CN111647692A - 同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒检测技术领域，具体公开一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法。本发明提供的PCR检测引物，可实现对猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒四种病毒的同时检测，与猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪博卡病毒、猪圆环病毒2型、猪德尔塔冠状病毒和猪伪狂犬病毒等其他猪源病毒无交叉扩增反应，特异性较强；且上述引物的灵敏度高，对PEDV、PRRSV、TGEV、PoRV最低检测浓度分别为9.12×10‑5pg/μL、2.48×10‑3pg/μL、7.55×10‑5pg/μL、8.23×10‑5pg/μL，检测准确率为100％。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法。
背景技术
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种高度接触性消化道传染病，以呕吐、水样腹泻和脱水为特征，OIE将其列为B类动物疫病。各年龄段的猪都易感，尤其是10日龄以内的仔猪发病率和病死率最高，多呈地方性流行，新发区可爆发性流行。
猪繁殖与呼吸综合征是由猪蓝耳病毒，又称猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)引起的一种急性传染病，临床主要特征为流产、产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难等，在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。
猪流行性腹泻，英文缩写为PED(Porcine Epidemic Diarrhea)，是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种接触性肠道传染病，主要症状为呕吐、腹泻、脱水，临床变化和症状与猪传染性胃肠炎极为相似。在我多发生在每年的12月份至翌年1-2月份，夏季也有发病的报道，可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，病死率越高。
轮状病毒病(RV)是由猪轮状病毒引起的猪急性肠道传染病，至今，在许多养猪国家均发现存在猪轮状病毒病。1974年由FLEWE等首次提出RV这个名称，并被国际病毒命名委员会采用。本病分布很广，几乎五大洲都有报道，能侵害人类和禽畜，并且感染率高、发病率高，对人类的健康和禽畜业的发展都有较大的危害，因此，逐渐引起了人们的广泛关注。
上述四种猪急性肠道疾病临床症状相似，又易于混合感染，临床鉴别诊断非常困难。采用单一的PCR检测方法耗时长，因此，最近国内外开始研究多重PCR检测方法，但是现有的多重PCR检测方法假阳性率高、敏感性较低、精确度较差。因此，目前市面上急需一种可以准确、有效、更灵敏地针对猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒进行检测的产品。
发明内容
针对现有检测猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳病毒、流行性腹泻病毒和轮状病毒的方法存在的耗时长、特异性差、准确度低的问题，本发明提供一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法，其核苷酸序列为：
PEDV P-F:5′-AAG GAG GTA ACC GCA CAG AAT-3′；
PEDV P-R:5′-AAA ATA CAT ACG AAA GTA GAG CCT G-3′；
PRRSV P-F:5′-AGGAGGTCCACAATAGCACAGA-3′；
PRRSV P-R:5′-CAACTACCACCACAACACGAG-3′；
TGEV P-F:5′-CTG TCC ATC TAA CTC AGA GGC AAA C-3′；
TGEV P-R:5′-AAC CAC CTG AAC ACC ACC AAG-3′；
PoRV P-F:5′-GAT GCG AAA TCT GCT CAA ACA-3′；
PoRV P-R:5′-TCC AAC CCA AAG TCC TTA CAA-3′。
相对于现有技术，本发明提供的PCR检测引物，可实现对猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒四种病毒的同时检测，与猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪圆环病毒2型、猪博卡病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪伪狂犬病毒等其他猪源病毒无交叉扩增反应，特异性较强；且上述引物的灵敏度高，对PEDV、PRRSV、TGEV、PoRV的最低检测浓度分别为9.12×10-5pg/μL、2.48×10-3pg/μL、7.55×10-5pg/μL、8.23×10-5pg/μL，检测准确率为100％。能够对PEDV、PRRSV、TGEV、PoRV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别，具有广阔的应用前景。
本发明还提供了一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的试剂盒，包含上述引物。
优选的，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、缓冲液和去离子水。
更优选的，所述试剂盒包括上述引物，2×PCR扩增MIX和去离子水。
本发明还提供上述试剂盒的使用方法，具体操作为：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
上述试剂盒的使用方法，耗时短、反应结果直观，可用于猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳病毒、流行性腹泻病毒和轮状病毒的同时快速检测。
优选的，所述PCR扩增的体系包括以下试剂及用量：灭菌水3.3μL，2×PCR扩增MIX12.5μL，10μmol/L的PEDV P-F和10μmol/L的PEDV P-R引物各0.2μL，10μmol/L的PRRSV P-F和10μmol/L的PRRSV P-R引物各1.0μL，10μmol/L的TGEV P-F和10μmol/L的TGEV P-R引物各0.4μL，10μmol/L的PoRV P-F和10μmol/L的PoRV P-R引物各1.0μL和模板4.0μL。
上述优选的反应条件可进一步提高猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳病毒、流行性腹泻病毒和轮状病毒四种病毒的检测效率。
优选的，所述待测病毒的基因组的提取采用基因组提取试剂盒提取。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
引物设计：
根据Genbank中登录的PEDV的MK841495基因、PRRSV的AY150312基因、TGEV的AF209745基因、PORV的MF278302基因序列，分别设计引物，设计的引物序列如表1所示，由上海生工生物工程有限公司合成。
表1筛选的用于PCR反应的引物
实施例2
多重PCR检测方法：
(1)基因组的提取：按照双螺旋公司动物基因组DNA/RNA提取试剂盒操作说明书提取病毒基因组，-20℃保存备用；
(2)反转录(cDNA的合成)
配制反转录反应体系，每管加入RNA模板16μL和4μL5×RNA反转录反应混合液(含Buffer、dNTP、M-MLV、RNA酶抑制剂、通用反转录引物等)，37℃水浴15min，反应结束后，经85℃灭活反转录酶，得到cDNA，备用；
(3)高通量PCR扩增
在PCR反应管中分别加入灭菌水3.3μL，2×PCR扩增MIX 12.5μL，猪传染性胃肠炎病毒上、下游引物(10μmol/L)各0.2μL，猪蓝耳病毒上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL，猪流行性腹泻病毒上、下游引物(10μmol/L)各0.4μL，猪轮状病毒上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL，cDNA4.0μL，共25μl RT-PCR扩增体系。
PCR反应程序：95℃预变性2min；94℃变形50s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环；72℃延伸10min，扩增产物4℃保存。
反应产物纯化后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，结果表明猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒引物扩增的PCR产物分别在199bp、526bp、210bp和380bp左右各出现了一条片段，四重引物扩增的PCR产物出现了4条条带，与预期大小相符，若去掉反应体系中的任何一对引物，均只能扩增其中的3条相应的条带。
实施例3
3.1特异性试验
按照实施例2的方法，检测猪传染性胃肠炎病毒基因(TGEV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒基因(PEDV)、猪轮状病毒基因(PoRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪博卡病毒(PBoV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪伪狂犬病毒(PRV)10种病毒，并以灭菌水为阴性对照，以验证本发明引物的特异性。
用DNA/RNA提取试剂盒提取TGEV、PRRSV、PEDV、PoRV、CSFV、JEV、PDCoV的基因组RNA，并将提取得到的上述基因组RNA进行反转录，得到cDNA，用DNA/RNA提取试剂盒提取PCV2、pBoV和PRV的基因组DNA，并用反转录得到的cDNA和提取的DNA作为模板，进行PCR扩增检测，按照实施例2中的方法检测。
反应条件：95℃预变性2min；然后94℃变形50s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min，扩增产物4℃保存。
反应体系：灭菌水3.3μL，2×PCR扩增MIX 12.5μL，猪传染性胃肠炎病毒上、下游引物(10μmol/L)各0.2μL，猪蓝耳病毒上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL，猪流行性腹泻病毒上、下游引物(10μmol/L)各0.4μL，猪轮状病毒上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL，模板4.0μL，共25μlPCR扩增体系。
结果表明：采用本发明方法检测，PEDV、PRRSV、TGEV、PoRV检测结果呈阳性，并能扩增出相应大小的条带，对PCV2、CSFV、JEV、PBoV、PDCoV和PRV进行检测，检测结果均未出现条带，表明该检测方法不与其他猪源病毒发生交叉反应，表明该方法具有良好的特异性。
3.2敏感性测试
抽提PEDV、PRRSV、TGEV、PoRV四种病毒的RNA进行反转录，并以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增后产物用NanoDrop核酸蛋白检测仪测得模板浓度，5倍梯度稀释，测定本发明PCR方法的敏感性。反应条件和反应体系同上。
实验结果说明，采用本发明试剂盒检测，PEDV、PRRSV、TGEV、PoRV的最低检测浓度分别为9.12×10-5pg/μL、2.48×10-3pg/μL、5.37×10-5pg/μL、7.23×10-5pg/μL，灵敏度高。
3.3准确度测试
将提取的73份猪腹泻待检测临床样品RNA进行反转录，并以反转录得到的cDNA为模板，利用本发明建立的四重PCR和单一PCR对待测样品进行检测，结果如表2所示。结果表明，两种方法检测的一致率达到100％。
表2
实验结果说明，本发明试剂盒可用于临床检测，具有较高的准确度。
综上所述，本发明提供的引物和试剂盒可以同时检测猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒，且特异性强、灵敏度高、准确度好，且与单一PCR相比，耗时更短，检测快速，有利于在临床实践中推广应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北三狮生物科技有限公司
<120> 同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法
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gatgcgaaat ctgctcaaac a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（PORV P-R）
<400> 8
tccaacccaa agtccttaca a 21
Claims (7)
1.一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物，其特征在于，其核苷酸序列为：
PEDV P-F:5′-AAG GAG GTA ACC GCA CAG AAT-3′；
PEDV P-R:5′-AAA ATA CAT ACG AAA GTA GAG CCT G-3′；
PRRSV P-F:5′-AGGAGGTCCACAATAGCACAGA-3′；
PRRSV P-R:5′-CAACTACCACCACAACACGAG-3′；
TGEV P-F:5′-CTG TCC ATC TAA CTC AGA GGC AAA C-3′；
TGEV P-R:5′-AAC CAC CTG AAC ACC ACC AAG-3′；
PoRV P-F:5′-GAT GCG AAA TCT GCT CAA ACA-3′；
PoRV P-R:5′-TCC AAC CCA AAG TCC TTA CAA-3′。
2.一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、缓冲液和去离子水。
4.权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，具体操作为：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
5.如权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述PCR扩增的体系包括以下试剂及用量：灭菌水3.3μL，2×PCR扩增MIX 12.5μL，10μmol/L的PEDV P-F和10μmol/L的PEDV P-R引物各0.2μL，10μmol/L的PRRSV P-F和10μmol/L的PRRSV P-R引物各1.0μL，10μmol/L的TGEV P-F和10μmol/L的TGEV P-R引物各0.4μL，10μmol/L的PoRV P-F和10μmol/L的PoRV P-R引物各1.0μL和模板4.0μL。
6.如权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性50s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。
7.如权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述待测病毒的基因组的提取采用基因组提取试剂盒提取。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN112760418A (zh) * | 2021-01-30 | 2021-05-07 | 福建傲农生物科技集团股份有限公司 | 一种猪流行性腹泻病毒的引物、试剂盒及应用 |
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| CN110093461A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-08-06 | 安徽农业大学 | 四种猪腹泻病毒的四重rt-pcr检测引物及试剂盒 |
-
2020
- 2020-07-07 CN CN202010645937.XA patent/CN111647692A/zh active Pending
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