CN109971751A - 防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，包括：步骤一、向干燥的山银花叶片加入PVP和维生素C研磨成细粉；步骤二、向细粉加入CTAB提取缓冲液和β‑巯基乙醇的混合液混合，然后水浴加热，得悬浮液；步骤三、冷却至室温，加入氯仿和异戊醇混合溶剂混合均匀，离心，取上清液；步骤四、向上清液加入异丙醇，混合均匀得待提液；步骤五、将待提液转移至DNA提取试剂盒的离心柱中，离心，弃废液；步骤六、向离心柱加入乙醇，离心，弃废液，将离心柱晾干至无乙醇；步骤七、向离心柱加入TE缓冲液，离心，收集收集管中的溶液，即为山银花叶片DNA溶液。本发明具有防止山银花叶处茸毛堵塞离心柱的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及DNA提取领域。更具体地说，本发明涉及一种防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法。
背景技术
山银花属忍冬科忍冬属植物(Lonicera L.)，产于我国南方各地，是一种大量应用中药材，具清热解毒、疏散风热的功效，用于痈肿疗疮、风热感冒、温热发病等。《中华人民共和国药典》规定山银花的来源为忍冬科植物灰毡毛忍冬L.macranthoides Hand.-Mazz.、红腺忍冬L.hypoglauca Miq.、华南忍冬L.confuse DC.或黄褐毛忍冬L.fulvotomentosa Hsuet S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花。现代药理研究表明，山银花含有绿原酸(chlorogenic acid)、异绿原酸(isochlorogenic acid)、咖啡酸(caffeic acid)等成分，具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤及解热抗炎、利胆、保肝、抗溃疡等多种生物活性。近年来，分子标记技术在忍冬属植物的遗传多样性、品种鉴定、分类等方面得到了广泛运用，DNA分子生物学研究已成为近年来生物学领域的研究热点和方向，这些研究多数都是以幼叶为材料提取基因组DNA，材料中的酚类、多糖等次生物质给山银花核酸的提取增加了一定的难度，山银花的材料多覆盖茸毛，尤其是嫩叶，而通常嫩叶又是提取核酸的最佳材料，这是核酸提取的一大障碍。前人的改良CTAB法一定程度上提高了DNA提取的得率，但是无法满足目前高通量核酸提取的要求，因此，离心柱型的植物基因组DNA提取试剂盒得到广泛的应用，但目前针对酚类多糖，尤其是覆盖毛被的植物材料来说，试剂盒无法满足这种高通量和高质量的DNA提取要求，影响了分子生物学的后续研究，为了解决这些问题，本研究针对试剂盒法进行改良，得出一种快捷、高得率、高质量的山银花基因组DNA提取方法，为开展山银花分子生物学研究提供了技术基础。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，可以去除山银花叶片的茸毛，以防止茸毛堵塞离心柱孔，再采用离心柱方法提取DNA，从而减少提取时间。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，包括：
步骤一、向干燥的山银花叶片加入PVP和维生素C，研磨成细粉；
步骤二、向细粉中加入CTAB提取缓冲液和β-巯基乙醇的混合液，混合至细粉完全悬浮，然后于65℃水浴加热30～45min，在水浴加热期间摇匀，得悬浮液；
其中，CTAB提取缓冲液与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.02～0.04g，混合液为体积分数为2％的β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液，悬浮液与PVP的体积质量比为100mL:1g，悬浮液与维生素C的体积质量比为100mL:1g；
步骤三、悬浮液冷却至室温，加入氯仿和异戊醇混合溶剂混合均匀，离心，取上清液；
步骤四、向步骤三中的上清液加入异丙醇，混合均匀得待提液；
步骤五、将步骤四中的待提液转移至DNA提取试剂盒的离心柱中，离心，弃掉收集管中的废液；
步骤六、向离心柱内的物质中加入乙醇，离心，弃掉收集管中的废液，将离心柱晾干至无乙醇；
步骤七、向离心柱内的物质中加入TE缓冲液，离心，收集收集管中的溶液，即为山银花叶片DNA溶液。
优选的是，步骤一中干燥的山银花叶片是采用变色硅胶干燥。
优选的是，步骤二中研磨的方法具体为：置于液氮中冷却1～2min，然后置于冷冻研磨仪以30Hz/s研磨30～40s，再置于液氮中冷却1min，然后置于冷冻研磨仪以30Hz/s研磨30s；
混合液在加入至步骤一中的细粉之前，提前预热至65℃。
优选的是，步骤二中的CTAB提取缓冲液采用改良CTAB提取缓冲液代替，改良CTAB提取缓冲液的制备方法为：
将pH值为8.0的CTAB，NaCl，Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0的EDTA标准溶液，加入容量瓶，混匀，用超纯水定容至改良CTAB提取缓冲液的终体积，灭菌即得改良CTAB提取缓冲液，其中，CTAB、NaCl、Tris-HCl缓冲液、EDTA标准溶液、改良CTAB提取缓冲液的终体积的质量体积比为1.5g:4.091g:5mL:20mL:50mL。
优选的是，步骤三中的氯仿和异戊醇的体积比为24:1，离心速度为10000～13000rpm，离心时间5～6min，混合溶剂与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.02～0.04g。
优选的是，步骤四中的异丙醇与上清液的体积比为1:1，异丙醇的温度为-20℃。
优选的是，步骤五中进行两次离心，第一次离心弃掉收集管中的废液后，进行第二次离心，并弃掉收集管中的废液，两次离心的速度均为10000～11000rpm，离心时间均为30s。
优选的是，步骤六的具体方法为：向离心管中加入质量分数为70％的乙醇，于10000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，再次向离心管中加入质量分数为75％的乙醇，于10000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，其中，质量分数为70％的乙醇、质量分数为75％的乙醇、山银花叶片的体积质量比为500μL:500μL:0.02～0.04g。
优选的是，步骤七中的离心速度为10000～13000rpm，离心时间为2～5min，TE缓冲液与山银花叶片的体积质量比为100μL:0.02～0.04g。
本发明至少包括以下有益效果：采用PVP和维生素C相结合的方法，可以有效去除山银花叶片的茸毛，在上离心柱离心处理前已随裂解液分离出，以防止其堵塞过滤膜的膜孔，有利于DNA被TE缓冲液洗脱下来，提高DNA的得率。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的4种山银花叶片的核基因的ITS序列电泳图；
图2为本发明的4种山银花叶片的叶绿体基因的psbA-trnH电泳图；
图3为本发明的4种山银花叶片的叶绿体基因的rbcL序列电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
山银花叶片DNA提取方法，包括：
步骤一、向干燥的山银花叶片加入PVP和维生素C，研磨成细粉；
步骤二、向细粉中加入CTAB提取缓冲液和β-巯基乙醇的混合液，混合至细粉完全悬浮，然后于65℃水浴加热30min，在水浴加热期间摇匀，得悬浮液；
其中，CTAB提取缓冲液与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.02g，混合液为体积分数为2％的β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液，悬浮液与PVP的体积质量比为100mL:1g，悬浮液与维生素C的体积质量比为100mL:1g；
步骤三、悬浮液冷却至室温，加入氯仿和异戊醇混合溶剂混合均匀，离心，取上清液；其中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，离心速度为10000rpm，离心时间5min，混合溶剂与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.02g。
步骤四、向步骤三中的上清液加入异丙醇，混合均匀得待提液；其中，异丙醇与上清液的体积比为1:1，异丙醇的温度为-20℃。
步骤五、将步骤四中的待提液转移至DNA提取试剂盒的离心柱中，离心，弃掉收集管中的废液；其中，离心的速度均为10000rpm，离心时间均为30s。
步骤六、向离心柱内的物质中加入乙醇水溶液，离心，弃掉收集管中的废液，将离心柱晾干至无乙醇；其中，乙醇水溶液的质量分数为70％，乙醇水溶液与山银花叶片的体积质量比为500μL:0.02g。
步骤七、向离心柱内的物质中加入TE缓冲液，离心，收集收集管中的溶液，即为山银花叶片DNA溶液，其中，离心速度为10000rpm，离心时间为2min，TE缓冲液与山银花叶片的体积质量比为100μL:0.02g。
<实施例2>
山银花叶片DNA提取方法，包括：
步骤一、向干燥的山银花叶片加入PVP和维生素C，研磨成细粉；
步骤二、向细粉中加入CTAB提取缓冲液和β-巯基乙醇的混合液，混合至细粉完全悬浮，然后于65℃水浴加热45min，在水浴加热期间摇匀，得悬浮液；
其中，CTAB提取缓冲液与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.04g，混合液为体积分数为2％的β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液，悬浮液与PVP的体积质量比为100mL:1g，悬浮液与维生素C的体积质量比为100mL:1g；
步骤三、悬浮液冷却至室温，加入氯仿和异戊醇混合溶剂混合均匀，离心，取上清液；其中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，离心速度为13000rpm，离心时间6min，混合溶剂与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.04g。
步骤四、向步骤三中的上清液加入异丙醇，混合均匀得待提液；其中，异丙醇与上清液的体积比为1:1，异丙醇的温度为-20℃。
步骤五、将步骤四中的待提液转移至DNA提取试剂盒的离心柱中，离心，弃掉收集管中的废液；其中，离心的速度均为11000rpm，离心时间均为30s。
步骤六、向离心柱内的物质中加入乙醇水溶液，离心，弃掉收集管中的废液，将离心柱晾干至无乙醇；其中，乙醇水溶液的质量分数为70％，乙醇水溶液与山银花叶片的体积质量比为500μL:0.04g。
步骤七、向离心柱内的物质中加入TE缓冲液，离心，收集收集管中的溶液，即为山银花叶片DNA溶液，其中，离心速度为13000rpm，离心时间为5min，TE缓冲液与山银花叶片的体积质量比为100μL:0.04g。
<实施例3>
山银花叶片DNA提取方法，包括：
步骤一、向干燥的山银花叶片加入PVP和维生素C，研磨成细粉；
步骤二、向细粉中加入CTAB提取缓冲液和β-巯基乙醇的混合液，混合至细粉完全悬浮，然后于65℃水浴加热45min，在水浴加热期间摇匀，得悬浮液；
其中，CTAB提取缓冲液与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.03g，混合液为体积分数为2％的β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液，悬浮液与PVP的体积质量比为100mL:1g，悬浮液与维生素C的体积质量比为100mL:1g；
步骤三、悬浮液冷却至室温，加入氯仿和异戊醇混合溶剂混合均匀，离心，取上清液；其中，氯仿和异戊醇的体积比为24:1，离心速度为12000rpm，离心时间5.5min，混合溶剂与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.03g。
步骤四、向步骤三中的上清液加入异丙醇，混合均匀得待提液；其中，异丙醇与上清液的体积比为1:1，异丙醇的温度为-20℃。
步骤五、将步骤四中的待提液转移至DNA提取试剂盒的离心柱中，离心，弃掉收集管中的废液；其中，离心的速度均为10000rpm，离心时间均为30s。
步骤六、向离心柱内的物质中加入乙醇水溶液，离心，弃掉收集管中的废液，将离心柱晾干至无乙醇；其中，乙醇水溶液的质量分数为70％，乙醇水溶液与山银花叶片的体积质量比为500μL:0.03g。
步骤七、向离心柱内的物质中加入TE缓冲液，离心，收集收集管中的溶液，即为山银花叶片DNA溶液，其中，离心速度为12000rpm，离心时间为3.5min，TE缓冲液与山银花叶片的体积质量比为100μL:0.03g。
<实施例4>
山银花叶片DNA提取方法同实施例1，其中不同的是：
步骤一中干燥的山银花叶片是采用变色硅胶干燥；
步骤二中研磨的方法具体为：置于液氮中冷却1.5min，然后置于冷冻研磨仪以30Hz/s研磨35s，再置于液氮中冷却1min，然后置于冷冻研磨仪以30Hz/s研磨30s；
混合液在加入至步骤一中的细粉之前，提前预热至65℃；
步骤二中的CTAB提取缓冲液采用改良CTAB提取缓冲液代替，改良CTAB提取缓冲液的制备方法为：
将pH值为8.0的CTAB，NaCl，Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0的EDTA标准溶液，加入容量瓶，混匀，用超纯水定容至改良CTAB提取缓冲液的终体积，灭菌即得改良CTAB提取缓冲液，其中，CTAB、NaCl、Tris-HCl缓冲液、EDTA标准溶液、改良CTAB提取缓冲液的终体积的质量体积比为1.5g:4.091g:5mL:20mL:50mL。
步骤五中进行两次离心，第一次离心弃掉收集管中的废液后，进行第二次离心，并弃掉收集管中的废液，两次离心的速度均为11000rpm，离心时间均为30s。
步骤六的具体方法为：向离心管中加入质量分数为70％的乙醇，于10000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，再次向离心管中加入质量分数为75％的乙醇，于10000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，其中，质量分数为70％的乙醇、质量分数为75％的乙醇、山银花叶片的体积质量比为500μL:500μL:0.02g。
<实施例5>
山银花叶片DNA提取方法同实施例3，其中不同的是：步骤二中研磨的方法具体为：置于液氮中冷却1.5min，然后置于冷冻研磨仪以30Hz/s研磨35s，再置于液氮中冷却1min，然后置于冷冻研磨仪以30Hz/s研磨30s。
<实施例6>
山银花叶片DNA提取方法同实施例3，其中不同的是：步骤五中进行两次离心，第一次离心弃掉收集管中的废液后，进行第二次离心，并弃掉收集管中的废液，两次离心的速度均为10000rpm，离心时间均为30s。
<实施例7>
山银花叶片DNA提取方法同实施例3，其中不同的是：步骤六的具体方法为：向离心管中加入质量分数为70％的乙醇，于10000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，再次向离心管中加入质量分数为75％的乙醇，于10000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，其中，质量分数为70％的乙醇、质量分数为75％的乙醇、山银花叶片的体积质量比为500μL:500μL:0.02g。
<实施例8>
山银花叶片DNA提取方法同实施例3，其中不同的是：步骤二中的CTAB提取缓冲液采用改良CTAB提取缓冲液代替，改良CTAB提取缓冲液的制备方法为：
将pH值为8.0的CTAB，NaCl，Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0的EDTA标准溶液，加入容量瓶，混匀，用超纯水定容至改良CTAB提取缓冲液的终体积，灭菌即得改良CTAB提取缓冲液，其中，CTAB、NaCl、Tris-HCl缓冲液、EDTA标准溶液、改良CTAB提取缓冲液的终体积的质量体积比为1.5g:4.091g:5mL:20mL:50mL。
且65℃水浴加热的时间为20min。
<对比例1>
山银花叶片DNA提取方法同实施例3，其中不同的是：步骤一中未加入维生素C。
<对比例2>
山银花叶片DNA提取方法同实施例3，其中不同的是：步骤一中未加入PVP。
<山银花叶片DNA提取方法评价试验>
1、茸毛检测
采用实施例3和对比例1、对比例2的方法提取山银花叶片DNA，实施例3的DNA得率均高于对比例1和对比例3的DNA得率，检查实施例3、对比例1、对比例2的步骤七结束后的离心柱，对比例1和对比例2的离心柱上的过滤薄膜上附有肉眼可见污垢，而实施例3的离心柱上的过滤薄膜干净无污垢，说明实施例3中采用PVP和维生素C相结合的方法，可以有效去除山银花叶片的茸毛，在上离心柱离心处理前已随裂解液分离出，以防止其堵塞过滤膜的膜孔，有利于DNA被TE缓冲液洗脱下来，提高DNA的得率。
表1
| 组别 | 浓度(ng/μL) |
| 对比例1 | 95.1 |
| 对比例2 | 100.5 |
| 实施例3 | 155.4 |
由上表可知，实施例3中的DNA浓度显著高于对比例1和对比例2中的DNA浓度，进一步说明PVP和维生C相结合的方法可以有效去除茸毛，防止堵塞离心柱，使得DNA顺利的从离心柱上洗脱下来。
2、DNA纯度与浓度检测
检测实施例1～8提取的DNA纯度和浓度来检验DNA的质量，用KAIAO K5500超微量分光光度计检测，以A260/A280的比值来评估DNA样品的纯度，结果表2所示：
表2
| 组别 | A<sub>260</sub>/A<sub>280</sub> | 浓度(ng/μL) |
| 实施例1 | 1.829 | 145.6 |
| 实施例2 | 1.815 | 141.5 |
| 实施例3 | 1.865 | 155.4 |
| 实施例4 | 1.802 | 155.1 |
| 实施例6 | 1.712 | 145.4 |
| 实施例7 | 1.987 | 152.3 |
实施例1～8提取的DNA均能满足一般分子生物学研究如PCR、RAPD、AFLP实验的要求。
根据PH7～8.5下DNA在260nm处有吸收高峰，蛋白质在280nm处有吸收高峰，采用A260/A280的比值来评估DNA样品的纯度，若DNA保存液中A260/A280的比值约介于1.8～2.0之间，则表示DNA提取液的纯度高，杂质低。由上表可知，实施例6、实施例7与实施例3比较可知，虽然实施例3中A260/A280的比值为1.865，但其是由于实施例3中的DNA中还含有少量的蛋白质和RNA而形成的比值为1.8左右，由实施例6与实施例3比较可知，步骤五中进行两次离心的方法可以去除RNA，由实施例7与实施例3比较可知，步骤六中分两次乙醇溶液沉淀法，可以有效去除蛋白质。
3、PCR检测
采用实施例4的方法对4种山银花(编号1为灰毡毛忍冬，编号2为红腺忍冬，编号3为华南忍冬，编号4为黄褐毛忍冬)提取DNA，将提取的DNA分别进行PCR扩增，选择核基因(ITS),叶绿体DNA片段(matK、psbA-trnH、rbcL)作为试验，得出图1～3电泳图。
PCR反应采用25μL反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，正、反向引物(2.5μmol/L)各1.5μL，模板DNA0.5μL，加灭菌双蒸水至25μL；
扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S(进行30个循环)；72℃延伸10min，4℃保存。
PCR产物取2.5μL，1％琼脂糖凝胶电泳，电压110V，15min，染色，在成像系统中拍照，检测DNA质量。如图：
图1～3为4种山银花DNA提取物序列PCR扩增电泳图：图1为核基因的ITS序列，图2、图3分别叶绿体基因的psbA-trnH和rbcL序列，M为DL2000Marker，编号1为灰毡毛忍冬，编号2为红腺忍冬，编号3为华南忍冬，编号4为黄褐毛忍冬。
以上三组DNA纯度检测结果和电泳图可知，在0.02g的样品起始量下，叶片材料经过本发明方法提取DNA，最终得到100μL的DNA保存液，取0.5μLDNA为模板，三对引物进行PCR扩增实验，得出三组图的PCR条带均单一、清晰、明亮，进一步验证了实施例4的方法提取的DNA纯度高，得率高。
4、研磨速度
采用实施例5的方法与实施例3的方法比较，在研磨时间相同的情况下，实施例3的细粉粒度大于实施例5的细粉粒度。在研磨至相同的细粉粒度的情况下，实施例3所需要的研磨时间大于实施例5的研磨时间。
5、裂解时间
实施例8与实施例3比较可知，实施例8中水浴加热的时间为20min，实施例3水浴加热45min，加入CTAB提取缓冲液或改良CTAB提取缓冲液的目的是对原料进行裂解，实施例8的方法可以有效缩短裂解时间。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (9)
1.防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，包括：
步骤一、向干燥的山银花叶片加入PVP和维生素C，研磨成细粉；
步骤二、向细粉中加入CTAB提取缓冲液和β-巯基乙醇的混合液，混合至细粉完全悬浮，然后于65℃水浴加热30～45min，在水浴加热期间摇匀，得悬浮液；
其中，CTAB提取缓冲液与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.02～0.04g，混合液为体积分数为2％的β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液，悬浮液与PVP的体积质量比为100mL:1g，悬浮液与维生素C的体积质量比为100mL:1g；
步骤三、悬浮液冷却至室温，加入氯仿和异戊醇混合溶剂混合均匀，离心，取上清液；
步骤四、向步骤三中的上清液加入异丙醇，混合均匀得待提液；
步骤五、将步骤四中的待提液转移至DNA提取试剂盒的离心柱中，离心，弃掉收集管中的废液；
步骤六、向离心柱内的物质中加入乙醇，离心，弃掉收集管中的废液，将离心柱晾干至无乙醇；
步骤七、向离心柱内的物质中加入TE缓冲液，离心，收集收集管中的溶液，即为山银花叶片DNA溶液。
2.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤一中干燥的山银花叶片是采用变色硅胶干燥。
3.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤二中研磨的方法具体为：置于液氮中冷却1～2min，然后置于冷冻研磨仪以30Hz/s研磨30～40s，再置于液氮中冷却1min，然后置于冷冻研磨仪以30Hz/s研磨30s；
混合液在加入至步骤一中的细粉之前，提前预热至65℃。
4.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤二中的CTAB提取缓冲液采用改良CTAB提取缓冲液代替，改良CTAB提取缓冲液的制备方法为：
将pH值为8.0的CTAB，NaCl，Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0的EDTA标准溶液，加入容量瓶，混匀，用超纯水定容至改良CTAB提取缓冲液的终体积，灭菌即得改良CTAB提取缓冲液，其中，CTAB、NaCl、Tris-HCl缓冲液、EDTA标准溶液、改良CTAB提取缓冲液的终体积的质量体积比为1.5g:4.091g:5mL:20mL:50mL。
5.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤三中的氯仿和异戊醇的体积比为24:1，离心速度为10000～13000rpm，离心时间5～6min，混合溶剂与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.02～0.04g。
6.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤四中的异丙醇与上清液的体积比为1:1，异丙醇的温度为-20℃。
7.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤五中进行两次离心，第一次离心弃掉收集管中的废液后，进行第二次离心，并弃掉收集管中的废液，两次离心的速度均为10000～11000rpm，离心时间均为30s。
8.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤六的具体方法为：向离心管中加入质量分数为70％的乙醇，于10000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，再次向离心管中加入质量分数为75％的乙醇，于10000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，其中，质量分数为70％的乙醇、质量分数为75％的乙醇、山银花叶片的体积质量比为500μL:500μL:0.02～0.04g。
9.如权利要求1所述的防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，其特征在于，步骤七中的离心速度为10000～13000rpm，离心时间为2～5min，TE缓冲液与山银花叶片的体积质量比为100μL:0.02～0.04g。
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Application publication date: 20190705 Assignee: Guangxi hengderun capsaicin Co.,Ltd. Assignor: GUANGXI BOTANICAL GARDEN OF MEDICINAL PLANTS Contract record no.: X2023980045867 Denomination of invention: A Method for Extracting DNA from Dried Leaves of Lonicera japonica Using a Centrifuge Column to Prevent Hairy Clogging Granted publication date: 20221125 License type: Common License Record date: 20231107 |