法及其应用，属于生物技术领域。本发明包括PCR引物和探针设计、DNA模板制备、PCR扩增及通过荧光信号进行结果判断。本发明针对鮰疱疹病毒相应基因保守序列设计特异性的引物和taqMan探针，经过充分优化，独创引物探针、反应条件，从而建立一种快速可靠的荧光定量PCR检测斑点叉尾鮰疱疹病毒的方法。本发明实现了对DNA模板的定量，具有操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高和结果可靠等优点，能在斑点叉尾鮰疱疹病毒病早期快速诊断和实时监测方面发挥重要作用。

Description

斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测引物、试剂盒、方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及淡水养殖动物病原的分子检测方法，具体涉及一种利用taqMan荧光定量方法建立的用于斑点叉尾鮰疱疹病毒病(CCVD)病原的快速检测引物、试剂盒、方法及其应用。
背景技术
斑点叉尾鮰病毒(Channel Catfish Virus，CCV)是一种有囊膜的双链DNA病毒，又称鮰疱疹病毒I型(Ictalurid herpesvirus 1)，能够对斑点叉尾鮰鱼苗和鱼种造成致死性感染。随着斑点叉尾鮰养殖规模的不断扩大，集约化程度日益提高，养殖环境恶化，斑点叉尾鮰病害日趋严重，特别是由斑点叉尾鮰病毒(CCV)引起的斑点叉尾鮰疱疹病毒病(Channel Catfish Virus Disease，CCVD)危害最大，给斑点叉尾鮰养殖业造成严重的经济损失。目前，CCVD的传统检测方法主要是采用细胞培养技术进行CCVD的诊断，然后结合血清中和试验、荧光抗体技术、ELISA或PCR鉴定，以上方法虽然准确可靠，但因具有操作繁琐、细胞难于培养、检测周期长等缺点，不能满足快速确诊病原、及时控制疫情的实际工作需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测引物、试剂盒、方法及其应用，本发明的检测方法操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高、结果可靠。
为解决上述技术问题，本发明提供一种斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测引物，包括一对靶基因引物和探针引物，其中，靶基因引物包括上游CCV-F序列和下游CCV-R序列，所述上游CCV-F序列如SEQ ID NO:1所示，下游CCV-R序列如SEQ ID NO:2所示；所述探针引物CCV-Probe序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测试剂盒，包括上述的引物。
进一步地，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为斑点叉尾鮰CCVD病原披膜蛋白基因ORF73片段的质粒DNA；阴性对照为超纯水。
本发明还提供斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测方法，包括：
从待检斑点叉尾鮰组织中提取鮰疱疹病毒DNA；
以提取的鮰疱疹病毒DNA为模板，使用权利要1所述的引物组和权利要求2所述的探针，配制荧光定量PCR反应扩增体系，进行荧光定量PCR扩增反应；
通过实时荧光定量仪实时读取的荧光信号判断扩增结果，出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
进一步地，所述荧光定量PCR反应扩增体系为：CCV-F终浓度为0.35μM，CCV-R终浓度为0.35μM，CCV-Probe终浓度为0.1μM，预混Mix 12.5μl，待检DNA 1～100ng，用超纯水补齐至25μl；设置阳性对照和阴性对照。
进一步地，所述阳性对照为含有斑点叉尾鮰CCVD病原披膜蛋白基因ORF73片段的质粒DNA，所述阴性对照为超纯水。
进一步地，所述阳性对照的制备方法为：提取鮰疱疹病毒DNA，利用权利要求1所述的引物对进行扩增，所得基因序列如SEQ ID NO:4所示，将该扩增片段连接到T载体中，获得的质粒即为阳性对照。
进一步地，所述荧光定量PCR反应扩增条件为：预变性94℃，10min；变性94℃30s，退火55℃30s，40个循环。
进一步地，所述鮰疱疹病毒DNA的提取方法为：从待检斑点叉尾鮰组织中切取组织材料置于灭菌后的研钵中，加入液氮研磨后转入离心管中，加入200μl DNA提取缓冲液，5μl蛋白酶K混匀，置于50～60℃水浴锅中加热2h，冷却至室温，用等体积的酚抽提一次，2500rpm/min离心收集水相，用等体积的酚-氯仿-异丙醇混合物抽提一次，2500rpm/min离心收集水相；加入等体积的异丙醇沉淀，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠与2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇-20℃，20分钟，12000rpm/min室温离心5分钟，沉淀溶于灭菌纯净水中，置于-20℃备用。
本发明还提供上述的引物、试剂盒或方法在斑点叉尾鮰疱疹病毒病病原检测中的应用。
本发明所达到的有益效果：
本发明以斑点叉尾鮰CCVD病原的保守基因序列(披膜蛋白ORF73)设计特异性引物和taqMan探针，使用实时荧光定量仪，通过吸收荧光来实时判断反应的进行，从而建立一种对CCVD病原的快速检测方法。该检测方法能特异、快速检测ORF73基因的存在，从而准确确定检测样品中是否存在CCVD病原。同时该方法能够对DNA模板进行精确定量，且比常规PCR检测方法灵敏度更高。
本发明的检测方法操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高、结果可靠，能在斑点叉尾鮰疱疹病毒病早期快速诊断和实时监测方面发挥重要作用。具体表现在：
(1)特异性好：对锦鲤疱疹病毒、蛙虹彩病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒DNA不发生扩增。
(2)灵敏度高：最低检测极限可达到1.6×101copies/μl，比常规PCR灵敏度高出10倍。
(3)结果可靠：检测靶位点是ORF73基因的保守序列，且只有特异性的探针与其互补的靶序列杂交并有特异性扩增后，才能产生荧光信号，因此检测结果能准确判断待检样品是否是斑点叉尾鮰CCVD病原。
附图说明
图1为实施例2中荧光定量检测CCVD病原的特异性结果图。
图2为实施例3中荧光定量PCR灵敏性扩增曲线,其中，从左到右依次为1.6×107copies/μl～1.6×100copies/μl及阴性对照。
图3为实施例3中常规PCR灵敏度检测，其中，1-8：1.6×107copies/μl～1.6×100copies/μl，9：阴性对照。
图4为实施例4中荧光定量检测CCVD病原的绝对定量标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1：使用实时荧光定量仪建立斑点叉尾鮰CCVD病原检测方法：
用于斑点叉尾鮰疱疹病毒病病原的快速检测方法包括PCR引物组设计、DNA模板制备、PCR扩增及通过荧光信号进行结果判断。
(1)PCR引物和探针设计：根据NCBI中公布的鮰疱疹病毒I型基因序列，利用Primer5.0软件对CCV病毒的ORF73基因保守序列为靶点设计引物和探针，所设计的引物和探针序列见表1。
表1.PCR引物和探针序列
(2)阳性对照为含有斑点叉尾鮰CCVD病原披膜蛋白基因ORF73片段的质粒DNA，其制备方法为：提取鮰疱疹病毒DNA，利用表1中的外引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)对进行扩增，所得基因片段长度为144bp，序列如SEQ ID NO:4所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，获得的质粒即为阳性对照。
(3)阴性对照为超纯水。
(4)鮰疱疹病毒DNA的制备：从待检斑点叉尾鮰组织中切取组织材料置于灭菌后的研钵中，加入液氮研磨后转入离心管中，加入200μl DNA提取缓冲液(10mmol/L Tris-cl，0.1mol/L EDTA,05％SDS)，5μl蛋白酶K(100μg/ml)混匀，置于50～60℃水浴锅中加热2h，冷却置室温，用等体积的酚抽提一次，2500rpm/min离心收集水相，用等体积(酚-氯仿-异丙醇)混合物抽提一次，2500rpm/min离心收集水相。加入等体积的异丙醇沉淀，加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(Ph 5.2)与2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇-20℃，20分钟，12000rpm/min室温离心5分钟，沉淀溶于灭菌纯净水中，置于-20℃备用。
(5)荧光定量PCR扩增反应：在25μl PCR反应扩增体系中CCV-F终浓度为0.35μM，CCV-R终浓度为0.35μM，CCV-Probe终浓度为0.1μM，预混Mix 12.5μl，待检DNA 1～100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照，将配制好的pcr管混匀后离心，并在实时荧光定量仪上：预变性94℃，10min；变性94℃30s，退火55℃30s(40个循环)。
(6)结果判断：通过实时荧光定量仪实时读取的荧光信号来判断扩增结果，出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
实施例2：检测特异性实验：
用实施例1的方法分别对鮰疱疹病毒阳性DNA及锦鲤疱疹病毒、蛙虹彩病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的DNA进行检测。
鉴定结果如图1所示：以斑点叉尾鮰CCVD病原快速检测方法进行扩增反应，鮰疱疹病毒阳性DNA正常扩增，阴性水对照及锦鲤疱疹病毒、蛙虹彩病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒没有扩增，显示出良好的特异性。
实施例3：检测灵敏度实验：
将含有CCVD病原披膜蛋白基因ORF73片段的质粒进行定量，测定其浓度并根据分子量计算质粒拷贝数，稀释到1.6×107copies/μl、1.6×106copies/μl、1.6×105copies/μl、1.6×104copies/μl、1.6×103copies/μl、1.6×102copies/ul,1.6×101copies/μl,1.6×100copies/μl。用实施例1的操作方法分别对稀释后的阳性克隆进行检测。鉴定结果如图2所示：对阳性质粒的检测限达到1.6×101copies/μl；
将含有CCVD病原披膜蛋白基因ORF73片段的质粒进行定量，测定其浓度并根据分子量计算质粒拷贝数，稀释到1.6×107copies/μl、1.6×106copies/μl、1.6×105copies/μl、1.6×104copies/μl、1.6×103copies/μl、1.6×102copies/ul,1.6×101copies/μl,1.6×100copies/μl。利用表1中的外引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)对稀释后的阳性克隆进行检测进行常规PCR扩增，设置超纯水为阴性对照。鉴定结果如图3所示,对阳性质粒的检测限为1.6×102copies/μl。
实施例4：绝对定量标准曲线实验：
将含有CCVD病原披膜蛋白基因ORF73片段的质粒进行定量，测定其浓度并根据分子量计算质粒拷贝数，稀释到1×107copies/μl、1×106copies/μl、1×105copies/μl、1×104copies/μl、1×103copies/μl、1×102copies/ul,1×101copies/μl。用实施例1的操作方法分别对稀释后的阳性克隆进行检测，设置超纯水为阴性对照。以阳性质粒拷贝数的对数为X轴，CT值为Y轴，绘制绝对定量标准曲线，结果如图4所示,在107-101copies质粒区间内，显示了良好的线性关系，所得拷贝数(x轴)与CT值(y轴)的线性方程为：y＝-3.008x+37.449，R2＝0.9991。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 河海大学
<120> 斑点叉尾鮰疱疹病毒的快速检测引物、试剂盒、方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcttgggct tgatggac 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggaggaca acgcgactg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atccgaatcc gacaactga 19
<210> 4
<211> 144
<212> DNA
<213> 鮰鱼疱疹病毒(Ictalurid herpesvirus)
<400> 4
ggcttgggct tgatggaccg gtcgtgtcgg tgtcggtggc tgtgtcggct tccgtttcac 60
cgtgtgtggt gccgtgagtt gatccggggg tttgaaaacg ggaatcggca ccgaatgcgt 120
cttcgcagtc gcgttgtcct cctc 144

Claims (10)

1. 斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测引物，其特征是，包括一对靶基因引物和探针引物，其中，靶基因引物包括上游CCV-F序列和下游CCV-R序列，所述上游CCV-F序列如SEQ ID NO:1所示，下游CCV-R序列如SEQ ID NO:2所示；所述探针引物CCV-Probe序列如SEQ ID NO:3所示。
2.斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测试剂盒，其特征是，包括权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测试剂盒，其特征是，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为斑点叉尾鮰CCVD病原披膜蛋白基因ORF73片段的质粒DNA；阴性对照为超纯水。
4.斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测方法，其特征是，包括：
从待检斑点叉尾鮰组织中提取鮰疱疹病毒DNA；
以提取的鮰疱疹病毒DNA为模板，使用权利要1所述的引物组和权利要求2所述的探针，配制荧光定量PCR反应扩增体系，进行荧光定量PCR扩增反应；
通过实时荧光定量仪实时读取的荧光信号判断扩增结果，出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
5.根据权利要求4所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测方法，其特征是，所述荧光定量PCR反应扩增体系为：CCV-F终浓度为0.35μM，CCV-R终浓度为0.35μM，CCV-Probe终浓度为0.1μM，预混Mix 12.5μl，待检DNA 1~100ng，用超纯水补齐至25μl；设置阳性对照和阴性对照。
6.根据权利要求5所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测方法，其特征是，所述阳性对照为含有斑点叉尾鮰CCVD病原披膜蛋白基因ORF73片段的质粒DNA，所述阴性对照为超纯水。
7.根据权利要求6所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测方法，其特征是，所述阳性对照的制备方法为：提取鮰疱疹病毒DNA，利用权利要求1所述的引物对进行扩增，所得基因序列如SEQ ID NO:4所示，将该扩增片段连接到T载体中，获得的质粒即为阳性对照。
8.根据权利要求4所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测方法，其特征是，所述荧光定量PCR反应扩增条件为：预变性94℃，10min；变性94℃ 30s，退火55℃ 30s，40个循环。
9.根据权利要求4所述的斑点叉尾鮰疱疹病毒快速检测方法，其特征是，所述鮰疱疹病毒DNA的提取方法为：从待检斑点叉尾鮰组织中切取组织材料置于灭菌后的研钵中，加入液氮研磨后转入离心管中，加入200μl DNA提取缓冲液，5μl蛋白酶K混匀，置于50~60℃水浴锅中加热2h，冷却至室温，用等体积的酚抽提一次，2500rpm/min离心收集水相，用等体积的酚-氯仿-异丙醇混合物抽提一次，2500rpm/min离心收集水相；加入等体积的异丙醇沉淀，加入0.1倍体积3mol/L 乙酸钠与2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇-20℃，20分钟，12000rpm/min 室温离心5分钟，沉淀溶于灭菌纯净水中，置于-20℃备用。
10.根据权利要求1所述的引物、权利要求2或3所述的试剂盒或权利要求4～9中任意一项所述的方法在斑点叉尾鮰疱疹病毒病病原检测中的应用。
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