CN107326023A - 一种常绿木本植物基因组dna的提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

一种常绿木本植物基因组dna的提取试剂盒及提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种常绿木本植物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法，属于基因工程领域，试剂盒包括漂洗液、裂解液、抽提液A、抽提液B、结合缓冲液、过柱缓冲液、洗脱缓冲液和吸附柱，还包括助研剂；助研剂中包括不溶性PVPP、石英砂和抗坏血酸；漂洗液中包含Tris‑HCl，EDTA‑Na2，NaCl，KAc，葡萄糖，PVP，抗坏血酸和PEG；裂解液的成分包括CTAB，Tris‑HCl，EDTA‑Na2，NaCl，山梨醇，硼砂，PVP，抗坏血酸和蛋白酶K。该方法操作灵活、快速，成本低，适用面广，对次生代谢物和细胞中其他干扰物质去除较彻底，提取的基因组质量好，纯度高，蛋白污染少。

Description

一种常绿木本植物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及植物基因组DNA的提取，具体地，涉及一种常绿木本植物基因组DNA的提取试剂盒及提取方法。
背景技术
常绿植物是指一年四季均长有绿叶的植物。这类植物由于具有四季常青的特性，可以有效提高城市园林绿化的质量，增强园林绿化的美感，同时在维护生态系统的平衡中发挥着重要作用，因此常被用作绿化的首选植物。常绿木本植物树种多树体高大、干形通直圆满，是建筑、造纸和板材等生产的重要原材料。其中部分科属的植物是研究植物起源、发育、进化不可缺少的珍贵材料，科学研究价值极高。但由于滥砍滥伐和生态环境的恶化，以及自身繁殖能力衰退等因素影响，常绿木本植物中有不少种类已处于渐危、濒危和极危的状态。因此，加强这类植物的研究，采取有效的保护措施迫在眉睫。
DNA提取是植物分子生物学的基础技术，纯度高、完整性好的DNA是进行分子杂交、基因克隆、文库构建和基因组测序等分子操作的前提。理想的DNA提取方法应满足以下几个主要条件：获得的DNA纯度高、完整性好、提取的量要充足、操作简便、省时、成本低。尽管从有机体中提取DNA已成为分子生物学实验室中的一项常规技术，但植物组织的组分复杂，不同的植物材料的组分各异，特别是多年生常绿木本植物如松柏科植物、木兰科植物等，因细胞壁较厚、代谢旺盛，细胞中含有大量的多糖、多酚等次生代谢物质，并且叶子表面革质化，常被分子生物学研究人员称为“顽执植物”（recalcitrant plant），如何去除这些杂质获得高质量的DNA，是这类植物研究的面临的首要问题。
发明内容
针对上述常绿木本植物基因组DNA提取方面面临的问题，本发明的目的在于提供一种常绿木本植物基因组DNA的提取试剂盒，以及一种提取方法，对次生代谢物和细胞中其他干扰物质去除较为彻底，提取的基因组质量好，纯度高，污染少。
一种常绿木本植物基因组DNA的提取试剂盒，包括：漂洗液、裂解液、抽提液A、抽提液B、结合缓冲液、过柱缓冲液、洗脱缓冲液和吸附柱，还包括助研剂，所述助研剂包括不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、石英砂和抗坏血酸；所述漂洗液中包含Tris-HCl、EDTA-Na2、NaCl、KAc、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸和聚乙二醇；所述裂解液中包含CTAB、Tris-HCl、EDTA-Na2、NaCl、山梨醇、硼砂、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸和蛋白酶K。
作为进一步的优化，所述助研剂中不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、石英砂和抗坏血酸的质量份数比为：5-20：5-20：1-10。
作为进一步的优化，所述漂洗液中包含0.05-0.1mol/L Tris-HCl，0.01-0.1mol/LEDTA-Na2，0.1-1mol/L NaCl，0.5-1mol/L KAc，0.1-0.2mol/L葡萄糖，质量分数为1-6%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和体积分数为6-10%的聚乙二醇。
作为进一步的优化，所述裂解液中包含2-4×CTAB，0.1-0.3mol/L Tris-HCl，0.01-0.05mol/L EDTA-Na2，1-2mol/L NaCl，0.3-0.5mol/L山梨醇， 0.01-0.05mol/L硼砂，质量分数为2-3%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和50-200μg/mL 蛋白酶K。
作为进一步的优化，所述蛋白酶K的酶活为≥30U/mg。
本发明还提供一种常绿木本植物基因组DNA的提取方法，包括取样、研磨、裂解、抽提、结合、过柱、洗柱、晾干和洗脱步骤，其特征在于：研磨过程中加入助研剂，助研剂包括不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、石英砂和抗坏血酸，每5-10质量份数的样品中加入5-20质量份不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、5-20质量份石英砂和1-10质量份抗坏血酸；在裂解前增加漂洗步骤，该步骤是向样品中加入漂洗液，震荡混匀后置于冰上处理，离心后去上清；其中，所述漂洗液中包含0.05-0.1mol/L Tris-HCl，0.01-0.1mol/L EDTA-Na2，0.1-1mol/L NaCl，0.5-1mol/L KAc，0.1-0.2mol/L葡萄糖，质量分数为1-6%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和体积分数为6-10%的聚乙二醇；在裂解步骤中加入的裂解液中包含2-4×CTAB，0.1-0.3mol/L Tris-HCl，0.01-0.05mol/L EDTA-Na2，1-2mol/L NaCl，0.3-0.5mol/L山梨醇， 0.01-0.05mol/L硼砂，质量分数为2-3%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和50-200μg/mL 蛋白酶K。
进一步的，上述提取方法包括以下步骤：
步骤一、取样：取新鲜健康无虫害叶片，低温或加入变色硅胶保存；
步骤二、研磨：清洗叶片，去叶柄和叶脉，剪碎后置于液氮中进行研磨，研磨过程中加入助研剂，研磨完成得样品粉末；其中，每50-100mg剪碎后叶片研磨过程中加入的助研剂包含0.05-0.2g不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、0.05-0.2g石英砂和0.01-0.1g抗坏血酸；
步骤三、漂洗：取60mg样品粉末置于2mL离心管中，加入1mL漂洗液，震荡混匀后于冰上处理5min，8,000rpm离心5min，弃上清；重复本步骤1~2次；其中，漂洗液在使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为2~10%；
步骤四、裂解：加入1mg活性炭粉末和600μL 经65℃预热的裂解液，混匀，封闭离心管管口，65℃水浴处理30min，之后将离心管取出置于冰上冷却至室温；其中，裂解液在使用前加入β-巯基乙醇，使裂解液中β-巯基乙醇的体积分数为2~10%；
步骤五、抽提：加入与离心管中溶液等体积的抽提液A，颠倒混匀，于室温条件下≥12000rpm离心5min，将上清液转移到另一干净的离心管中；向该离心管中加入与上清液等体积的抽提液B进行再次抽提，于室温条件下≥12000rpm离心5min，吸取上清液，重复此步骤至看不到界面上有环状白色沉淀为止；其中，所述抽提液A为体积比为25：24的酚和氯仿的混合液，抽提液B为体积比为24：1的氯仿和异戊醇的混合液；
步骤六、结合：向离心管中加入其内溶液1.5倍体积的结合缓冲液，颠倒混匀，静置，溶液中产生絮状沉淀；所述结合缓冲液中包含4-6mol/L盐酸胍，0.05-0.1mol/L Tris-HCl和0.01-0.05mol/L EDTA-Na2，pH=5-6；
步骤七、过柱：将步骤六的絮状沉淀随溶液一同转移至DNA吸附柱，≥12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
步骤八、去色素：向吸附柱中加入500~700μL无水乙醇，≥12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
步骤九、洗柱：向吸附柱中加入500~700μL 的过柱缓冲液；所述过柱缓冲液为体积分数为70%~85%的乙醇；于≥12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；重复此步骤一次；
步骤十、晾干：晾干吸附柱中吸附材料上残余的乙醇；
步骤十一、洗脱：向吸附柱吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μL经预热的洗脱缓冲液，室温放置2min，≥12,000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中；其中，洗脱缓冲液中包含0.01mol/L Tris-HCl和0.001-0.01mol/L EDTA-Na2，pH=8.0-8.5；
步骤十二、检测、保存。
本发明的有益效果：
1、 本发明所述助研剂，以不溶性PVPP、石英砂和抗坏血酸为主要成分，其中不溶性PVPP能够络合多酚和萜类物质，防止多酚物质氧化成醌类，避免溶液变褐；石英砂可以增强样品的研磨效果；抗坏血酸作为一种抗氧化剂，能防止酚类物质氧化；该助研剂可以保证对常绿乔木革质化叶片充分研磨，并有效控制研磨过程中发生的氧化。本发明在细胞裂解前增加了漂洗步骤，漂洗液中的聚乙二醇（PEG）能吸附次生代谢物质；在DNA释放之前醋酸钾主要起到去除多糖的作用；葡萄糖能够调节漂洗液的渗透势，使之与细胞核内渗透势保持平衡，防止细胞核破裂提前破碎释放出DNA；而PVP（聚乙烯基吡咯烷酮）可以防止多酚和单宁氧化成醌类物质，同时可去除多糖；该漂洗液可在细胞核被裂解前去除细胞质中的多酚类等杂质，有效防止DNA与酚类物质结合褐化，并较为彻底去除色素、多糖等杂质，是本方法适用广泛的关键。与传统方法使用的裂解液相比，本方法对使用的裂解液的成分和配比进行了微调，该裂解液配方可减少次生代谢物含量并且抑制酚类和单宁等物质的氧化，增加所提取基因组DNA的纯度和完整性。本发明方法以上述特征为依托，在其它步骤和添加试剂的共同作用下，协同作用，在快速提取常绿木本植物高质量基因组DNA上取得显著的功效。
2、本发明所述方法提取的常绿木本植物的基因组DNA，所含杂质较少，测定的部分样品的OD260/OD280均＞1.8，凝胶电泳后条带清晰，质量好，能够应用于其它分子生物学试验中。本发明方法与传统的基因组DNA提取方法（如CTAB法）相比，能有效防止样品褐化，而且适用面较广，尤其适用于富含多酚、次生代谢物的常绿木本植物如木兰科、松科等“顽拗植物”样本的DNA提取；另外，本发明操作灵活、快速，单个样品的提取可在1个小时内完成，10个样品提取可在2个小时内完成，提取效率较高，为科学研究节省了珍贵的时间成本。最后，成本较低，方法中的分析纯试剂和吸附柱均可使用国产产品，打破了生物分子研究领域大量使用进口试剂和产品的尴尬现状，在不降低DNA质量的前提下，单个样品DNA提取成本低至目前市场主流DNA提取试剂盒价格的1/3，可为试验经费不充足的研究课题节约大量成本。
附图说明
图1是采用本发明方法（A）和常规CTAB法（B）提取不同常绿木本植物的基因组DNA凝胶电泳对比图；其中，1、圆柏；2、侧柏；3、雪松；4、白皮松；5、广玉兰；6、粗榧；7、红豆杉；8、竹子；M1、1kb Marker；M2、DL2000 Marker；
图2是ITS（ITS1/ITS4）引物扩增本方法提取的不同树种DNA电泳结果图；其中，1、圆柏；2、侧柏；3、雪松；4、白皮松；5、广玉兰；6、粗榧；7、红豆杉；8、竹子；M、DL2000 Marker。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的解释说明。
实施例1
取新鲜健康的圆柏（柏科）叶片，装入密封冰盒中带回实验室，用蒸馏水清洗去除叶片表面污物并擦干，将叶片去除叶柄、叶脉，剪碎后取50mg放入液氮预冷灭菌研钵中，加入液氮，并加入助研剂，快速研磨至细粉末状，得样品粉末，研磨过程中研棒顺时针和逆时针方向反复研磨，保证样品研磨彻底。将样品粉末置于2mL离心管中，加入1mL漂洗液，震荡混匀后于冰上处理5min，8,000rpm离心5min，弃上清；重复本步骤1次；其中，漂洗液在使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为2%。向离心管中加入1mg活性炭粉末和600μL 经65℃预热的裂解液，混匀，用封口膜封闭离心管管口，65℃水浴处理30min，期间每5min左右颠倒混匀一次；其中，裂解液在使用前加入β-巯基乙醇，使裂解液中β-巯基乙醇的体积分数为2%；水浴时间不可超过30min。
水浴完成后，将装有样品溶液的离心管从水浴锅中取出，置于冰上冷却至室温，加入于样品溶液等体积的抽提液A，充分颠倒混匀，于室温条件下≥12000rpm离心5min，将上清液转移到另一干净的离心管中；向该离心管中加入与上清液等体积的抽提液B再次抽提，于室温条件下≥12000rpm离心5min，吸取上清至另一干净的离心管中，重复此步骤至看不到界面上有环状白色沉淀为止。向装有上清的离心管中加入体积为上清体积1.5倍的结合缓冲液，随即充分颠倒混匀，若出现絮状沉淀属正常现象，静置片刻；将离心管中包含沉淀的溶液转移至DNA吸附柱，≥12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入500μl无水乙醇，≥12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入600μl75%乙醇（使用前-20℃预冷）。≥12,000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复此步骤一次。将吸附柱≥12,000rpm离心2min，弃收集管，将吸附柱放入已灭菌的1.5ml离心管；置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。向吸附柱吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μL洗脱缓冲液（可65℃预热以提高得率）（或者灭菌去离子水，pH7.5~8.5），室温放置2min，≥12,000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中。最后验证正确后置于4℃短期保存，-20℃长期保存，以防降解。
其中，所述助研剂包括0.05g不溶性PVPP、0.2g石英砂和0.1g抗坏血酸；
所述漂洗液包括0.05mol/L Tris-HCl， 0.1mol/L EDTA-Na2，1mol/L NaCl，0.5mol/LKAc，0.2mol/L葡萄糖，质量分数为1% 的PVP，质量分数为2%的抗坏血酸和体积分数为6%的PEG6000。
所述裂解液包括4×CTAB，0.1mol/L Tris-HCl，0.01mol/L EDTA-Na2，1mol/LNaCl，0.5mol/L山梨醇， 0.01mol/L硼砂，质量分数为3% 的PVP，质量分数为1%的抗坏血酸，200μg/mL 蛋白酶K，pH8.0；
所述抽提液A中酚/氯仿的体积比为25:24；抽提液B中氯仿/异戊醇的体积比24:1；
所述结合缓冲液包括5mol/L盐酸胍，0.1 mol/L Tris-HCl，0.01mol/L EDTA-Na2，pH5.5；
所述洗脱缓冲液包括0.01mol/L Tris-HCl，0.001mol/L EDTA-Na2，pH8.0。
实施例2
取新鲜健康的侧柏（柏科）叶片，采用与实施例1相似的方法提取侧柏的基因组DNA，不同之处在于：其中剪碎后取70mg进行研磨，所用的助研剂包括0.05g不溶性PVPP、0.2g石英砂和0.09g抗坏血酸；
所述漂洗液包括0.1mol/L Tris-HCl，0.09mol/L EDTA-Na2，0.8mol/L NaCl，1mol/LKAc，0.1mol/L葡萄糖，质量分数为2% 的PVP，质量分数为1.5%的抗坏血酸和体积分数为7%的PEG6000；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为3%；
所述裂解液包括2×CTAB，0.2mol/L Tris-HCl，0.03mol/L EDTA-Na2，1.2mol/L NaCl，0.4mol/L山梨醇， 0.02mol/L硼砂，质量分数为2%的 PVP，质量分数为1.5%的抗坏血酸，180μg/mL 蛋白酶K，pH8.0；使用前加入β-巯基乙醇，使裂解液中β-巯基乙醇的体积分数为4%；
所述抽提液A中酚/氯仿的体积比为25:24；抽提液B中氯仿/异戊醇的体积比为24:1；
所述结合缓冲液包括4mol/L盐酸胍，0.05 mol/L Tris-HCl，0.02mol/L EDTA-Na2，pH5；
所述洗脱缓冲液包括0.01mol/L Tris-HCl，0.002mol/L EDTA-Na2，pH8.3。
实施例3
取新鲜健康的雪松（松科）叶片，采用与实施例1相似的方法提取侧柏的基因组DNA，不同之处在于：其中剪碎后取80mg进行研磨，所用的助研剂包括0.1g不溶性PVPP、0.18g石英砂和0.08g抗坏血酸；
所述漂洗液包括0.1mol/L Tris-HCl，0.08mol/L EDTA-Na2，0.7mol/L NaCl，0.8mol/LKAc，0.15mol/L葡萄糖，质量分数为3% 的PVP，质量分数为1%的抗坏血酸和体积分数为8%的PEG6000；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为4%；
所述裂解液包括3×CTAB，0.3mol/L Tris-HCl，0.05mol/L EDTA-Na2，1.4mol/L NaCl，0.3mol/L山梨醇， 0.03mol/L硼砂，质量分数为2.5% 的PVP，质量分数为2%的抗坏血酸，160μg/mL 蛋白酶K，pH8.0；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为3%；
所述抽提液A中酚/氯仿的体积比为25:24；抽提液B中氯仿/异戊醇的体积比24:1；
所述结合缓冲液包括5mol/L盐酸胍，0.1 mol/L Tris-HCl，0.03mol/L EDTA-Na2，pH6；
所述洗脱缓冲液包括0.01mol/L Tris-HCl，0.003mol/L EDTA-Na2，pH8.5。
实施例4
取新鲜健康的白皮松（松科）叶片，采用与实施例1相似的方法提取侧柏的基因组DNA，不同之处在于：其中剪碎后取90mg进行研磨，所用的助研剂包括0.15g不溶性PVPP、0.15g石英砂和0.06g抗坏血酸；
所述漂洗液包括0.09mol/L Tris-HCl，0.06mol/L EDTA-Na2，0.6mol/L NaCl，0.5mol/L KAc，0.2mol/L葡萄糖，质量分数为4% 的PVP，质量分数为1%的抗坏血酸和体积分数为9%的PEG6000；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为5%；
所述裂解液包括3×CTAB，0.15mol/L Tris-HCl，0.05mol/L EDTA-Na2，1.6mol/LNaCl，0.5mol/L山梨醇，0.04mol/L硼砂，质量分数为2% 的PVP，质量分数为1.3%的抗坏血酸，140μg/mL 蛋白酶K，pH8.0；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为5%；
所述抽提液A中酚/氯仿的体积比为25:24；抽提液B中氯仿/异戊醇的体积比24:1；
所述结合缓冲液包括6mol/L盐酸胍，0.09 mol/L Tris-HCl，0.04mol/L EDTA-Na2，pH5.5；
所述洗脱缓冲液包括0.01mol/L Tris-HCl，0.005mol/L EDTA-Na2，pH8.0。
实施例5
取新鲜健康的广玉兰（木兰科）叶片，采用与实施例1相似的方法提取侧柏的基因组DNA，不同之处在于：其中剪碎后取100mg进行研磨，所用的助研剂包括0.2g不溶性PVPP、0.12g石英砂和0.05g抗坏血酸；
所述漂洗液包括0.08mol/L Tris-HCl，0.05mol/L EDTA-Na2，0.1mol/L NaCl，0.8mol/L KAc，0.1mol/L葡萄糖，质量分数为5% 的PVP，质量分数为2%的抗坏血酸和体积分数为10%的PEG8000；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为6%；
所述裂解液包括4×CTAB，0.25mol/L Tris-HCl，0.04mol/L EDTA-Na2，1.8mol/LNaCl，0.4mol/L山梨醇，0.05mol/L硼砂，质量分数为3% 的PVP，质量分数为1.8%的抗坏血酸，120μg/mL 蛋白酶K，pH8.0；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为4%；
所述抽提液A中酚/氯仿的体积比为25:24；抽提液B中氯仿/异戊醇的体积比24:1；
所述结合缓冲液包括4.5mol/L盐酸胍，0.08 mol/L Tris-HCl，0.05mol/L EDTA-Na2，pH5；
所述洗脱缓冲液包括0.01mol/L Tris-HCl，0.006mol/L EDTA-Na2，pH8.5。
实施例6
取新鲜健康的粗榧（三尖杉科）叶片，采用与实施例1相似的方法提取侧柏的基因组DNA，不同之处在于：其中剪碎后取60mg进行研磨，所用的助研剂包括0.07g不溶性PVPP、0.08g石英砂和0.04g抗坏血酸；
所述漂洗液包括0.07mol/L Tris-HCl，0.03mol/L EDTA-Na2，0.2mol/L NaCl，0.6mol/L KAc，0.15mol/L葡萄糖，质量分数为6% 的PVP，质量分数为2%的抗坏血酸和体积分数为8%的PEG8000；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为4%；
所述裂解液包括4×CTAB，0.1mol/L Tris-HCl，0.03mol/L EDTA-Na2，2mol/L NaCl，0.5mol/L山梨醇，0.05mol/L硼砂，质量分数为3%的 PVP，质量分数为2%的抗坏血酸，100μg/mL 蛋白酶K，pH8.0；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为6%；
所述抽提液A中酚/氯仿的体积比为25:24；抽提液B中氯仿/异戊醇的体积比24:1；
所述结合缓冲液包括5mol/L盐酸胍，0.07 mol/L Tris-HCl，0.01mol/L EDTA-Na2，pH6；
所述洗脱缓冲液包括0.01mol/L Tris-HCl，0.008mol/L EDTA-Na2，pH8.5。
实施例7
取新鲜健康的红豆杉（红豆杉科）叶片，采用与实施例1相似的方法提取侧柏的基因组DNA，不同之处在于：其中剪碎后取50mg进行研磨，所用的助研剂包括0.13g不溶性PVPP、0.1g石英砂和0.02g抗坏血酸；
所述漂洗液包括0.06mol/L Tris-HCl，0.02mol/L EDTA-Na2，0.4mol/L NaCl， 1mol/LKAc， 0.2mol/L葡萄糖，质量分数为6% 的PVP，质量分数为1.5%的抗坏血酸和体积分数为6%的PEG8000；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为10%；
所述裂解液包括2×CTAB，0.2mol/L Tris-HCl，0.02mol/L EDTA-Na2，1mol/L NaCl，0.4mol/L山梨醇，0.03mol/L硼砂，质量分数为2.5% 的PVP，质量分数为1%的抗坏血酸，80μg/mL 蛋白酶K，pH8.0；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为8%；
所述抽提液A中酚/氯仿的体积比为25:24；抽提液B中氯仿/异戊醇的体积比24:1；
所述结合缓冲液包括5.5mol/L盐酸胍，0.06mol/L Tris-HCl，0.03mol/L EDTA-Na2，pH5.5；
所述洗脱缓冲液包括0.01mol/L Tris-HCl，0.01mol/L EDTA-Na2，pH8.3。
实施例8
取新鲜健康的刚竹（禾本科）叶片，采用与实施例1相似的方法提取侧柏的基因组DNA，不同之处在于：其中剪碎后取70mg进行研磨，所用的助研剂包括0.17g不溶性PVPP、0.05g石英砂和0.01g抗坏血酸；
所述漂洗液包括0.05mol/L Tris-HCl，0.01mol/L EDTA-Na2，0.5mol/L NaCl， 1mol/LKAc，0.1mol/L葡萄糖，质量分数为3% 的PVP，质量分数为1%的抗坏血酸和体积分数为6%的PEG8000；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为8%；
所述裂解液包括2×CTAB，0.3mol/L Tris-HCl，0.01mol/L EDTA-Na2，2mol/L NaCl，0.3mol/L山梨醇，0.01mol/L硼砂，质量分数为2% 的PVP，质量分数为2%的抗坏血酸，50μg/mL 蛋白酶K，pH8.0；使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为10%；
所述抽提液A中酚/氯仿的体积比为25:24；抽提液B中氯仿/异戊醇的体积比24:1；
所述结合缓冲液包括6mol/L盐酸胍，0.05mol/L Tris-HCl，0.05mol/L EDTA-Na2，pH5；
所述洗脱缓冲液包括0.01mol/L Tris-HCl，0.001mol/L EDTA-Na2，pH8.0。
对照例
采用传统常用的CTAB法对实施例1-8中所述的植物样品进行基因组DNA的提取，通过凝胶试验证实，传统的CTAB法并不能提取到侧柏、雪松和广玉兰的有效的基因组DNA。
将分别采用本发明方法和CTAB法提取的圆柏（Sabina chinensis (L.) Ant.）、侧柏（Platycladus orientalis (L.) Franco）、雪松（Cedrus deodara (Roxb.) G. Don）、白皮松（Pinus bungeana Zucc.）、广玉兰（Magnolia denudata Desr.）、粗榧（Cephalotaxus sinensis (Rehd. et Wils.) Li）、红豆杉（Taxus chinensis (Pilger) Rehd）和竹子（Phyllostachys viridis）的基因组DNA进行凝胶电泳试验，结果如图1所示，采用本发明方法提取的八种常绿木本植物的基因组DNA条带清晰，质量稳定，无拖带或杂带现象，而采用CTAB法，并不能提取到侧柏、雪松和广玉兰的有效的基因组DNA，提取到的粗榧的基因组DNA浓度较低，刚竹的基因组DNA虽然存在条带，但是拖带严重，考虑到是因为蛋白去除不充分，很难用于后续研究。综合考虑，采用传统的CTAB法提取常绿木本植物的基因组DNA，提取质量并不稳定，适用范围有限，会增加科研成本；而本发明方法提取的几种植物的基因组DNA，性质稳定，杂质去除较为彻底，无DNA降解，条带清晰，浓度适中，使用范围广，尤其适用于富含多酚、次生代谢物的常绿木本植物如木兰科、松科等“顽拗植物”样本的DNA提取，提取的DNA可应用于分子标记辅助育种、DNA分子杂交和基因克隆等分子生物学试验。
本发明还对采用本发明方法和普通CTAB法获得的部分样品裂解处理15min后的褐化程度进行了对比，结果可知，采用本发明方法裂解后的样品，褐化现象并不明显，这是由于加入的助研剂和漂洗液等成分协同作用的结果，进一步有助于高质量基因组DNA的提取。而采用普通CTAB法的样品经裂解处理后，褐化现象严重，由于木本植物中富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质，从这些植物中分离的DNA由于多酚被氧化成棕褐色，多糖、单宁等物质会结合成粘稠的胶状物，获得的DNA常出现产量低、质量差、易降解，从而影响了DNA的质量和纯度，进而影响所提取的DNA的进一步利用。
对采用本发明方法提取的几种常绿木本植物的DNA样本的初度和浓度进行检测，检测方法为：取2μLDNA原液，用微量紫外分光光度计（Nano-Drop 2000，美国Thermo）测定本方法提取的部分样本DNA 在260nm和280nm下的光密度值（optical density，OD），以及DNA浓度。结果如下表1所示。其中，260nm的值指核酸最高吸收峰的吸收波长、280nm的值指蛋白最高吸收峰的吸收波长。一般主要参考A260/A280比值作为核酸纯度的指标，样品中如果含有蛋白质及苯酚，A260/A280比值会明显下降。若260/280≥1.8，表明DNA纯度较高，蛋白污染较少。
表1：紫外分光光度计检测本方法提取的DNA样本纯度和浓度
为进一步说明采用本发明方法提取的常绿木本植物的DNA的再利用情况，采用提取的DNA进行 ITS（ITS1/ITS4）引物扩增，结果分别如图2所示，除竹子出现稍弥散条带和粗榧未出现条带外，其余条带清晰，不存在弥散，虽然有的出现非特异性扩增，但鉴于采用的引物为通用引物且样品DNA基因组较大，为正常现象，条带分离清楚，胶回收目的片段即可；而采用传统方法提取的基因组并不能进行有效的ITS（ITS1/ITS4）引物扩增。
最后需要说明的是，以上实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不以此限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种常绿木本植物基因组DNA的提取试剂盒，包括：漂洗液、裂解液、抽提液A、抽提液B、结合缓冲液、过柱缓冲液、洗脱缓冲液和吸附柱，其特征在于：还包括助研剂，所述助研剂包括不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、石英砂和抗坏血酸；所述漂洗液中包含Tris-HCl、EDTA-Na2、NaCl、KAc、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸和聚乙二醇；所述裂解液中包含CTAB、Tris-HCl、EDTA-Na2、NaCl、山梨醇、硼砂、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸和蛋白酶K。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述助研剂中不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、石英砂和抗坏血酸的质量份数比为：5-20：5-20：1-10。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述漂洗液中包含0.05-0.1mol/L Tris-HCl，0.01-0.1mol/L EDTA-Na2，0.1-1mol/L NaCl，0.5-1mol/L KAc，0.1-0.2mol/L葡萄糖，质量分数为1-6%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和体积分数为6-10%的聚乙二醇。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述裂解液中包含2-4×CTAB，0.1-0.3mol/L Tris-HCl，0.01-0.05mol/L EDTA-Na2，1-2mol/L NaCl，0.3-0.5mol/L山梨醇，0.01-0.05mol/L硼砂，质量分数为2-3%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和50-200μg/mL 蛋白酶K。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白酶K的酶活为≥30U/mg。
6.一种常绿木本植物基因组DNA的提取方法，包括取样、研磨、裂解、抽提、结合、过柱、洗柱、晾干和洗脱步骤，其特征在于：研磨过程中加入助研剂，助研剂包括不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、石英砂和抗坏血酸，每5-10质量份数的样品中加入5-20质量份不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、5-20质量份石英砂和1-10质量份抗坏血酸；在裂解前增加漂洗步骤，该步骤是向样品中加入漂洗液，震荡混匀后置于冰上处理，离心后去上清；其中，所述漂洗液中包含0.05-0.1mol/L Tris-HCl，0.01-0.1mol/L EDTA-Na2，0.1-1mol/L NaCl，0.5-1mol/LKAc，0.1-0.2mol/L葡萄糖，质量分数为1-6%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和体积分数为6-10%的聚乙二醇；在裂解步骤中加入的裂解液中包含2-4×CTAB，0.1-0.3mol/L Tris-HCl，0.01-0.05mol/L EDTA-Na2，1-2mol/L NaCl，0.3-0.5mol/L山梨醇，0.01-0.05mol/L硼砂，质量分数为2-3%的聚乙烯吡咯烷酮，质量分数为1-2%的抗坏血酸和50-200μg/mL 蛋白酶K。
7.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、取样：取新鲜健康无虫害叶片，低温或加入变色硅胶保存；
步骤二、研磨：清洗叶片，去叶柄和叶脉，剪碎后置于液氮中进行研磨，研磨过程中加入助研剂，研磨完成得样品粉末；其中，每50-100mg剪碎后叶片研磨过程中加入的助研剂包含0.05-0.2g不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮、0.05-0.2g石英砂和0.01-0.1g抗坏血酸；
步骤三、漂洗：取60mg样品粉末置于2mL离心管中，加入1mL漂洗液，震荡混匀后于冰上处理5min，8,000rpm离心5min，弃上清；重复本步骤1~2次；其中，漂洗液在使用前加入β-巯基乙醇，使漂洗液中β-巯基乙醇的体积分数为2~10%；
步骤四、裂解：加入1mg活性炭粉末和600μL 经65℃预热的裂解液，混匀，封闭离心管管口，65℃水浴处理30min，之后将离心管取出置于冰上冷却至室温；其中，裂解液在使用前加入β-巯基乙醇，使裂解液中β-巯基乙醇的体积分数为2~10%；
步骤五、抽提：加入与离心管中溶液等体积的抽提液A，颠倒混匀，于室温条件下≥12000rpm离心5min，将上清液转移到另一干净的离心管中；向该离心管中加入与上清液等体积的抽提液B进行再次抽提，于室温条件下≥12000rpm离心5min，吸取上清液，重复此步骤至看不到界面上有环状白色沉淀为止；其中，所述抽提液A为体积比为25：24的酚和氯仿的混合液，抽提液B为体积比为24：1的氯仿和异戊醇的混合液；
步骤六、结合：向离心管中加入其内溶液1.5倍体积的结合缓冲液，颠倒混匀，静置，溶液中产生絮状沉淀；所述结合缓冲液中包含4-6mol/L盐酸胍，0.05-0.1mol/L Tris-HCl和0.01-0.05mol/L EDTA-Na2，pH=5-6；
步骤七、过柱：将步骤六的絮状沉淀随溶液一同转移至DNA吸附柱，≥12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
步骤八、去色素：向吸附柱中加入500~700μL无水乙醇，≥12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
步骤九、洗柱：向吸附柱中加入500~700μL 的过柱缓冲液；所述过柱缓冲液为体积分数为70%~85%的乙醇；于≥12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；重复此步骤一次；
步骤十、晾干：晾干吸附柱中吸附材料上残余的乙醇；
步骤十一、洗脱：向吸附柱吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μL经预热的洗脱缓冲液，室温放置2min，≥12,000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中；其中，洗脱缓冲液中包含0.01mol/L Tris-HCl和0.001-0.01mol/L EDTA-Na2，pH=8.0-8.5；
步骤十二、检测、保存。
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Application publication date: 20171107

Assignee: Henan molekler Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: HENAN University OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Contract record no.: X2021980014935

Denomination of invention: An extraction kit and extraction method of evergreen woody plant genomic DNA

Granted publication date: 20201009

License type: Common License

Record date: 20211222