CN107312831A

CN107312831A - 一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒及检测方法

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Publication number: CN107312831A
Application number: CN201710277895.7A
Authority: CN
Inventors: 张锐; 兰文升; 孙美榕; 王康
Original assignee: Shenzhen Zhongda Innovation Biological Science And Technology Co Ltd; Guangdong Ocean University; Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine
Current assignee: Shenzhen Zhongda Innovation Biological Science And Technology Co Ltd; Guangdong Ocean University; Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2017-11-03

Abstract

本发明属于海洋微生物检测技术领域，公开了一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括荧光定量PCR所需试剂，还包括阳性对照物，4对荧光PCR引物和4条分子信号探针和PCR引物；所述阳性对照物为含有霍乱弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌16SrDNA序列的质粒；所述4对荧光PCR引物和分子信号探针依次如SEQ ID NO.3～14所示；所述PCR引物如SEQ ID NO.1～2所示。本发明所述试剂盒的灵敏度较常规提高了100倍，基本对模板中100 copies/μL的目标序列可以有效检出，在海洋弧菌检测中具有较大的应用前景。

Description

一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于海洋微生物检测技术领域，具体地，涉及一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒及其检测方法。

背景技术

近年来，由于海洋渔业资源的日渐衰退，渔业捕捞量已大幅度下降，单靠海洋捕捞已远远不能满足我国人民对海洋水产品的需求，因此，海水养殖得到普遍重视和大力发展。扩大鱼类增养殖，开发鱼类蛋白资源是当今世界水产增养殖中最活跃的科研开发工作，水产养殖已成为世界上增加鱼类来源最迅速的方式，也是水产品生产发展的必然趋势。

弧菌病(Vibriosis)是由弧菌属细菌(Vibrio spp.)引起的一类细菌性疾病，该病在全球范围内广泛发生，其暴发性流行不仅给海水养殖鱼类、贝类及甲壳类等经济动物的养殖业造成巨大的经济损失，还导致野生的海水鱼类、贝类及甲壳类大量死亡，因此，对该类疾病的研究一直备受国内外研究工作者的关注，是海水养殖动物病害的主要研究领域之一。国外对海水鱼类弧菌病的研究始于20世纪初，自20世纪60年代后相继对多种弧菌属的致病菌有较丰富的研究和报道。在我国，海水养殖业经历了藻、虾、贝的3次养殖浪潮之后，又相继迎来了90年代形成的海水鱼类养殖的第4次养殖高潮。然而，由于养殖面积过速扩展、养殖密度过高和管理不当，养殖鱼类疾病繁生，造成巨大的经济损失。由弧菌引起的死亡时有报道，弧菌病被公认为是鱼类养殖中最为严重的病害之一，是该行业发展的重要限制性因素。

做好海水中弧菌的检测是预防海洋水产疾病的重要前提，而阳性对照在海水弧菌检测工作中必不可少，但是由于作为阳性对照的样本不易获得和不稳定性，样本直接作为阳性对照可操作性差，不利于快速高效的对弧菌进行检测。另外，如何进一步提高普通荧光定量PCR 的灵敏度也是当前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中海洋弧菌检测缺少阳性对照物以及荧光定量PCR灵敏度不高的缺陷和不足，提供一种含有阳性对照物的荧光定量PCR试剂盒；所述试剂盒的灵敏度提高了100倍，基本对模板中100copies/μL的目标序列可以有效检出，在海洋弧菌检测中具有较大的应用前景。

本发明的目的是提供一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒。

本发明的另一目的是提供利用上述试剂盒检测海洋弧菌的方法。

本发明的再一目的是提供上述试剂盒及方法的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒，包括荧光定量PCR所需试剂，还包括阳性对照物，4 对荧光PCR引物和4条分子信号探针和PCR引物；所述阳性对照物为含有霍乱弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌16SrDNA序列的质粒；所述4对荧光PCR引物和分子信号探针依次如SEQ ID NO.3～14所示；所述PCR引物如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明通过扩增霍乱弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌的16SrDNA靶基因，连接到T-vector载体，一方面作为试剂盒的阳性对照物，另一方面由于重组质粒浓度稳定和非常易于不断扩增，在试剂盒的研发过程中当作标准样本，测试检测试剂盒的特异性和敏感性，通过将荧光定量PCR的模板预先进行普通PCR，可大大提高荧光定量PCR的灵敏度。

优选地，所述质粒为阳性质粒pMD-Vc、pMD-Vp、pMD-Vv和pMD-Va。

一种同时检测四种海洋弧菌的方法，先提取待测弧菌样品DNA，再将待测样品和权利要求1中的阳性对照物用权利要求1中所述PCR引物SEQ ID NO.1～2进行预扩增，再将预扩增的PCR产物用引物SEQ ID NO.3～14进行荧光定量PCR检测，通过阳性对照物比较，计算出待测样品中四种弧菌的含量。

优选地，所述预扩增的PCR反应体系：2x Ex Taq Mixture 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板3μL，ddH2O 7.5μL，共25μL；所述PCR反应程序为：95℃，4 min；94℃45s，42℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s，43℃45s，72℃45s，2个循环； 94℃45s，44℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s，45℃45s，72℃45s，2个循环；94℃ 45s，46℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s，47℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s， 48℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s，49℃45s，72℃45s，2个循环；94℃45s，45℃ 45s，72℃45s，15个循环；72℃，5min；4℃，Pause。

优选地，所述荧光定量PCR的反应体系为：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.08μL，Mix 10μL，Rox 0.5μL，预扩增产物2μL，双蒸水补足至20μL；所述荧光定量PCR反应程序为：50℃2min，95℃10min，95℃10min，60℃1min，40个循环。

本发明有现有技术相比，具有以下技术效果：

(1)本发明的海洋弧菌阳性对照物可作为试剂盒的阳性对照物或者试剂盒的研发过程中标准样本，测试检测试剂盒的特异性和敏感性。

(2)本发明所述试剂盒及检测方法可以同时检测四种海洋弧菌，且灵敏度提高了100 倍，基本对模板中100copies/μL的目标序列可以有效检出，在海洋弧菌检测中具有较大的应用前景。

附图说明

图1为四种弧菌16srDNA基因同源区序列。

图2为Vc梯度稀释电泳图；(M，DL2000Marker；1，弧菌质粒原液；2，10倍稀释液；3，10²倍稀释液；4，10³倍稀释液；5，10⁴倍稀释液；6，10⁵倍稀释液；7，10⁶倍稀释液)。

图3为Vp梯度稀释电泳图；(M，DL2000Marker；1，弧菌质粒原液；2，10倍稀释液；3，10²倍稀释液；4，10³倍稀释液；5，10⁴倍稀释液；6，10⁵倍稀释液；7，10⁶倍稀释液)。

图4为Va梯度稀释电泳图；(M，DL2000Marker；1，弧菌质粒原液；2，10倍稀释液；3，10²倍稀释液；4，10³倍稀释液；5，10⁴倍稀释液；6，10⁵倍稀释液；7，10⁶倍稀释液)。

图5为Vv梯度稀释电泳图；(M，DL2000Marker；1，弧菌质粒原液；2，10倍稀释液；3，10²倍稀释液；4，10³倍稀释液；5，10⁴倍稀释液；6，10⁵倍稀释液；7，10⁶倍稀释液)。

图6为Vc阳性。

图7位Vp阳性

图8为Va阳性

图9为Vv阳性

图10为三重荧光定量PCR扩增曲线。

图11为三重荧光定量PCR灵敏度检测。

图12为三重荧光定量PCR对海洋水样的检测。

图13为本发明试剂盒检测方法示意图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1四种海洋弧菌阳性参照物的制备

本实施例所用菌株为：霍乱弧菌分离培养物(Vibrio cholerae，Vc)，副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus，Vp)，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus，Va)，创伤弧菌(Vibriovulnificus,Vv)，以上菌株均由深圳出入境检验检疫局技术中心水生室分离和保存。

1、弧菌DNA的提取

分别用无菌接种针从保存在冰箱的Vc、Vp、Va和Vv这四种菌株的培养物中挑取菌种到碱性蛋白胨水的试管中，过夜培养，第二天，直接取四种弧菌的培养物约200μL，12000g/min 离心5min，取沉淀物，用DNA抽提试剂盒分别提取四种弧菌的总DNA，-20℃存放备用。

2、四种弧菌16SrDNA扩增引物的设计

四种弧菌16SrDNA基因参考序列的GenBank序列号(GenBank No.)如下：Vc(V.cholerae, LMG 21698T)，NC_002505；Vp(V.parahaemolytic,LMG 2850T)，BA000031；Vv(V.vulnificus, LMG13545T)，NC_005139；Va(V.alginolyticus,LMG 4409T)。

根据上述弧菌的16SrDNA序列设计引物：27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCT CAG-3’；1492R：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’；使该引物能够通过普通PCR扩增出上述四种弧菌16SrDNA基因，使该引物扩增的基因序列完全包含图1的序列，即包含HAN-HV和 HAN-R-C的通用引物区域，使阳性对照扩增的靶序列的碱基数要多于HAN-HV和HAN-R-C 引物扩增产物。

3、弧菌16SrDNA的PCR扩增

(1)分别以四种弧菌基因组DNA为模板，以使用引物27F和1492R引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：Ex Taq酶系统25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板6μ L，ddH2O17μL，共50μL体系，做四个平行。

反应条件：95℃预变性3min、94℃变性45s、退火45s、72℃延伸1min20 s为一个循环，进行31个循环后，72℃再延伸7min，扩增结束后，1％琼脂糖凝胶电泳(100mL凝胶体系中加入5μL的Andy Gold DNA Gel Stain染料)。

(2)PCR扩增产物的检测

使用1～1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检查，使用电压为110V，电泳时间25～30min，电泳结束后，使用BIO-RAD型凝胶成像分析系统观察结果确定为目的条带后，切胶备用。

4、弧菌重组质粒DNA的制备与检测

(1)PCR扩增产物的纯化

用DNA凝胶回收试剂盒进行PCR扩增产物回收。(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.3.0)切胶前，用大孔的胶板电泳，于大孔中加入100μL，小孔中加Marker。

DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，于长波紫外灯下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶，切成两段放入两个无菌的1.5mL的Eppendorf管中，分别加入200μL的GM溶胶液(1％胶浓度，加入3个凝胶体积量的GM溶胶液)，振荡，于37℃水浴5～10min，其间轻弹EP管，使凝胶完全溶化。然后将溶化的液体转移至回收柱，柱子置于收集管中，于室温静置2min，14000rpm离心1min，弃滤液，用Buffer WB洗两次，每次700μL，14000rpm离心30s，最后14000rpm离心2min，将回收柱转至干净的1.5mL EP管中，静置5min，待乙醇挥发，加入ddH2O分三次洗脱，每次10μL于室温放置3min，14000rpm离心1min，收集管中即为回收的DNA片段，可直接用于DNA酶切及连接等实验，也可于-20℃保存备用。

(2)目的片段的连接

本实验选用TaKaRa的pMD18-T载体连接试剂盒。

10μL连接反应体系：5μL Ligase buffer(solution I)、0.5μL T-vector、目的基PCR 扩增纯化提取液4.5μL，混匀后，在PCR仪中，设置16℃连接过夜。

(3)连接产物的转化

取出制备好的E.coli DH5α感受态细胞，置于冰上融化，取两个1.5mL的EP管，分别加入50μL的感受态细胞，再将10μL连接产物加入，用移液器轻轻吹打混匀，在冰上放置5～10min，取出，置于42℃水浴，热休克70～90s，取出置于冰上3～5min，在分别向两管加入750μL的LB液体培养基，摇床37℃，220rpm，50min～1h，转移至高速离心机中，9000 rpm，3～5min，弃400μL上清液，每管剩余410μL再悬浮，分两次，每次200μL涂在含100μg/mL AMP的LB固体平板上，于37℃恒温培养箱中，培养约16h，翌日可见白色单菌落。

(4)重组质粒DNA的扩增

在超净台中吸取5mL含100μg/mL AMP的LB液体培养基至玻璃试管中，从含AMP的LB 固体培养基上挑取单菌落转移至试管中，将试管标号，其中0号管是阴性对照，置于摇床中 37℃，200rpm，培养16h。

(5)菌落PCR鉴定

重组质粒DNA摇床培养8h时，对应培养的试管号，吸取3μL菌液做PCR模板，PCR体系为25μL：7.5μL ddH2O、12.5μL Ex Taq酶系统、1μL上游引物、1μL下游引物、 3μL模板，进行PCR鉴定。

(6)重组质粒的制备

将菌落PCR鉴定为阳性的对应试管，提取质粒，按照(TaKaRa MiniBEST PlasmidPurification Kit Ver.3.0)操作。每个菌株选取两管，每管分出10μL，测序鉴定阳性质粒，剩余的-20℃保存，备用。

测序结果为阳性的质粒大量提取和纯化，然后用核酸蛋白分析仪测定质粒浓度，根据阿弗加德罗常数将浓度转换为拷贝数，根据260nm与280nm波长下的光密度比值判断其纯度(当OD260nm/OD280nm>1.8为纯品)，纯品按公式计算拷贝数。

结果：通过分子克隆技术将四种弧菌16SrDNA克隆到pMD-T载体，分别得到如下阳性质粒模板：pMD-Vc、pMD-Vp、pMD-Vv和pMD-Va，通过测序证明载体上的所有基因片段包含有通用引物HAN-HV和HAN-R的扩增片段区域，这些阳性模板将作为后期试剂盒研发测试的基本材料。经过计算所获得的阳性质粒模板浓度及拷贝数如表9所示。

表1四种弧菌核酸片段最适退火温度和扩增片段大小及重组质粒

5、四种弧菌16SrDNA模板的验证

(1)根据四种弧菌16SrDNA基因序列的同源区设计PCR兼并引物：HAN-HV：5’ -GAYTTYGCNWSNYTNTAYCC-3’；HAN-R：5’-TCNGTRTCNCCRTA-3’。

(2)通用引物核酸扩增测试

利用简并引物，将已经测过序并确定为目标基因的四种弧菌16SrDNA基因的重组质粒为模板进行PCR条件摸索。

PCR反应体系：Ex Taq酶系统12.5μL，上游引物1μL(20μM)，下游引物1μ L(20μM)，模板3μL，ddH2O 7.5μL，共25μL体系。

反应条件：95℃预变性3min、94℃变性45s、退火温度设置12个温度梯度(最低温度为40℃，最高温度为49℃)退火2min、72℃延伸2min为一个循环，进行31个循环后， 72℃再延伸7min，扩增结束后，1％琼脂糖凝胶电泳(100mL凝胶体系中加入5μL的Andy Gold DNAGel Stain染料)观察结果。

结果：利用简并引物分别对四种弧菌PCR扩增的退火温度经摸索后，得出各自的最适退火温度。对应Vc、Vp、Va和Vv的PCR退火温度分别为45.1℃、46℃、42.9℃和49℃，反应体系为25μL体系：Ex Taq酶系统12.5μL，上游引物1μL(20μM)，下游引物1μL (20μM)，模板3μL，ddH2O 7.5μL。所用兼并引物能够从重组质粒pMD-Vc、pMD-Vp、 pMD-Va和pMD-Vv中扩增到目的片段，扩增片段大小分别为459bp，657bp，484bp，484bp，经过测序确证是相应的16SrDNA基因片段，即兼并引物能够有效扩增所有重组质粒上插入的对应片段。

(3)PCR灵敏度

分别将含有四种弧菌16SrDNA基因的质粒进行梯度稀释至10^-6浓度。即，原液，10^-1，10^-2， 10^-3，10^-4，10^-5，10^-6。按优化过的PCR条件操作，测试利用简并引物对四种弧菌做普通PCR 的最低检测浓度，PCR反应条件同上。

结果：表2为用hanson引物扩增4种弧菌预计扩增产物片段长度以及反应最适退火温度，图2～5为PCR反应结果。

表2 hanson引物针四种弧菌的最适退火温度

弧菌种类	退火温度	片段大小
			Vc	46℃	657bp
Vp	43.9℃	604bp
			Va	45.1℃	459bp
Vv	49℃	484bp

由图2～5分析可知，Vc和Vp模板稀释10⁵倍时，即为普通PCR的检测下限；Va和Vp模板稀释10⁴倍时，即为普通PCR的检测下限；

通过对五种弧菌进行的简并PCR结果分析可知，Hanson设计的简并引物能较好的扩增出除Va以外的四种弧菌，对Vv的效果不是很理想。而由图，Vv的非特异性条带较多。简并引物对Vc和Vp的特异性相对较好。

由图2～5可以看出，Vc，Vp，Va，Vv四种弧菌经简并PCR扩增后，所得目的条带与预期值接近，只有扩增Vc弧菌的DNA聚合酶基因组大小与预期值相比偏小，经测序，该片段确为Vp弧菌的DNA聚合酶基因，但是大小604bp较760bp的预期值小了156bp。

阳性重组质粒为模板，用通用引物扩增可以获得预计大小的DNA片段，获得的扩增产物通过测序验证为四种DNA聚合酶基因的扩增产物，获得的重组质粒的浓度及拷贝数如表1所示。因此，阳性重组质粒可以作为阳性模板在后续研究中使用。

实施例2四种弧菌的三重荧光定量PCR

试验样品为实施例1制备的阳性质粒pMD-Vc、pMD-Vp、pMD-Vv和pMD-Va。

1、引物和探针设计

设计扩增四种弧菌16SrDNA基因的引物和探针，实验用探针为Taqman MGB探针，在TAMER 之后再标记一个MGB(Minor Groove Binder)，可使探针的Tm值较高，即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。

表3 Realtime PCR引物序列

弧菌名称	名称	序列(方向为5’to 3’)
			霍乱弧菌	Vc-F	GGTGCTCCGAGTGGATAGA
	Vc-R	TGCTTGAGTGCCCTCTTATG
				Vc-T	TCCCAAGCTCGTCCGCC(5′FAM，3′BHQ1)
副溶血弧菌	Vp-F	AGAACCAGCTGGGGACAA
				Vp-R	GTCGAGGAGATTGGTGAGG
	Vp-T	TGCGCCTGCAGGCTCC(5'CY3,3'BHQ2)
			溶藻弧菌	Va-F	CGAGTCTGTACCCCAGCA
	Va-R	CGGTATCTTTTTCCAATCGAG
				Va-T	ACGGAGGCATCAGCCCAGA(5′HEX，3′BHQ1)
创伤弧菌	Vv-F	TGCTACAAGAACAAGGAGGTC
				Vv-R	ACCTCATGCTCAGGTAGTGG
	Vv-T	GGCTGGGTCCGCTTCGA(5′ROX，3′BHQ2)

2、单重PCR对引物和探针的验证

(1)将弧菌的上下游引物和分子信标探针同时加入反应体系中，于ABI 7500荧光定量PCR 仪上进行检测反应。分别选用0.2、0.4、0.6、0.8、1μmol/L的引物浓度和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μmol/L的探针终浓度，采用矩阵法筛选引物和探针的最佳浓度，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)时的引物和探针浓度为最佳。

(2)Touchdown PCR

以四种弧菌DNA或者阳性质粒为模板(本研究中用阳性质粒做模板方便研究检测方法的特异性和灵敏性)，以HAN-HV和HAN-R为引物，对待检底物做初步扩增。反应体系和条件如下所示，通过此程序对样品中含有所有目的核酸片段都能得到初步扩增，有效提高后续荧光定量PCR的模板量。

表4 25μL反应体系的PCR反应的反应体系组成

反应试剂	加样体积
		模板DNA	3μL
2X Ex taq Mixture	12.5μL
		Han-forward primer	1μL
Han-reverse primer	1μL
		双蒸水	7.5μL
总体积	25μL

反应条件：

95℃，4min；

94℃45s，42℃45s，72℃45s，2个循环；

94℃45s，43℃45s，72℃45s，2个循环；

94℃45s，44℃45s，72℃45s，2个循环；

94℃45s，45℃45s，72℃45s，2个循环；

94℃45s，46℃45s，72℃45s，2个循环；

94℃45s，47℃45s，72℃45s，2个循环；

94℃45s，48℃45s，72℃45s，2个循环；

94℃45s，49℃45s，72℃45s，2个循环；

94℃45s，45℃45s，72℃45s，15个循环；

72℃，5min

4℃，Pause

(3)荧光定量PCR

将实施例1中的扩增产物稀释100倍作为模板，用相应引物和探针做荧光定量PCR扩增，反应体系和条件如表5所示。

表5 20μL体积的反应体系组成

上游引物	0.5μL
		下游引物	0.5μL
探针	0.08μL
		Mix	10μL
Rox	0.5μL
		模板TouchdownPCR产物	2μL
双蒸水	6.3μL

反应条件：

50℃，2min

95℃，10min

60℃，1min，40个循环

结果：引物浓度和探针浓度对Realtime PCR的扩增效率有一定的影响，为了探索引物和探针浓度的相互关系，选用CCV重组质粒，以其不同浓度的引物和探针做Realtime PCR，通过 PCR的结果即循环数(CT值)分析扩增效率，CCV重组质粒模板2μL，荧光PCR Mix(2 ×)10μL，上游引物xμL(20μM)，下游引物xμL(20μM)，探针yμL(50μ M)，ddH2O处理水补足到20μL。结果见表6，从表中可以看出，以上述反应体系而言，引物加样体积为0.5μL(终浓度为0.5μM)和探针加样体积为0.08μL(终浓度为0.2μ M)是反应体系较佳的引物与探针的比例。

表6 CCV重组质粒使用不同引物和探针浓度的扩增效率

3、荧光定量PCR的灵敏性、特异性和重复性实验

对已知拷贝数的含有目的扩增片段的重组质粒进行10倍系列稀释，对各稀释度同时进行荧光PCR检测，从而确定该方法的最低检出限，评价荧光定量PCR 的检测灵敏度，并建立绝对定量标准曲线。对最低检测限浓度的质粒再做十倍稀释，经hanson的简并PCR扩增后，将产物再用荧光定量PCR对其进行检测，直至稀释的质粒模板经简并PCR后，荧光定量PCR也不能检出目的基因，记下此时的最低检测限，与原有最低检测限相比，可得出经此法比原有的荧光定量PCR 最低检测限提高了多少个灵敏度。

将含有四种弧菌16SrDNA序列的质粒两两混合，按照优化过的条件，做荧光定量PCR，比较特异性。(选取质粒的Ct值较近，即浓度相对较近的稀释度，两两混合。)

在同一次实验中，对十倍系列稀释的样品进行荧光定量PCR检测，每个样品做6个平行的反应管，通过计算标准差(SD)和变异系数(CV，标准偏差/重复值的平均数)来验证荧光定量PCR批内的重复性。对上述各梯度稀释的样品进行组间重复实验。

(1)荧光定量PCR反应的灵敏性

因为直接使用Realtime PCR可以对模板中的目的DNA片段检测，所以一般认为Realtime PCR 的敏感性极高，可以达到日常检测的目的。本研究在Realtime PCR之前增加普通PCR初步扩增，研究对一般Realtime PCR敏感性提高水平，结果如表7所示，从表中的数据可以看出通过用通用引物的PCR初步扩增将Realtime PCR敏感性普遍提高了100倍，基本对模板中100 copies/μL的目标序列可以有效检出，因此，在Realtime PCR之前增加的通用引物的 Touchdown PCR可以明显提高四种病原的检出率。

表7五种弧菌的荧光定量PCR的灵敏性

(2)荧光定量PCR反应的特异性

对于特定检测对象只能使用相应的引物和探针做出阳性反应的结果，而其它引物和探针只有阴性反应，见表8，证明设计的引物和探针具有很高的特异性。

表8四种弧菌模板对其余弧菌检测所用体系的检测结果比较

(3)荧光定量PCR的干扰性实验

如果样本中含有多个弧菌成分，需要通过一步反应将目标序列检出，这时候一个体系中所用检测两种或者多种靶序列的的引物和探针有可能相互之间干扰，进而影响检测结果的准确性，本研究用三重反应体系分别检测Vc、Vp、Vv和Va DNA模板，以确定4种弧菌的探针、引物之间是否存在相互干扰现象。

4、建立二重及三重Real-time PCR的检测方法

在单重Real-time PCR测试的基础上，对探针引物浓度进行优化后，建立三重荧光定量PCR 反应体系20μL：2×qPCR Super Mix-UDG 10μL，Vc引物(上下游各20μM)0.5μL， Vp引物(上下游各20μM)0.5μL，Va引物(上下游各20μM)0.5μL，Vc探针(10 μM)0.5μL，Vp探针(10μM)0.5μL，Va探针(10μM)0.5μL，Rox 0.5μL，模板2μL，ddH2O 3μL。反应条件：95℃，10min；95℃，15s；60℃，1min；40个循环。测试步骤依然是两步PCR，首先作Touchdown PCR对样本中的模板初步扩增，然后通过二重及三重Real-time PCR鉴别不同类型的核酸。

(1)特异性试验

提取另外一种弧菌DNA(创伤弧菌Vv)做为模板，分别进行三重荧光定量PCR检测，以确定三重荧光定量PCR反应的特异性。

结果：由图10可知，同一反应体系中，三种信号间的影响不大，可以有效的区分出来。三重荧光定量PCR体系优化的实验结果表明，不同浓度的引物和探针的的配比对检测结果的影响较大，而三种引物和探针的浓度比为2:1时，效果较好。本实验采用的，三种引物的浓度为0.5μmol/L，探针为0.25μmol/L。

提取创伤弧菌Vv做为模板，分别进行三重荧光定量PCR检测，以确定该方法的特异性，结果这两种弧菌都没有扩增，说明该方法有较强特异性。

(2)敏感性试验

将3种弧菌的DNA阳性质粒到相同浓度，混匀进行10倍系列稀释，得到2种弧菌DNA浓度均为10⁷拷贝/μL，10⁶拷贝/μL，10⁵拷贝/μL，10⁴拷贝/μL，10³拷贝/μL，10²拷贝/μL， 10¹拷贝/μL。利用已建立的三重荧光定量PCR的方法对其检测。

结果：对3种弧菌的混合稀释的阳性标准品进行三重荧光定量PCR检测，图11所示，A、B、C分别为Cv和Cp的灵敏度测试结果。曲线从左至右一次代表拷贝数为10⁷/μL～10 /μL。有图可知在模板浓度为10⁷/μL～10²/μL时，浓度与CT值成正比，而当模板浓度为 10拷贝/μL时，CT值与模板浓度不成线性关系，且呈现弱阳性。故三重荧光定量PCR对两种弧菌模板最低可检测至10²拷贝/μL。

(3)干扰性试验

为确定2种弧菌的探针、引物之间是否存在相互干扰现象，我们用三重反应体系分别检测Vc 和Vp的DNA模板，结果模板的扩增曲线，均只有一种特异性探针发生水解，得到一条扩增曲线，另外两种探针检测显示为阴性，说明各探针、引物之间无相互干扰现象。

(4)三重和单重荧光定量PCR方法的比较

为比较三重荧光定量PCR与单重之间的差异，将两种弧菌混合后，十倍稀释，取混合液中，两种弧菌的浓度为10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL四个稀释度为模板，然后分别用单重实时荧光PCR和多重实时荧光PCR进行检测，每组做三个平行，以确定单重和多重实时荧光PCR之间的差异。

单重荧光定量PCR反应体系20μL：2×qPCR SuperMix-UDG 10μL，引物(上下游各20μM)0.5μL，探针(10μM)0.5μL，Rox 0.5μL，模板2μL，ddH2O 6μL。反应条件：95℃，10min；95℃，15s；60℃，1min；40个循环。

结果：如表9可知，三重荧光定量PCR在对两种弧菌的不同浓度模板检测时，变异系数介于0.24％～2.42％之间，说明该法具有良好的稳定性。对数据分析的结果，单重实时荧光 PCR和三重荧光定量荧光PCR在同一浓度模板检测上并没有明显差异。

表9两种不同稀释度模板的单重和三重荧光定量PCR效果比较

*注：三重荧光定量PCR CT值与各自单重荧光定量PCR CT值无显著差异(p＞0.05)

(5)三重荧光定量PCR对水样的检测

本研究建立的三重荧光定量PCR方法对相应的水样进行实测，以验证方法的灵敏性和特异性。使用试剂盒从水样中分别抽提四种弧菌的DNA。并将得到的DNA样品按1：1混合，用建立的三重荧光定量PCR方法进行检测。

将含有Vc、Vp和Va的DNA混合，再利用建立的三重荧光PCR对其进行检测。图 12结果证明，该法确实能有效的检测并区分Vc、Vp和Va，具有一定的实用意义。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东海洋大学

深圳市检验检疫科学研究院

深圳市中大创新生物科技有限责任公司

<120> 一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒及检测方法

<130> 2016

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> HAN-HV

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

gayttygcnw snytntaycc 20

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> HAN-R

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

tcngtrtcnc crta 14

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Vc-F

<400> 3

ggtgctccga gtggataga 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Vc-R

<400> 4

tgcttgagtg ccctcttatg 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> Vc-T

<400> 5

tcccaagctc gtccgcc 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Vp-F

<400> 6

agaaccagct ggggacaa 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Vp-R

<400> 7

gtcgaggaga ttggtgagg 19

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> Vp-T

<400> 8

tgcgcctgca ggctcc 16

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Va-F

<400> 9

cgagtctgta ccccagca 18

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Va-R

<400> 10

cggtatcttt ttccaatcga g 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Va-T

<400> 11

acggaggcat cagcccaga 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Vv-F

<400> 12

tgctacaaga acaaggaggt c 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Vv-R

<400> 13

acctcatgct caggtagtgg 20

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> Vv-T

<400> 14

ggctgggtcc gcttcga 17

Claims

1.一种同时检测四种海洋弧菌的试剂盒，包括荧光定量PCR所需试剂，其特征在于，还包括阳性对照物，4对荧光PCR引物和4条分子信号探针和PCR引物；所述阳性对照物为含有霍乱弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌16SrDNA序列的质粒；所述4对荧光PCR引物和分子信号探针依次如SEQ ID NO.3～14所示；所述PCR引物如SEQ ID NO.1～2所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒为阳性质粒pMD-Vc、pMD-Vp、pMD-Vv和pMD-Va。

3.权利要求1或2所述试剂盒在海洋弧菌检测中的应用。

4.一种同时检测四种海洋弧菌的方法，其特征在于，先提取待测弧菌样品DNA，再将待测样品和权利要求1中的阳性对照物用权利要求1中所述PCR引物SEQ ID NO.1～2进行预扩增，再将预扩增的PCR产物用引物SEQ ID NO.3～14进行荧光定量PCR检测，通过阳性对照物比较，计算出待测样品中四种弧菌的含量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述预扩增的PCR反应体系：2x Ex TaqMixture 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板3 μL，ddH2O 7.5 μL，共25 μL；所述PCR反应程序为：95℃，4 min；94℃ 45s，42℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，43℃45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，44℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，45℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，46℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，47℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，48℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，49℃ 45s，72℃ 45s，2个循环；94℃ 45s，45℃ 45s，72℃ 45s，15个循环；72℃，5min；4℃，Pause。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系为：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，探针0.08 μL，Mix 10 μL，Rox 0.5 μL，预扩增产物2 μL，双蒸水补足至20 μL；所述荧光定量PCR反应程序为：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 10 min，60℃1 min，40个循环。

7.权利要求4～6任一所述方法在海洋弧菌检测中的应用。