CN104673933A - 新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及试剂盒 - Google Patents

新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及试剂盒。目的是提供的方法及检测试剂盒应具有特异性好、检测灵敏度高、稳定、准确、检测效率高、操作快速简便等特点。技术方案是：一种新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，试剂盒中的RT-LAMP反应液包括以下组分：特异性扩增引物、脱氧核糖核苷三磷酸、甜菜碱、缓冲液、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、吐温-20、DNA聚合酶、逆转录酶、SYBR Green I蜡微晶颗粒、无RNA酶的水。一种新型布尼亚病毒非诊断目的的环介导逆转录等温扩增检测方法，按以下步骤进行：(1)提取待测样品RNA；(2)配制成一步法环介导逆转录等温扩增检测体系(3)判断结果。

Description

新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及检测试剂盒，尤其是一种新型布尼亚病毒的核酸环介导逆转录等温扩增检测方法及检测试剂盒，可应用于新型布尼亚病毒的实验室快速检测。
背景技术
由新型布尼亚病毒感染人体引起的发热伴血小板减少综合征，是一种以发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损伤为主要临床表现的新发传染病。新型布尼亚病毒感染后可迅速引起患者肝、肾功能受损，使患者因弥漫性血管内凝血、休克、呼吸衰竭而死亡，死亡率高达30％。流行病学研究显示新型布尼亚病毒分布极为广泛：自2010年我国首次对新型布尼亚病毒进行成功分离鉴定以来，目前已在山东、湖北、浙江、江苏等多个省市发现新型布尼亚病毒感染病例。2011-2013年，美国密苏里州、日本、韩国也相继报道发现有经蜱虫叮咬传播的类似新型布尼亚病毒感染病例。蜱传新型布尼亚病毒感染已逐渐成为全球性的重要公共卫生问题。
被新型布尼亚病毒感染者往往急性起病且死亡率高，但目前对新型布尼亚病毒感染的治疗还是以对症支持治疗为主。临床治疗主要通过使用广谱强效抗病毒药物，同时依靠患者自身免疫状态的提升，以达到抵抗新型布尼亚病毒感染的效果。值得关注的是，新型布尼亚病毒感染的及时检测诊断，对于疾病的治疗具有重要意义，可以显著提高治疗效果。新型布尼亚病毒感染往往发生在山区丘陵地区，通过新型布尼亚病毒快速检测技术来加强对野外生存环境中该病毒的检测，可以为新型布尼亚病毒感染的防制提供重要依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型布尼亚病毒的环介导逆转录等温扩增检测方法及检测试剂盒，该方法及检测试剂盒应具有特异性好、检测灵敏度高、稳定、准确、检测效率高、操作快速简便等特点。
本发明采用的技术方案是：
一种新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的RT-LAMP反应液包括以下组分：
特异性扩增引物、脱氧核糖核苷三磷酸、甜菜碱、缓冲液、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、吐温-20、DNA聚合酶、逆转录酶、SYBR Green I蜡微晶颗粒、无RNA酶的水；
所述特异性扩增引物序列如下：
F3：5’-GGCCGAGAGACACTGACAT-3’
B3：5’-CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3’
FIP：5’-TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3’
BIP：5’-ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3’。
新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒中各组分的相应含量如下：
所述染料为SYBR Green I蜡微晶颗粒。
所述缓冲液为Tris-HCl。
一种新型布尼亚病毒非诊断目的的环介导逆转录等温扩增检测方法，按以下步骤进行：
(1)提取待测样品RNA；
(2)以待测样品RNA为模板，与下列物质混合配制成一步法环介导逆转录等温扩增检测体系：特异性引物、缓冲液、甜菜碱、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、吐温-20、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、逆转录酶、SYBR Green I蜡微晶颗粒；
所述特异性引物序列如下：
F3：5’-GGCCGAGAGACACTGACAT-3’
B3：5’-CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3’
FIP：5’-TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3’
BIP：5’-ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3’；
(3)新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测结果的阴阳性可以用肉眼判断；如果反应后混合物由橘黄色变为绿色，则判断为阳性，即待测样品含有新型布尼亚病毒核酸；如果反应后混合物保持橘黄色不变，则判断为阴性。
所述步骤(2)中环介导逆转录等温扩增检测体系中各成分的终浓度如下：
其余是作为溶剂的RNase free dH2O(无RNA酶的水)；
新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测体系总体积为25μL。
所述步骤(2)中环介导逆转录等温扩增检测条件如下：65℃60min，95℃2min。
本发明的有益效果是：所提供的环介导逆转录等温扩增检测方法对新型布尼亚病毒的检测具有良好的特异性和稳定性；检测新型布尼亚病毒的准确率高，扩增体系的最低检测限可达10fg新型布尼亚病毒RNA；并且检测方法操作简单，所需时间短，且无需特殊仪器，可以用肉眼观察检测结果。本发明的环介导逆转录等温扩增检测方法可有效用于新型布尼亚病毒感染早期的快速检测、野外偏远地区新型布尼亚病毒快速检测及环境生物媒介的病原携带情况调查等。
附图说明
图1是新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测结果示意图。A表示本扩增体系的阳性检测结果；B表示本扩增体系的阴性检测结果。
图2是新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测灵敏度评价结果示意图。1-9分别表示采用本扩增体系对10ng到0.1fg不同稀释梯度新型布尼亚病毒RNA 进行扩增后的凝胶电泳检测结果，M表示核酸长度参照，NC表示阴性对照。
图3是新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测特异性评价结果示意图。1-7表示该检测体系对7株不同新型布尼亚病毒扩增后的凝胶电泳检测结果；8-10表示该检测体系对基孔肯雅热病毒、肾综合征出血热病毒、登革热病毒扩增后的凝胶电泳检测结果。M表示核酸长度参照，NC表示阴性对照。
图4是新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增临床样本检测结果示意图。图中1-32分别表示采用本扩增体系对不同临床样本的扩增检测结果；+表示阳性检测结果；-表示阴性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
布尼亚科病毒科包括布尼亚病毒属、汉坦病毒属、内罗华病毒属、白蛉热病毒属和番茄斑萎病毒属。布尼亚科病毒的粒子通常为具有包膜的球形，单个病毒粒子包裹有大(L)、中(M)、小(S)3种负义或双义线形ssRNA，编码4种结构蛋白，包括两种外源糖蛋白(Gn Gc)、一种外壳蛋白(N)和一种超大的多聚酶(L)。经全基因组测序及生物信息学比对分析，我们发现新型布尼亚病毒属于白蛉热病毒属。新型布尼亚病毒株基因组序列的公布，为新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的建立提供了重要的支持。我们针对新型布尼亚病毒的不同基因组片段设计了环介导逆转录等温扩增引物，采用环介导逆转录等温扩增体系对不同引物的扩增效果进行评价，最终确定针对新型布尼亚病毒L基因组片段的引物为最佳新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增引物。通过将本发明的新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法应用于不同新型布尼亚病毒样本的检测，该方法被证实可有效用于新型布尼亚病毒的快速鉴定。
实施过程： 
1材料与方法 
1.1病毒株与临床标本：
新型布尼亚病毒毒株为浙江省疾病预防控制中心分离株，其L片段基因组序列由序列表中的第5序列所示。临床样本来源于浙江省新型布尼亚病毒感染疑似病例的血清，样本采集后带冰运送到实验室。
1.2引物
从美国的NCBI基因库上下载新型布尼亚病毒毒株基因组序列。通过对其进行同源性比较，在新型布尼亚病毒基因组L基因区设计新型布尼亚病毒特异性引物，序列如下(序列表中的第1至第4序列)：
F3：5’-GGCCGAGAGACACTGACAT-3’
B3：5’-CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3’
FIP：5’-TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3’
BIP：5’-ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3’
本发明使用的引物委托上海英骏生物科技有限公司合成。
1.3病毒RNA的提取与定量：
以浙江省疾病预防控制中心提供的新型布尼亚病毒毒株(确诊患者标本分离的新型布尼亚病毒)为标准毒株，采用德国QIAGEN公司的Reansy Mini Kit试剂盒提取病毒RNA，按试剂盒说明书所述方法提取病毒RNA，经RNA浓度检测仪测定浓度后作为模板RNA备用。
1.4新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增体系和条件优化：
新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增体系总体积为25μl，其中各成分的终浓度如下：缓冲液(Tris-HCl)20mmol/L，脱氧核糖核苷三磷酸1.4mmol/L，甜 菜碱0.8mmol/L，氯化钾10mmol/L，硫酸铵10mmol/L，硫酸镁8mol/L，引物FIP和BIP 1.6μmol/L，引物F3和B30.2μmol/L，SYBR Green I蜡微晶颗粒1μL/反应体系，吐温-201μL/反应体系，DNA聚合酶8U/反应体系，逆转录酶0.5U/反应体系，模板RNA 2μL/反应体系。反应温度分别为60℃,61℃,62℃,63℃,64℃,65℃；作用时间分别为30min，40min，60min，70min；最后95℃作用2min。
其中的SYBR Green I蜡微晶颗粒染料外购获得或者自行制备；通常每个蜡微晶颗粒含1ul SYBR Green I染料。
结果判断：新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测结果的阴阳性可以用肉眼判断。由于SYBR Green I蜡微晶颗粒染料的原始颜色为橘黄色，SYBR Green I与阳性扩增产物双链DNA结合后可变为绿色。如果反应后混合物由橘黄色变为绿色，则判断为阳性，即待测样品含有新型布尼亚病毒；如果反应后混合物保持橘黄色不变，则判断为阴性。
1.5新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法效果评价
选择新型布尼亚病毒毒株和浙江省新型布尼亚病毒感染疫情确诊患者的急性期血清为临床样本，对上述病毒株和样本分别提取RNA，用新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法进行检测。以不同浓度新型布尼亚病毒RNA为模板进行环介导逆转录等温扩增检测，确定该检测方法的灵敏度。同时，以基孔肯雅热病毒、肾综合征出血热病毒、登革热病毒RNA为模板，评价新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的特异性。以新型布尼亚病毒感染临床样本RNA为模板进行环介导逆转录等温扩增检测，进行临床样本检测效果评价。
2结果
2.1新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测体系及条件
新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增体系总体积为25μl，其中各成分的终 浓度如下：缓冲液(Tris-HCl)20mmol/L，脱氧核糖核苷三磷酸1.4mmol/L，甜菜碱0.8mmol/L，氯化钾10mmol/L，硫酸铵10mmol/L，硫酸镁8mol/L，引物FIP和BIP 1.6μmol/L，引物F3和B30.2μmol/L，SYBR Green I蜡微晶颗粒1μL/反应体系，吐温-201μL/反应体系，DNA聚合酶8U/反应体系，逆转录酶0.5U/反应体系，模板RNA 2μL/反应体系。反应条件为65℃60min，95℃2min，可获得最佳检测效果(见图1)。
2.2敏感性试验 
采用新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法对不同浓度新型布尼亚病毒RNA进行检测。结果表明该新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增体系最低可检测10fg新型布尼亚病毒RNA(见图2)。
2.3特异性试验 
本发明建立的新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法对新型布尼亚病毒具有良好的特异性，对确诊的新型布尼亚病毒感染患者的急性期血清进行检测显示阳性反应，而与其它能引起相似临床症状的病毒(基孔肯雅热病毒、肾综合征出血热病毒、登革热病毒)均无交叉反应(见图3)。
2.4重复性试验 
采用新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法对不同浓度新型布尼亚病毒RNA进行重复检测，反应体系如1.4中所述，检测结果证实本发明的新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法具有良好的重复性。
2.5临床样本的检测
从32份新型布尼亚病毒感染疑似患者的血清样本中直接提取病毒RNA，用本发明的新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法检测新型布尼亚病毒。结果表明本发明方法检出新型布尼亚病毒阳性样本18份。通过与新型布尼亚病毒荧光RT-PCR方法进行检测比较，结果发现两种检测方法的一致性达94.4％；图4显 示的是临床样本的新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测结果。
相应的，本发明提供了新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，其中包括的组分及相应含量如下：
实施例1：
一种新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，包括的组分及相应含量为:
实施例2：
一种新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，包括的组分及相应含量为:
实施例3：
一种新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，包括的组分及相应含量为:

Claims (7)

1.一种新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的RT-LAMP反应液包括以下组分：
特异性扩增引物、脱氧核糖核苷三磷酸、甜菜碱、缓冲液、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、吐温-20、DNA聚合酶、逆转录酶、SYBR Green I蜡微晶颗粒、无RNA酶的水；
所述特异性扩增引物序列如下：
F3：5’-GGCCGAGAGACACTGACAT-3’
B3：5’-CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3’
FIP：5’-TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3’
BIP：5’-ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3’。
2.根据权利要求1所述新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，其特征在于新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒中各组分的相应含量如下：
3.根据权利要求1或2所述新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述染料为SYBR Green I蜡微晶颗粒。
4.根据权利要求3所述新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述缓冲液为Tris-HCl。
5.一种新型布尼亚病毒非诊断目的的环介导逆转录等温扩增检测方法，按以下步骤进行：
(1)提取待测样品RNA；
(2)以待测样品RNA为模板，与下列物质混合配制成一步法环介导逆转录等温扩增检测体系：特异性引物、缓冲液、甜菜碱、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、吐温-20、脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶、逆转录酶、SYBR Green I蜡微晶颗粒；
所述特异性引物序列如下：
F3：5’-GGCCGAGAGACACTGACAT-3’
B3：5’-CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3’
FIP：5’-TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3’
BIP：5’-ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3’；
(3)新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测结果的阴阳性可以用肉眼判断；如果反应后混合物由橘黄色变为绿色，则判断为阳性，即待测样品含有新型布尼亚病毒核酸；如果反应后混合物保持橘黄色不变，则判断为阴性。
6.根据权利要求5所述新型布尼亚病毒非诊断目的的环介导逆转录等温扩增检测方法，其特征在于所述步骤(2)中环介导逆转录等温扩增检测体系中各成分的终浓度如下：
其余是作为溶剂的无RNA酶的水；
新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测体系总体积为25μL。
7.根据权利要求6所述新型布尼亚病毒非诊断目的的环介导逆转录等温扩增检测方法，其特征在于所述步骤(2)中环介导逆转录等温扩增检测条件如下：65℃60min，95℃2min。
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