CN107337730B - 一种抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.13843的小鼠杂交瘤细胞株分泌产生。本发明还公开了一种检测斑点叉尾鮰病毒的胶体金试纸条。本发明进一步公开了上述单克隆抗体、杂交瘤细胞株和胶体金试纸条的应用。本发明抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体特异性强，能准确的检测出斑点叉尾鮰病毒，为预防和诊断斑点叉尾鮰病毒病提供了有利的条件。

Description

一种抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，更具体地，涉及一种抗斑点叉尾鮰病毒核蛋白的单克隆抗体，杂交瘤细胞株及其建立一种检测斑点叉尾鮰病毒的胶体金试纸条。
背景技术
斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)也被称为沟鲶，属于鲇形目、鮰科。其具有生长速度比较快、肉质细嫩、销售价格较高的特点，受到了广大消费者和水产养殖业者的欢迎。随着其养殖规模的逐步扩大，由于病毒感染引起的斑点叉尾鮰病毒病(Channelcatfish virus disease，CCVD)的日益流行，给其养殖业造成了巨大的经济损失。
斑点叉尾鮰病毒病(CCVD)最早流行于北美。爆发流行的最适水温为25-30℃。该病是由疱疹病毒(即斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus)，简称CCV)引起的疾病，该病毒导致斑点叉尾鮰幼鱼群爆发急性传染病，并导致很高的死亡率。其中刚孵化的鱼苗其死亡率达100％。
CCV是鮰鱼疱疹病毒I型(Ictalurid herpesvirus I)，常称为斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)，国际病毒分类委员会(ICTV)第八次报告的最新病毒分类系统将其归类为疱疹病毒科(Herpesvirus)的鮰疱疹病毒属(Ictalurivirus)。它是Fijan于1968年发现的一种线性双链DNA病毒。其也是鱼类中最早发现疱疹病毒。病毒颗粒为20面体对称，由囊膜、间层和核衣壳组成，核衣壳由162个壳粒组成，具有囊膜的完整病毒粒子直径约为175nm。CCV的基因组大小约为134kb.整个基因组预测由76个开放阅读框(Openreading frame，ORF)组成。其中，囊膜蛋白有ORF10、ORF46和ORF59；核衣壳蛋白有ORF27、ORF28、ORF39和ORF53等；间层蛋白有ORFl l、ORFl2和ORF65等。每种结构蛋白在斑点叉尾鮰病毒扩增、感染过程中都起到重要作用，研究其对后期病毒感染机理以及疫苗都具有重要作用。
目前国内外检测这种病毒的方法主要有中和试验、斑点杂交检测技术、PCR技术、实时定量荧光探针PCR技术、免疫荧光技术等。这些方法虽然准确可靠，但因具有操作繁琐、检测周期长等缺点，不能满足快速确诊病原、及时控制疫情的实际工作需求，因此，建立更灵敏快捷的检测技术对该病的防治具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体及其分泌产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的第二个目的在于提供一种检测斑点叉尾鮰病毒的胶体金试纸条。
本发明的第三个目的在于上述单克隆抗体、杂交瘤细胞株和胶体金试纸条制备检测斑点叉尾鮰病毒的试剂或试剂盒中应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCCNo.13843的小鼠杂交瘤细胞株CCV-8B6分泌产生。该小鼠杂交瘤细胞株CCV-8B6已于2017年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC No.13843，分类命名为杂交瘤细胞株。
保藏编号为CGMCC No.13843的小鼠杂交瘤细胞株也属于本发明的保护范围。
本发明进一步提供了一种检测斑点叉尾鮰病毒的胶体金检测试纸条，该胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一抗体，即兔抗斑点叉尾鮰病毒的多克隆抗体；所述金标垫上含有胶体金标记的第二抗体，即抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.13843的杂交瘤细胞株分泌得到。
其中，所述兔抗斑点叉尾鮰病毒的多克隆抗体的制备包括以下步骤：用纯化的斑点叉尾鮰病毒作为抗原，多点注射免疫新西兰大白兔，分别是每1周免疫一次，共免疫4次；取血清，经过饱和硫酸铵纯化法纯化，即得兔抗斑点叉尾鮰病毒的多克隆抗体，作为检测试纸条中的第一抗体。
在本发明优选的实施方式中，所述制备胶体金试纸条的方法为：用喷金点膜机将兔抗斑点叉尾鮰多克隆抗体和羊抗鼠IgG喷于基膜上，形成相互平行的T线和C线，烘干；将胶体金标记的抗斑点叉尾鮰病毒的单克隆抗体用喷金点膜机均匀的喷在金标垫上；然后将样品垫、金标垫、喷有T线和C线的基膜和吸水垫依次连接组装，而后裁切包装即可。
本发明检测斑点叉尾鮰病毒的胶体金检测试纸条的检测原理为：将待检样品滴入样品垫中，若样品中有斑点叉尾鮰病毒，待检样品中斑点叉尾鮰病毒先和胶体金标记的单克隆抗体结合，由于毛细管作用，斑点叉尾鮰病毒和胶体金标记的单克隆抗体形成的复合体沿基膜向前泳动，到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素基膜上的第一抗体(即兔抗斑点叉尾鮰病毒的多克隆抗体)，由于第二抗体(即抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体)和第一抗体分别能结合斑点叉尾鮰病毒的不同抗原表位结合，从而形成“胶体金标记的单克隆抗体-斑点叉尾鮰病毒-第一抗体”复合体，从而使得胶体金富集在检测线上，形成特异性的紫红色层析线；没有和斑点叉尾鮰病毒结合的胶体金标记的单克隆抗体则会直接通过检测T线，达到质控C线后被质控线上的羊抗鼠IgG捕获，从而使得胶体金富集在质控C线上形成紫红色层析线，即判为阳性结果；若样品中无斑点叉尾鮰病毒，由于无法在检测线上形成“胶体金标记的单克隆抗体-斑点叉尾鮰病毒-第一抗体”复合体，从而使得检测T线上不会产生肉眼可见的颜色反应，没有和斑点叉尾鮰病毒结合的胶体金标记的单克隆抗体则会直接通过检测T线，达到质控C线后被质控线上的羊抗鼠IgG捕获，从而使得胶体金富集在质控C线上形成紫红色层析线，即判为阴性结果。
本发明还提供了上述抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株、胶体金试纸条在检测斑点叉尾鮰病毒中的应用。
进一步，所述应用为所述单克隆抗体、杂交瘤细胞株、胶体金试纸条在制备检测斑点叉尾鮰病毒的试剂或试剂盒中应用。
本发明的有益效果如下：
1、本发明单克隆抗体为抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，其具有特异性强、生物结合性高等特点，能准确的检测出斑点叉尾鮰病毒。对比现有技术中存在的单克隆抗体具有明显优势，其一，本发明中单克隆抗体针对的位点为斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白，即为抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，该抗体尚未见报道；其二，与其他病毒或者细胞系的反应中，本发明中单克隆抗体具有较高的特异性，已经报道单克隆抗体未见这方面研究；其三，本发明中单克隆抗体能够应用制备胶体金试纸条，该试纸条具有方便快捷等优势。
2、本发明杂交瘤细胞增殖后可制备大量所需的特异抗体，杂交瘤细胞注射小鼠后，产生的腹水单抗ELISA效价可达到1：1×106。
3、本发明抗原制备简单方便，斑点叉尾鮰病毒与其他病毒相比，免疫原性强，所以采用差速离心方法就可以获得抗原。
4、本发明直接用天然病毒作为抗原，比人工表达蛋白作为抗原具有明显的优势，即保证制备的单克隆抗体确实是针对天然病毒反应，不会因为表达蛋白缺少修饰导致制备抗体与天然病毒不反应。
5、本发明建立的检测斑点叉尾鮰病毒的胶体金试纸条，能够准确的检测出细胞悬液中的病毒存在与否。该检测方法，预防和诊断斑点叉尾鮰病毒病提供了有利的条件。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出单克隆抗体的抗原位点分析：M：蛋白分子量、1：单抗与病毒反应结果、2：单抗与阴性对照细胞反应结果。
图2示出胶体金试纸条判定结果示意图。
图3示出胶体金试纸条检测斑点叉尾鮰病毒结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1抗斑点叉尾鮰病毒单克隆抗体的制备
1.抗原的制备及纯化
采用差速离心纯化的方法对斑点叉尾鮰病毒悬液进行纯化，即将斑点叉尾鮰病毒悬液先经过8000r/min，离心30min；取上清在经过24000r/min，离心5h，沉淀是由200微升0.01mol/LPBS重悬。经过分光光度计测浓度后，用于免疫小鼠。
2.免疫小鼠
免疫用的小鼠为SPF级5周龄雌性BALB/c小鼠。每只小鼠以上述纯化后的斑点叉尾鮰病毒悬液作为抗原进行腹腔注射基础免疫，病毒悬液与弗氏完全佐剂1：1混合，腹腔注射；2周后加强免疫，斑点叉尾鮰病毒(30微克)与弗氏不完全佐剂1：1混合，腹腔注射；之后每隔1周加强免疫1次，腹腔注射，病毒悬液注射120微克/只；第4次免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合。
3.细胞融合
常规的细胞融合技术：取免疫小鼠的脾脏和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合后，加入小鼠的胸腺细胞与融合细胞在HAT培养系中共培养。
所述技术中应用的HAT培养基的配制：将50倍浓缩的HAT(2ml，GIBCO公司)及特级胎牛血清(20ml，杭州四季青生物工程材料有限公司)加入到改良型RPMI1640培养基(80ml，hyclone公司)中混匀。
4.杂交瘤细胞的筛选与克隆
融合后杂交瘤细胞培养10天后，收取细胞培养上清，以差速离心纯化的斑点叉尾鮰病毒作为包被抗原对2000个细胞株用间接ELISA进行检测，筛选出阳性杂交瘤细胞株，经3次有限稀释法克隆获得7株稳定分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为CCV-1A1、CCV-2A3、CCV-2B3、CCV-8B6、CCV-2B7、CCV-3E6、CCV-3F5。
5.腹水的诱生
取6～8周龄雌性Balb/C小鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5ml/只；1周后，腹腔内注射上述阳性杂交瘤细胞；接种杂交瘤细胞后7～10天，见小鼠腹部明显膨大，抽腹水，离心后收集上清，-80℃冻存备用。
采用间接ELISA法对上述制备的7株抗斑点叉尾鮰病毒的腹水进行测定，结果见表1，从表中可以看出CCV-8B6的P/N值和腹水效价分别为11.21和1：1×106，要明显高于其他细胞株CCV-1A1、CCV-2A3、CCV-2B3、CCV-2B7、CCV-3E6、CCV-3F5，因此将该小鼠杂交瘤细胞株进行了保存。该小鼠杂交瘤细胞株CCV-8B6已于2017年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.13843。
表1制备腹水的测定结果
Figure BDA0001323923580000051
Figure BDA0001323923580000061
实施例2抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的特性鉴定
1.单克隆抗体的亚型鉴定
方法：应用美国的SouthernBiotech的分型试剂盒(SBA ClonotypingTMSystem/HRP)，依照其说明书对本发明所述小鼠杂交瘤细胞株CCV-8B6分泌的单克隆抗体的Ig亚型进行鉴定。
结果：本发明所述小鼠杂交瘤细胞株CCV-8B6分泌的单克隆抗体的亚型为IgG3型k链。
2.单克隆抗体的抗原位点分析
免疫印迹法(western blotting)：
以纯化斑点叉尾鮰病毒单克隆抗体为检测组，设正常的斑点叉尾鮰卵巢细胞系细胞裂解物为阴性对照，免疫小鼠血清为阳性对照，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，用电转法将凝胶上的蛋白分别转移到硝酸纤维素膜(NC膜，孔径0.20μm)上，经含质量体积为10％的脱脂奶粉的0.01MPBS溶液中4℃封闭过夜；PBS-T(含体积百分比为0.05％的Tween-20的PBS溶液中)洗涤后，加入小鼠的腹水(单克隆抗体1：1000稀释于PBS)，37℃孵育1h；再次PBS-T(含体积百分比为0.05％的Tween-20的PBS溶液中)洗涤后，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG为二抗，37℃孵育1h；洗涤后，用底物混合液DAB显色观察。
结果见图1，从图中可以看出：本发明小鼠杂交瘤细胞株CCV-8B6分泌的抗斑点叉尾鮰病毒单克隆抗体，能特异的与病毒发生反应，反应处蛋白带分子量为35kDa。经证实其为斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白，说明本发明所述的单克隆抗体为抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体。
3.单克隆抗体的特异性实验
方法：主要采用间接ELISA方法。具体步骤为用用包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值9.6)将差速离心纯化的各个病毒或者细胞抗原(具体见表2)稀释至浓度3μg/ml，包被96孔ELISA酶标板(美国Corning公司)，100μl/孔。用0.01mol/LPBS稀释1％的明胶封闭，每孔150μl，37℃封闭1h。取出后用PBST洗板3次，每次3min，甩干，加入本发明中单克隆抗体(1:1万)，100μl/孔，37℃反应1h。取出后用PBST洗板3次，每次3min，甩干，加入商品化辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1:6万)(sigma)，100μl/孔37℃反应1h。取出后用PBST洗板3次，每次3min，甩干，加入酶的底物反应液，100μl/孔，5min。加入反应终止液，150μl/孔后，酶标仪(Termo)，450nm读数。
其中，相关试剂配制：10×PBST的配制：NaCl：80g，Na2HPO4·12H2O：29g，KH2PO4：2g，KCl：2g，吐温-20：5ml，蒸馏水加至1000ml，4℃保存。
酶的底物反应液：是10％硫酸盐(TMB，sigma，用二甲基甲酰胺配置)：150μl，H2O2：4μl，pH 5.0柠檬酸-磷酸缓冲液：10ml。现用现配。洗涤液为：如前述PBST配制。反应终止液：用蒸馏水配制2mol/LH2SO4。
结果见表2，从表2中可以看出本发明所述的单克隆抗体只能与斑点叉尾鮰病毒反应，说明本发明所述的单克隆抗体具有较强的特异性。
表2单克隆抗体特异性试验结果
样品 P/N值 结果判定
草鱼呼肠孤病毒 1.56 不反应
鲤春血症病毒 1.23 不反应
斑点叉尾鮰病毒 3.78 反应
草鱼性腺细胞系 1.13 不反应
斑点叉尾鮰卵巢细胞系 1.12 不反应
实施例3检测斑点叉尾鮰病毒的胶体金试纸条的组成
检测斑点叉尾鮰病毒的胶体金试纸条，该胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜(硝酸纤维素膜)、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有检测T线和质控C线，所述质控C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体(商品化购买所得)，所述检测T线上包被有第一抗体(即兔抗斑点叉尾鮰病毒的多克隆抗体)；所述金标垫上含有胶体金标记的第二抗体(即保藏编号CGMCC No.13843的杂交瘤细胞株CCV-8B6分泌得到的抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体)。
其中，兔抗斑点叉尾鮰病毒的多克隆抗体的制备和包埋ELISA条板：用纯化的斑点叉尾鮰病毒作为抗原，多点注射免疫新西兰大白兔，分别是每1周免疫一次，共免疫4次；取血清纯化，即采用饱和硫酸铵沉淀方法，沉淀2次，饱和硫酸铵浓度分别为50％和33％，最终的沉淀用PBS溶解，装入透析袋，于4℃下透析72h，期间换液至少4次/天，收集纯化多克隆抗体，即兔抗斑点叉尾鮰病毒的多克隆抗体，分装-80℃保存保存备用。
胶体金的制备方法包括：将0.01重量％的HAuCl4溶液加热煮沸后加入1重量％的柠檬酸三钠溶液直至溶液的颜色完全变为透明的红色时，继续回流10min后停止加热，冷却至室温，即得到胶体金。
将单克隆抗体进行胶体金标记的方法包括：取1ml制取好的胶体金，用1重量％的K2CO3调节pH值到8.0，加入8μg单克隆抗体，混合均匀，室温反应40min；加入5重量％的BSA至终浓度为0.1重量％，静置30min；先用低速(1500r/min)离心15分钟，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀；然后用10000r/min离心30分钟；仔细吸出上清，沉淀物用0.1ml含1％BSA的0.1M PBS(pH7.4)复溶，加入5％叠氮钠至终浓度为0.05％，4℃保存。
制备胶体金试纸条的方法：用喷金点膜机将兔抗斑点叉尾鮰病毒的多克隆抗体和羊抗鼠IgG喷于基膜上，形成相互平行的检测T线和质控C线，烘干；将胶体金标记的抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体用喷金点膜机均匀的喷在金标垫上；然后将样品垫、金标垫、喷有T线和C线的基膜和吸水垫依次连接组装，而后裁切包装备用。
实施例4检测斑点叉尾鮰病毒的胶体金试纸条的使用
本实施例用于说明本发明检测斑点叉尾鮰病毒的胶体金试纸条(即实施例3)检测斑点叉尾鮰病毒。
具体步骤为：
(1)样品制备：分别取约200μl斑点叉尾鮰病毒悬液和鱼类细胞系悬液到样品管中。
(2)检测：取出实施例3制备得到的胶体金试纸条，室温平衡20分钟，打开包装取出试纸条，将试纸条按照箭头方向插入样品管中，静置10-15分钟，判定结果。
(3)结果判定：当时纸条出现肉眼可见的紫红色质控C线，没有出现肉眼可见的紫红色检测T线，判为阴性；当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控C线，同时出现肉眼可见的紫红色检测T线，判为阳性；检测线颜色深度与待检抗原量成正比，颜色越深说明待检抗原含量越高，质控线无条带则判为试纸条失效。判定结果示意图见图2。检测结果见图3，从图中可以看出本发明所述的胶体金试纸条能准确的检测出斑点叉尾鮰病毒。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (6)

1.一种抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.13843的小鼠杂交瘤细胞株分泌产生。
2.分泌产生抗斑点叉尾鮰病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.13843。
3.一种检测斑点叉尾鮰病毒的胶体金试纸条，其特征在于：所述胶体金试纸条包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有兔抗斑点叉尾鮰病毒的多克隆抗体；所述金标垫上含有胶体金标记的权利要求1所述的单克隆抗体。
4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测斑点叉尾鮰病毒的试剂或试剂盒中的应用。
5.权利要求2所述的杂交瘤细胞株在制备检测斑点叉尾鮰病毒的试剂或试剂盒中的应用。
6.权利要求3所述的胶体金试纸条在制备检测斑点叉尾鮰病毒的试剂或试剂盒中的应用。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111733141B (zh) * 2020-06-19 2022-02-18 清华大学深圳国际研究生院 一种可分泌抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703609A (zh) * 2012-07-04 2012-10-03 中国水产科学研究院黄海水产研究所 斑点叉尾鮰病毒现场快速检测试剂盒及检测方法
CN103757133A (zh) * 2014-01-01 2014-04-30 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 一种水生动物dna病毒检测的基因芯片试剂盒及其制备方法和应用
CN103773895A (zh) * 2014-01-13 2014-05-07 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 一种同时检测水生动物五种dna病毒的多重荧光pcr试剂盒
CN104710516A (zh) * 2015-01-04 2015-06-17 华中农业大学 抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白orf46的单克隆抗体及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105021830B (zh) * 2015-07-30 2017-03-15 中国检验检疫科学研究院 一种人乳铁蛋白双抗夹心胶体金检测试纸条

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703609A (zh) * 2012-07-04 2012-10-03 中国水产科学研究院黄海水产研究所 斑点叉尾鮰病毒现场快速检测试剂盒及检测方法
CN103757133A (zh) * 2014-01-01 2014-04-30 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 一种水生动物dna病毒检测的基因芯片试剂盒及其制备方法和应用
CN103773895A (zh) * 2014-01-13 2014-05-07 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 一种同时检测水生动物五种dna病毒的多重荧光pcr试剂盒
CN104710516A (zh) * 2015-01-04 2015-06-17 华中农业大学 抗斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白orf46的单克隆抗体及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白基因ORF6 和ORF10 的原核表达及抗体制备;王树云;《华中农业大学学报》;20101231;第29卷(第6期);第764-767页 *
斑点叉尾鮰病毒多克隆抗体的制备及其生物活性鉴定;吴兵;《华中农业大学学报》;20111031;第30卷(第５期);第631-634页 *

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