CN109337955A - 一种第三代测序浮游动物基因组dna提取方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法与应用。该方法包括如下步骤：(1)向缓冲液GA中加入18％～20％(V/V)β－巯基乙醇，然后加入浮游动物进行研磨，得到组织缓冲液；(2)向组织缓冲液中加入蛋白酶PK进行消化，然后加入RNase A，静置、离心，取上清液；再加入溶剂，离心，取上清液；最后加入缓冲液GB，混匀后加入无水乙醇，得到混合液；(3)将混合液加入到吸附柱CB3中，进行漂洗和洗脱，得到浮游动物基因组DNA。本发明的方法简单、易操作，且能够有效的去除色素，获得的浮游动物基因组DNA片段完整、纯度高、浓度高，为浮游动物特别是枝角类的第三代测序工作的顺利开展提供了保证。

Description

一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法与应用。

背景技术

根据化石记录和DNA数据，枝角类属于一种古老的甲壳类群。它们的动物地理学特征有：部分动物区系复合体和分类群呈现两极分离分布格局；一些物种分布范围广而另外一些物种分布范围窄；在两个半球温带－亚热带地区出现隔离种群以及较集中的本地种。这些都有利于我们通过跟植物、无脊椎动物以及脊椎动物的比较来分析枝角类的动物区系形成的历史原因。因此，对枝角类某些物种进行基因组测序有利于我们开展其群体进化与功能基因分析，讨论物种在基因结构与群体的遗传结构，从而从分子层面解释物种的进化机制、环境适应、行为与抗病机制等系列问题。

近年来，高通量测序技术突飞猛进，极大地推动了全基因组测序工作的展开，全球已有数百种植物和动物完成了全基因组测序工作。第三代测序技术凭借着片段读长更长的优势在基因组研究中得到广泛应用。其中基于PacBio Sequel平台的单分子实时测序(Single Molecule Real-Time,SMRT)技术不需要扩增即可快速读取序列。虽然SMART技术具有其他技术所无法比拟的优势，但是它对样本DNA的浓度、纯度以及完整性有更高的要求。样品主要要求指标为：样品溶液澄清无色，无不可溶解物质；电泳主带清晰，轻度降解，无蛋白、多糖及小片段污染，无RNA污染；样品A260/A280在1.8～2.0之间，A260/A230在2.0～2.2之间；样品NanoDrop所测浓度与Qubit所测浓度比值≤1.5；样品DNA总量≥10μg。

浮游动物目前已有的基因组仅限于第二代测序方法，例如萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)，大型溞(Daphnia magna)，蚤状溞(Daphnia pulex)等。在用常规试剂盒提取枝角类基因组DNA的过程中，我们发现部分透明物种(如秀体溞(Diaphanosoma)，薄皮溞(Leptodora)及长棘溞(Cercopagidae))的基因组DNA溶液含有大量色素，A260/230始终偏低，无法满足下游建库的要求。此外，由于枝角类个体较小，多数种类的体长不足2mm，室内培养需要花费庞大的人力物力。因此，特别需要快速的收集方法以及高效的DNA提取方法来解决这些技术困难，满足第三代测序的要求。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法。

本发明的另一目的在于提供所述第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，包括如下步骤：

(1)向基因组DNA提取试剂盒中的缓冲液GA中加入18％～20％(V/V)β－巯基乙醇，得到细胞裂解液；然后将浮游动物加入到细胞裂解液中于冰上进行研磨，得到研磨后的组织缓冲液；

(2)向步骤(1)中得到的组织缓冲液中加入蛋白酶PK，于55℃～57℃水浴条件下进行消化，待水浴完成后放置，得到混合液I；

(3)向步骤(2)中得到的混合液I中加入RNase A，混合均匀后放置，离心，取上清，得到上清液II；

(4)向步骤(3)中得到的上清液II中加入溶剂，混合均匀，离心，取上清，得到上清液III；其中，溶剂为苯酚、氯仿和异戊醇混合得到的溶剂；

(5)向步骤(4)中得到的上清液III中加入缓冲液GB，混合均匀，然后加入无水乙醇，混合均匀，得到混合液IV；

(6)将步骤(5)中得到的混合液IV加入到吸附柱CB3中，离心，弃废液，然后将吸附柱CB3放入收集管中用漂洗液进行漂洗，最后用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，得到浮游动物基因组DNA。

步骤(1)中所述的基因组DNA提取试剂盒为常规市售的动物组织基因组DNA提取试剂盒；优选为公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒。

步骤(1)中所述的浮游动物为枝角类；优选为模糊秀体溞(Diaphanosomadubium)，透明薄皮溞(Leptodora richard)及长柱尾突蚤(Bythotrephes longimanus)。

步骤(1)中所述的浮游动物优选为通过如下任一种方法收集得到：

(A)使用60～120μm的拖网从水体中采集浮游动物水样，依次通过600μm和250μm的网筛，然后将250μm网筛上面的浮游动物转移到含有抗生素的水中，放置5～6小时后通过人工挑选，得到所需要的浮游动物；

(B)使用120μm的拖网从水体中采集浮游动物，挑选出所需要的浮游动物个体，进行扩大培养，得到所需要的浮游动物。

方法(A)适用于当所需物种丰度占绝对优势时进行的浮游动物的收集。

方法(A)中所述的浮游动物为个体较大的浮游动物；包括枝角类，如模糊秀体溞(Diaphanosoma dubium)等。

方法(A)中所述的水为纯净水。

方法(A)中所述的含有抗生素的水为含有青霉素和链霉素的水；优选为含有100u/L的青霉素和100μg/L的链霉素的水。

方法(A)中所述的人工挑选优选为在白炽灯光下进行人工挑选。

方法(A)中所述的挑选的次数优选为2～3次，以保证物种纯度。

方法(A)中所述人工挑选得到的浮游动物保存在含有抗生素的水中；优选为保存在含有100u/L的青霉素和100μg/L的链霉素的水中。

方法(B)适用于当所需物种丰度较低时进行的浮游动物的收集。

方法(B)中所述的浮游动物包括枝角类。

方法(B)中所述的挑选为采用塑胶吸管进行挑选。

方法(B)中所述的培养所用的培养液为含有抗生素和蛋白核小球藻的培养液。

所述的抗生素为青霉素和链霉素。

所述的培养液中青霉素的浓度为100u/L，链霉素的浓度为100μg/L，蛋白核小球藻的浓度为2mgC/L。

方法(B)中所述的培养的条件为：培养温度28℃，光周期12:12hr(hour)，培养时间3个月。

步骤(1)中所述的细胞裂解液的用量为按每毫克(mg)浮游动物配比8～12μl细胞裂解液计算；优选为按每毫克浮游动物配比8μl细胞裂解液计算。

步骤(2)中所述的蛋白酶PK的的浓度优选为20mg/ml。

步骤(2)中所述的蛋白酶PK的添加量为按其在所述体系的终浓度为1～3mg/ml计算。

步骤(2)中所述的水浴的时间为10～15min；优选为10min。

所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，还包括将步骤(2)水浴过程中的混合液每隔3min颠倒混匀1次的步骤。

步骤(2)中所述的放置的时间优选为5min。

步骤(3)中所述的RNase A的浓度为10mg/ml。

步骤(3)中所述的RNase A的添加量为按其在所述体系的终浓度为1～2mg/ml计算。

步骤(3)中所述的放置的时间为5～8min；优选为8min。

步骤(3)和(6)中所述的离心的条件为：12000rpm离心30s。

步骤(4)中所述的上清液II和溶剂的体积比为1:1。

步骤(4)中所述的苯酚、氯仿和异戊醇的体积比优选为25：24：1。

步骤(4)中所述的离心的条件为：13500rpm离心5min。

步骤(5)中所述的上清液III、缓冲液GB和无水乙醇的体积比优选为1:1:1。

步骤(6)中所述的Tris-HCl缓冲液为pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液。

所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法在提取浮游动物基因组DNA中的应用。

所述的浮游动物为枝角类；优选为模糊秀体溞(Diaphanosoma dubium)，透明薄皮溞(Leptodora richard)及长柱尾突蚤(Bythotrephes longimanus)。

本发明可用于水体生态系统中浮游动物特别是枝角类的全基因组DNA提取。随着全球水环境问题日益严峻和生态系统功能退化，水生生物对于生态系统食物网链与食物见网中重要性越大来越多地受到人们关注。目前，由于数量大、生态功能重要，枝角类已成为水体生态系统中研究最多的动物类群与模式动物。

枝角类作为食物链的中间环节，其地理分布格局、种间相互作用等均对现有生态系统结构与功能有着关键的作用。同时，部分枝角类在进化上位于系统发育树的底端，可以为我们提供古老的基因型信息，这对于研究物种的进化历史有着重要意义。但是由于枝角类个体较小，平均个体不足2mm，测序需要的个体数量大，样品收集上极为困难，多数枝角类种类的体内易氧化物质含量较高，用普通试剂盒提取的DNA含有较多的色素，不能满足第三代测序的高质量要求，为高通量测序以及后续的遗传进化分析带来困难。本发明能快速收集枝角类个体，有效去除色素，大幅度提高基因组DNA纯度，为种群遗传学和生态学等技术领域提供了一种高效、可行的方法。用本方法提取的浮游动物基因组DNA片段完整、纯度高、浓度高。因此，本方法可以运用到较小个体的枝角类以及含有色素的动物基因组DNA提取中，具有广泛的应用前景。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明提供了一种枝角类个体收集、基因组DNA提取的方法，该方法可以快速收集枝角类个体、有效去除透明物种基因组DNA所产生的色素，大幅度提取的高质量DNA可应用于下游的基因工程试验，属于基因工程领域。

2、本发明的方法该方法简单、易操作，提取产物纯度稳定，为以浮游动物为生物材料的遗传学与基因工程领域的研究与技术开发开展进一步的研究提供技术保障。

3、本发明为个体很小的枝角类提供了生物个体的快速收集方法以及高效去除色素、提高基因组DNA纯度的方法，为枝角类的第三代测序工作的顺利开展提供了保证。

附图说明

图1为用常规试剂盒提取的基因组DNA溶液与本发明提取方法提取的基因组DNA溶液对比结果图(图中：1，3和5为用常规试剂盒提取的基因组DNA溶液；2，4和6为本发明提取方法提取的基因组DNA溶液)。

图2为用常规试剂盒提取的基因组DNA与本发明提取方法提取的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果图；其中，泳道M为DNA Marker，泳道1，3和5为用常规试剂盒提取的基因组DNA；泳道2，4和6为本发明提取方法提取的基因组DNA。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。下述实施例中所使用的材料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。

1、枝角类个体收集，通过以下任一种方法实现：

(1)当所研究物种丰度占绝对优势时，针对个体较大的物种(如模糊秀体溞(Diaphanosoma dubium))，使用60～120μm的拖网从水体中采集浮游动物水样，在实验室中将包含浮游动物的水样依次通过600μm和250μm的网筛，该步骤既可以过滤掉较大颗粒的杂质，又可以剔除较小个体的浮游动物。将250μm网筛上面的浮游动物立刻转移到装有饮用纯净水的1L的烧杯中，纯净水中事先添加终浓度为100u/L(unit/L)的青霉素和100μg/L的链霉素以降低污染。5～6小时后，在白炽灯光下人工挑选出所需要的物种。为保证物种纯度，重复挑选2～3次，挑选出的个体均放入含有相同抗生素(青霉素和链霉素)浓度的纯净水中。

(2)当该物种丰度较低时，使用120μm的拖网从水体中采集浮游动物，直接用一次性塑胶吸管挑选出所需个体单克隆，在实验室扩大培养。培养液(即蛋白核小球藻)中添加终浓度为100u/L的青霉素和100μg/L的链霉素以降低污染。培养温度为28℃，光周期为12:12hr(hour)，使用蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的浓度为2mgC/L。培养3个月后，在收集所有个体之前，空腹12h以上，以保证排空肠道。

实施例1

(1)模糊秀体溞(Diaphanosoma dubium)个体收集，步骤如下：

模糊秀体溞使用的是新鲜活体，该物种在部分水体中在夏季(6～8月份)能达到绝对优势。因此，本实验通过使用120μm的拖网从广州某大学校园内的湖中采集浮游动物水样，在实验室中将包含浮游动物的水样依次通过600μm和250μm的网筛。将250μm网筛上面的浮游动物立刻转移到装有饮用纯净水的1L的烧杯中，纯净水中事先添加终浓度为100u/L的青霉素和100μg/L的链霉素以降低污染。5～6小时后，在白炽灯光下人工挑选出所需要的模糊秀体溞。为保证模糊秀体溞纯度，重复挑选2～3次，挑选出的个体均放入含有相同抗生素浓度的纯净水中，得到新鲜浮游动物个体。

(2)模糊秀体溞基因组DNA提取，步骤如下：

1)取试剂盒(公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒)中的缓冲液GA，然后分别加入1％、5％、10％、15％、20％(V/V)β－巯基乙醇配置成细胞裂解液；再将400μl细胞裂解液置于5ml的组织研磨管中，取上述所收集的新鲜浮游动物个体各50mg分别放入5个组织研磨管中于冰上研磨。

2)将研磨好的组织缓冲液分别倒入1.5ml PE离心管中，然后分别加入30μl试剂盒中的蛋白酶PK(20mg/ml)，使其终浓度为1.5mg/ml，于56℃水浴10min，水浴过程中每隔3min颠倒混匀1次。

3)水浴完成后将PE离心管取出，于室温放置5min，加入10mg/ml的RNase A(公司)40μl，颠倒混匀后，室温放置8min后，于12000rpm离心30s，取上清液，分别置于新的2ml PE离心管中。

4)分别向PE离心管中加入相同体积(400μl)的混合溶剂(苯酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1)，充分颠倒混匀后，13500rpm离心5min，上清液转入新的2ml PE离心管中。

5)分别加入相同体积(400μl)的缓冲液GB，充分颠倒混匀后(由于取的是含有DNA的上清夜，所以该步骤不会出现白色沉淀)，再分别加入同体积的无水乙醇(400μl)，再次充分颠倒混匀。

6)将上一步所得溶液分两次加入试剂盒中的吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

7)根据试剂盒中步骤漂洗(其中漂洗所用的漂洗液为上述试剂盒中的漂洗液)吸附柱，最后均使用60μl pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液将DNA洗脱下来。

8)结果：添加不同浓度的β－巯基乙醇提取的模糊秀体溞基因组DNA质量差别较大，添加20％(V/V)β－巯基乙醇所获得的所获得的DNA溶液澄清透明，主带清晰，片段完整性均较好。

采用Nanodrop分光光度计检测DNA的浓度、A260/A280以及A260/A230，采用Qubit荧光计检测DNA的浓度，然后计算样品NanoDrop所测浓度与Qubit所测浓度的比值(Nc/Qc)，结果如表1所示，添加20％(V/V)β－巯基乙醇提取的基因组DNA无杂质污染，OD260/230以及Nc/Qc均能达到第三代测序的基本要求。

表1

实施例2

(1)三种枝角类的个体收集，步骤如下：

选取3种在常规基因组DNA提取过程中出现色素的枝角类(模糊秀体溞(Diaphanosoma dubium，D.dubium)，透明薄皮溞(Leptodora richard，L.richard)及长柱尾突蚤(Bythotrephes longimanus，B.longimanus))进行了试验比较；其中：

模糊秀体溞使用的是新鲜活体，该物种在部分水体中在夏季(6～8月份)能达到绝对优势。因此，本实验通过使用120μm的拖网从广州某大学校园内的湖中采集浮游动物水样，在实验室中将包含浮游动物的水样依次通过600μm和250μm的网筛。将250μm网筛上面的浮游动物立刻转移到装有饮用纯净水的1L的烧杯中，纯净水中事先添加终浓度为100u/L的青霉素和100μg/L的链霉素以降低污染。5～6小时后，在白炽灯光下人工挑选出所需要的模糊秀体溞。为保证模糊秀体溞纯度，重复挑选2～3次，挑选出的个体均放入含有相同抗生素浓度的纯净水中，得到新鲜浮游动物个体。

透明薄皮溞采自从化流溪河水库，用纯酒精固定；长柱尾突蚤采自意大利帕兰扎国家生态研究所前的湖泊，同样用纯酒精固定。在解剖镜下将个体逐个挑出，得到酒精固定个体。酒精固定的样品在裂解前需使用ddH₂O反复清洗3次。

(2)三个物种的基因组DNA提取，步骤如下：

1)取试剂盒(公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒)中的缓冲液GA，然后加入20％(V/V)β－巯基乙醇配置成细胞裂解液；再将400μl细胞裂解液置于5ml的组织研磨管中，取上述所收集的新鲜浮游动物个体或酒精固定个体各50mg分别放入3个组织研磨管中于冰上研磨。

2)将研磨好的组织缓冲液分别倒入1.5ml PE离心管中，然后分别加入30μl试剂盒中的蛋白酶PK(20mg/ml)，使其终浓度为1.5mg/ml，于56℃水浴10min，水浴过程中每隔3min颠倒混匀1次。

3)水浴完成后将PE离心管取出，于室温放置5min，加入10mg/ml的RNase A(公司)40μl，颠倒混匀后，室温放置8min后，于12000rpm离心30s，取上清液，分别置于新的2ml PE离心管中。

4)分别向PE离心管中加入相同体积(400μl)的混合溶剂(苯酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1)，充分颠倒混匀后，13500rpm离心5min，上清液转入新的2ml PE离心管中。

5)分别加入相同体积(400μl)的缓冲液GB，充分颠倒混匀后(由于取的是含有DNA的上清夜，所以该步骤不会出现白色沉淀)，再分别加入同体积的无水乙醇(400μl)，再次充分颠倒混匀。

6)将上一步所得溶液分两次加入试剂盒中的吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

7)根据试剂盒中步骤漂洗吸附柱，最后均使用60μl pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液将DNA洗脱下来。

8)同时用常规试剂盒(公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒)提取以上三种枝角类的基因组DNA，其操作步骤参考试剂盒说明书进行；具体步骤为：按上述步骤1)～7)，差别在于步骤1)中不加入β－巯基乙醇)，个体收集方法同步骤(1)。

9)结果：常规试剂盒提取的基因组DNA溶液与本提取方法提取的基因组DNA溶液如图1所示，可以看出使用常规试剂盒提取的基因组DNA含有大量色素，其中以活体秀体溞提取的DNA溶液颜色最深，使用本发明提取方法后，所获得的DNA溶液澄清透明。

将常规试剂盒提取的基因组DNA与本发明提取方法提取的基因组DNA采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用15kb的DNA Marker，比较每一个物种用两种方法提取的效果。结果如图2所示，可以看出，用本方法提取的DNA的片段完整性与用常规试剂盒提取的效果相同，主带清晰，片段完整性均较好。

采用Nanodrop分光光度计检测DNA的浓度、A260/A280以及A260/A230，采用Qubit荧光计检测DNA的浓度，然后计算样品NanoDrop所测浓度与Qubit所测浓度的比值(Nc/Qc)，结果如表2所示(表中方法1为常规试剂盒提取方法，方法2为本发明提取方法)。从表中可以看出，本发明方法提取的基因组DNA无杂质污染，OD260/230以及Nc/Qc均能达到第三代测序的基本要求。

表2

实施例3

(1)浮游动物的个体收集，步骤如下：

浮游动物使用的是水体中一次性采集的所有浮游动物新鲜活体。本实验通过使用120μm的拖网从广州某大学校园内的湖中采集浮游动物水样，在实验室中将包含浮游动物的水样通过600μm网筛以去除杂质。将水样中的浮游动物立刻转移到装有饮用纯净水的1L的烧杯中，纯净水中事先添加终浓度为100u/L的青霉素和100μg/L的链霉素以降低污染。5～6小时后，用120μm网筛重新收集浮游动物，并放入含有相同抗生素浓度的纯净水中，得到新鲜浮游动物个体。

(2)浮游动物基因组DNA提取，步骤如下：

1)取试剂盒(公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒)中的缓冲液GA，然后分别加入3％、6％、12％、18％(V/V)β－巯基乙醇配置成细胞裂解液；再将400μl细胞裂解液置于5ml的组织研磨管中，取上述所收集的新鲜浮游动物个体各50mg分别放入4个组织研磨管中于冰上研磨。

2)将研磨好的组织缓冲液分别倒入1.5ml PE离心管中，然后分别加入30μl试剂盒中的蛋白酶PK(20mg/ml)，使其终浓度为1.5mg/ml，于56℃水浴10min，水浴过程中每隔3min颠倒混匀1次。

3)水浴完成后将PE离心管取出，于室温放置5min，加入10mg/ml的RNase A(公司)40μl，颠倒混匀后，室温放置8min后，于12000rpm离心30s，取上清液，分别置于新的2ml PE离心管中。

4)分别向PE离心管中加入相同体积(400μl)的混合溶剂(苯酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1)，充分颠倒混匀后，13500rpm离心5min，上清液转入新的2ml PE离心管中。

5)分别加入相同体积(400μl)的缓冲液GB，充分颠倒混匀后(由于取的是含有DNA的上清夜，所以该步骤不会出现白色沉淀)，再分别加入同体积的无水乙醇(400μl)，再次充分颠倒混匀。

6)将上一步所得溶液分两次加入试剂盒中的吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

7)根据试剂盒中步骤漂洗吸附柱，最后均使用60μl pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液将DNA洗脱下来。

8)结果：添加不同浓度的β－巯基乙醇提取的浮游动物基因组DNA质量差别较大，添加18％(V/V)β－巯基乙醇所获得的所获得的DNA溶液澄清透明，主带清晰，片段完整性均较好。

采用Nanodrop分光光度计检测DNA的浓度、A260/A280以及A260/A230，采用Qubit荧光计检测DNA的浓度，然后计算样品NanoDrop所测浓度与Qubit所测浓度的比值(Nc/Qc)，结果如表3所示，添加18％(V/V)β－巯基乙醇提取的基因组DNA无杂质污染，OD260/230以及Nc/Qc均能达到第三代测序的基本要求。

表3

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)向基因组DNA提取试剂盒中的缓冲液GA中加入18％～20％(V/V)β－巯基乙醇，得到细胞裂解液；然后将浮游动物加入到细胞裂解液中于冰上进行研磨，得到研磨后的组织缓冲液；

(2)向步骤(1)中得到的组织缓冲液中加入蛋白酶PK，于55℃～57℃水浴条件下进行消化，待水浴完成后放置，得到混合液I；

(3)向步骤(2)中得到的混合液I中加入RNase A，混合均匀后放置，离心，取上清，得到上清液II；

(4)向步骤(3)中得到的上清液II中加入溶剂，混合均匀，离心，取上清，得到上清液III；其中，溶剂为苯酚、氯仿和异戊醇混合得到的溶剂；

(5)向步骤(4)中得到的上清液III中加入缓冲液GB，混合均匀，然后加入无水乙醇，混合均匀，得到混合液IV；

(6)将步骤(5)中得到的混合液IV加入到吸附柱CB3中，离心，弃废液，然后将吸附柱CB3放入收集管中用漂洗液进行漂洗，最后用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，得到浮游动物基因组DNA。

2.根据权利要求1所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的浮游动物为枝角类；

步骤(1)中所述的基因组DNA提取试剂盒为动物组织基因组DNA提取试剂盒。

3.根据权利要求2所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的浮游动物为模糊秀体溞，透明薄皮溞或长柱尾突蚤；

步骤(1)中所述的基因组DNA提取试剂盒为公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒。

4.根据权利要求1所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的细胞裂解液的用量为按每毫克浮游动物配比8～12μl细胞裂解液计算；

步骤(2)中所述的蛋白酶PK的添加量为按其在所述体系的终浓度为1～3mg/ml计算；

步骤(3)中所述的RNase A的添加量为按其在所述体系的终浓度为1～2mg/ml计算。

5.根据权利要求1所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；

步骤(4)中所述的上清液II和溶剂的体积比为1:1；

步骤(5)中所述的上清液III、缓冲液GB和无水乙醇的体积比为1:1:1。

6.根据权利要求1所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述的浮游动物通过如下任一种方法收集得到：

(A)使用60～120μm的拖网从水体中采集浮游动物水样，依次通过600μm和250μm的网筛，然后将250μm网筛上面的浮游动物转移到含有抗生素的水中，放置5～6小时后通过人工挑选，得到所需要的浮游动物；

(B)使用120μm的拖网从水体中采集浮游动物，挑选出所需要的浮游动物个体，进行扩大培养，得到所需要的浮游动物。

7.根据权利要求6所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于：

方法(A)中所述的浮游动物为枝角类；

方法(A)中所述的含有抗生素的水为含有100u/L的青霉素和100μg/L的链霉素的水；

方法(A)中所述的人工挑选为在白炽灯光下进行人工挑选；

方法(A)中所述人工挑选得到的浮游动物保存在含有100u/L的青霉素和100μg/L的链霉素的水中。

8.根据权利要求6所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于：

方法(B)中所述的培养所用的培养液为含有抗生素和蛋白核小球藻的培养液；

所述的培养液中青霉素的浓度为100u/L，链霉素的浓度为100μg/L，蛋白核小球藻的浓度为2mgC/L；

方法(B)中所述的培养的条件为：培养温度28℃，光周期12:12hr，培养时间3个月。

9.根据权利要求1所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的水浴的时间为10～15min；

步骤(2)中所述的放置的时间为5min；

步骤(3)中所述的放置的时间为5～8min；

步骤(3)和(6)中所述的离心的条件为：12000rpm离心30s；

步骤(4)中所述的离心的条件为：13500rpm离心5min；

步骤(6)中所述的Tris-HCl缓冲液为pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液。

10.权利要求1～9任一项所述的第三代测序浮游动物基因组DNA提取方法在提取浮游动物基因组DNA中的应用。