KR20170024468A - 동물성 플랑크톤 분류군 분석용 프라이머 세트 및 이를 이용한 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 키트 및 이를 이용한 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용 시, 기존의 시퀀싱 시스템에 비하여 경제적이고 신속하며 대량으로 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa)을 정성적 및 정량적으로 분석할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트는 해양 생태계 조사, 적조 및 해파리 경보 모니터링, 주요 생물 자원의 산란장 및 성육장 조사, 주요 해양생물의 먹이 생물 분석, 생태계 교란 및 외래 유입종에 대한 분석 등과 가공식품의 원재료 분석에도 사용이 가능하며 대규모 수산생물의 유통의 원산지 및 동정에도 이용이 가능하다.
Description
본 발명은 신규한 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 키트 및 이를 이용한 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석 방법에 관한 것이다.
플랑크톤(plankton)은 수중생물 중에서 운동능력이 전혀 없거나 매우 약해 물에 떠돌며 생활하는 생물 군이며 부유(浮遊)생물이라고도 한다. 플랑크톤 이외의 생물군도 그 대부분은 번식의 한 시기를 플랑크톤으로 지내는데, 이것을 유생(幼生)플랑크톤이라고 하며 어미와 전혀 다른 형태를 보인다. 플랑크톤은 분류학적으로 식물플랑크톤과 동물플랑크톤으로 구별할 수 있다. 식물 플랑크톤은 체내에 클로로필 등의 색소를 갖고 광합성하는 것으로 독립영양을 하고, 동물 플랑크톤은 다른 생물이나 그 파편을 포식(捕食)하는 것으로 종속(從屬)영양을 한다. 플랑크톤은 계통적으로 어란(魚卵) 및 치어(稚魚)에서 원생동물에 이르기까지 거의 모든 동식물군을 포함하는데, 그 중에서도 식물에서는 규조류, 남조류, 녹조류 및 편모조류 등이 포함되고, 동물에서는 요각류, 모악류 및 살파류 등이 포함된다. 플랑크톤은 일반적으로 극히 소형이며, 상대적으로 표면적이 클 뿐만 아니라 섬모(纖毛), 편모, 자모(刺毛) 및 돌기 등이 발달해 물의 저항을 크게 하는 형태적 특징을 갖추고 있다.
생물학의 발전에 따라 생물 분류 체계에도 변화가 뒤따랐으며, 현미경이 발명됨에 따라 생물을 분류할 수 있는 방법이 발전되어 왔다. DNA 염기서열을 중심으로 한 분자 형질을 이용하여 생물의 계통을 연구하는 분야를 분자계통학(molecular systematics)라고 하며 이는 전체 생물의 분류체계에 큰 변화를 가져왔다. 그 중 DNA 기반 종 분석은 노동 또는 시간 소비 형태분석법과 비교하여 볼 때 유용하고 유망한 도구이다. 또한, DNA 바코딩 프로젝트는 약 20년 전에 시작되었다. 상기 바코드는 미토콘드리아 시토크롬 산화효소 I(mitochondrial cytochrome oxidase I gene, COI)의 가변 영역(~700 bp)을 표적으로 한다. 종래에는 기본적으로 모든 시퀀서(sequencer)는 Sanger의 dideoxyribonucleotide analog를 이용한 방식이었는데, 최근 새로운 기법의 시퀀싱 기술이 급속도로 보급되었으며, 그 중 Sanger 방식과 달리 대량의 병렬 데이터 생산이 가능한 차세대 또는 제2세대 시퀀서(Next Generation Sequencer, 2nd Generation Sequencer)가 개발되었다. 상기 NGS 기술은 종 분석을 위한 바코드의 이용이 가능할 수 있도록, 더 많은 양의 바코드 데이터를 생산할 수 있게 만들어졌다. 현재 NGS 시퀀싱 시스템을 사용한 종 분석은 454 피로시퀀싱(454 pyrosequencing) 전략에 의해 이루어지고 있다(Roche). 상기 454 피로시퀀싱 전략은 더 긴 서열을 판독할 수 있지만(700 bp), 유사한 시퀀스 데이터 양을 얻기 위해 상대적으로 고비용이 드는 것이 문제로 대두되고 있다. 최근 Illumina사의 Hiseq 또는 Miseq을 이용한 유전자 분석방법이 나왔으나, 454 파이로시퀀싱을 이용하여 분석 가능한 서열(~700bp)에 비해 상대적으로 짧은 서열(~ 300 bp)을 분석할 수 있기 때문에, 상기 Illumina사의 Hiseq 또는 Miseq를 이용한 유전자 분석 방법은 바코드 분석에는 고려되고 있지 않다.
이에 본 발명자들은 차세대 시퀀서(NGS)를 이용하여 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa)을 분석하기 위해 연구한 결과, 신규한 동물성 플랑크톤 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 디자인하였고 이를 이용하여 증폭된 DNA 서열을 Illumina Miseq sequencer로 분석한 결과, 기존의 시퀀싱 시스템에 비하여 경제적이고 신속하게 대량으로 동물성 플랑크톤에 대한 분류군(taxa)을 정성적 및 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 이용한 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2; 및, 서열번호 3 및 4;로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa)분석용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 동물성 플랑크톤의 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 1차 증폭을 수행하는 단계; (c) 상기 (b)의 증폭 산물을 주형으로 하고 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 2차 증폭을 수행하는 단계; 및 (d) 상기 (c)의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하고 동물성 플랑크톤을 분석하는 단계;를 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 동물성 플랑크톤 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용 시, 기존의 시퀀싱 시스템에 비하여 경제적이고 신속하며 대량으로 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa)을 정성적 및 정량적으로 분석할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 동물성 플랑크톤 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트는 해양 생태계 조사, 적조 및 해파리 경보 모니터링, 주요 생물 자원의 산란장 및 성육장 조사, 주요 해양생물의 먹이 생물 분석, 생태계 교란 및 외래 유입종에 대한 분석 등과 가공식품의 원재료 분석에도 사용이 가능하며 대규모 수산생물의 유통의 원산지 및 동정에도 이용이 가능하다.
도 1은 동물성 플랑크톤의 샘플링 영역을 표시한 도이다.
도 2는 접합(end-pairing)을 이용한 COI 조립 서열(contiguous sequences)을 모식화한 도이다.
도 3은 두 인접 서열(contiguous sequences)의 조립을 모식화한 도이다.
도 4는 본 발명의 동물성 플랑크톤 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 동물성 플랑크톤의 분류군을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 동물성 플랑크톤 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 분석된 주요 동물성 플랑크톤의 문(phylum)의 비율을 나타낸 도이다.
도 6은 종래의 형태학적 특징에 의해 분석된 주요 동물성 플랑크톤 비율 및 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 분석된 주요 플랑크톤 비율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 절지동물문(arthropoda)을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 분류한 극피 동물문의 다양한 분류 비율을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 멸치(Engraulis japonicas)의 단상형(haplotype)을 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 멸치 단상형에 대한 구체적인 비율을 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 살오징어(Todarodes pacificus) 위 내용물(gut content)의 분류군(taxa)을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 접합(end-pairing)을 이용한 COI 조립 서열(contiguous sequences)을 모식화한 도이다.
도 3은 두 인접 서열(contiguous sequences)의 조립을 모식화한 도이다.
도 4는 본 발명의 동물성 플랑크톤 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 동물성 플랑크톤의 분류군을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 동물성 플랑크톤 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 분석된 주요 동물성 플랑크톤의 문(phylum)의 비율을 나타낸 도이다.
도 6은 종래의 형태학적 특징에 의해 분석된 주요 동물성 플랑크톤 비율 및 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 분석된 주요 플랑크톤 비율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 절지동물문(arthropoda)을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 분류한 극피 동물문의 다양한 분류 비율을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 멸치(Engraulis japonicas)의 단상형(haplotype)을 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 멸치 단상형에 대한 구체적인 비율을 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 살오징어(Todarodes pacificus) 위 내용물(gut content)의 분류군(taxa)을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 서열번호 1 및 2; 및, 서열번호 3 및 4;로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 디제너레이트(degenerate) 프라이머로서, 한 종류의 아미노산이 복수의 코돈(codon)에 대응하는 "디제너러시(degeneracy) " 현상을 이용하여 제작한 프라이머이다. 디제너러시 현상으로 인하여 어떤 특이한 아미노산 서열을 코드하는 유전자의 염기서열은 결정할 수 없지만, 가능성이 있는 염기서열 모두를 포함하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 합성할 수 있다. 예를 들어 프롤린-시스테인-알지닌(Pro-Cys-Arg)의 트리펩타이드(tripeptide)를 생각해 보면, 이 아미노산 서열에 대응하는 코돈은 프롤린이 4종류, 시스테인이 2종류, 알지닌이 6종류로 4×2×6 = 48종류이다. 실제로 48 종류의 코돈의 조합으로 디제너레이트 올리고뉴클레오티드를 합성할 때는 복수의 뉴클레오티드에 대응하는 위치에서는 해당 아미디티(amidite)를 혼합하여 합성한다. 따라서,디제너레이트 올리고뉴클레오티드의 조합의 종류는 코돈의 조합보다 많아질 수도 있지만, 이 올리고뉴클레오티드 혼합물 중 한 종류는 트리펩타이드를 코드하는 유전자와 완전히 일치한다. 만일 조합의 수가 그다지 많지 않고 적당한 길이의 디제너레이트 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다면, 이 올리고뉴클레오티드는 비교적 특이성 높은 프라이머로서 작용한다. 이와 같은 디제너레이트 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행 시 아미노산 서열정보를 바탕으로 그 단백질을 코드하는 유전자의 DNA 단편이 얻어질 가능성이 있다.
본 발명에 있어서 상기 "분석"은 분석 대상 생물학적 시료에 있는 동물성 플랑크톤이 각각 어떠한 분류군(taxa)에 속하는 지를 판별하는 것을 의미한다. 상기 분석은 "정량적 분석" 및 "정성적 분석"으로 나눌 수 있으며, 상기 "정량적 분석"은 혼합된 샘플상에서 동물성 플랑크톤의 특정 분류군이 어떤 비율을 차지하는지를 알아내는 것을 말한다. "정성적 분석"은 혼합된 샘플상에서 구체적으로 어떤 목, 과, 속에 속하는 것인지 분석하는 것을 뜻한다.
상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 서열번호 5 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열을, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을, 상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을, 상기 서열번호 4로 이루어진 염기서열로 표시되는 프라이머는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 기반으로 하여 이를 코딩하는 염기서열로 디자인하였으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 5 내지 9로 이루어진 아미노산 서열은 미토콘드리아 시토크롬 산화효소 I(mitochondrial cytochrome oxidase I, COI) 단백질의 서열이며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 상기 "동물성 플랑크톤"은 다른 생물이나 그 파편을 포식(捕食)하는 종속(從屬)영양을 한다. 계통적으로는 어란(魚卵) 및 치어(稚魚)에서 원생동물에 이르기까지 거의 모든 동물군을 포함한다.
상기 동물성 플랑크톤은 환형 동물문(Annelida), 절지 동물문(Arthropoda), 모악 동물문(Chaetognatha), 태형동물문(Bryozoa), 모악동물문(Chaetognatha), 모악동물문(Chordata), 자포동물문(Cnidaria), 유즐동물문(Ctenophora), 극피동물문(Echinodermata), 연체동물문(Mollusca), 선형동물문(Nematoda), 해면동물문(Porifera), 완족동물문(Tardigrada), 진와충동물문(Xenacoelomorpha), 구두동물문(Acanthocepha), 무장동물문(Acoelomorpha), 완족동물문(Brachiopoda), 구륜동물문(Cycliophora), 능형동물문(Dicyemida), 내항동물문(Entoprocta), 복모동물문(Gastrotricha), 약구동물문(Gnathostomulida), 반삭동물문(Hemichordata), 동문동물문(Kinorhyncha), 동갑동물문(Loricifera), 미악동물문(Micrognathozoa), 유선형동물문(Nematomorpha), 유형동물문(Nemertea), 유조동물문(Onychophora), 직유동물문(Orthonectida), 추형동물문(Phoronida), 판형동물문(Placozoa), 편형동물문(Platyhelminthes), 해면동물문(Porifera), 새예동물문(Priapulida), 윤형동물문(Rotifera), 성구동물문(Sipuncula), 방산충류(Radiolarida), 유공충류(foraminiferans), 청어류(herrings), 어란(fish egg), 치어(the young of fishes) 및 유생(larva)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 제작하였다(표 1). 본 발명의 동물성 플랑크톤 분석용 프라이머 세트는 1) Illumina Miseq sequencer를 이용한 최대의 길이를 확보하였다. Miseq 분석 시스템의 최대 판독 서열은 600 bp (300 + 300)이기 때문에, 약 500 bp로 증폭하는 프라이머 세트에 대한 보존 영역을 찾아 디자인하였다. 2) 본 발명의 동물성 플랑크톤 분석용 프라이머 세트는 디제너레이트(degenerate) 프라이머이므로 여러종류의 서열이 혼재되어 있으며 각각의 최적 증폭 조건이 상이하여 전체 동물성 플랑크톤 중 특정 종의 과다 증폭이나 억제가 일어나기 쉽다. 따라서, 1차 및 2차 증폭을 위한 2개의 프라이머 세트를 이용하여 특정 프라이머의 증폭을 막고 최소한의 PCR 반복(15 cycles)을 통해 과다 증폭이나 억제를 최소화하였다.
상기 프라이머 세트를 이용하여 동물성 플랑크톤의 DNA를 1차 및 2차 증폭한 후 DNA 라이브러리를 구축하였다. 그 후, Illumina Miseq sequencer를 이용하여 동물성 플랑크톤의 DNA 서열을 분석하여 데이터를 구축하였다. 그 후 바코드 데이터 및 상기 데이터로 생성된 조립 서열(314bp에서 323bp)를 사용하여 COI 데이터를 기반으로 하는 BLASTn search(상동성 = 97%)를 수행하여 동물성 플랑크톤의 분류군을 분석하였다. 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용 시, 기존의 시퀀싱 시스템에 비하여 동물성 플랑크톤의 분류군을 정성적 및 정량적으로 분석하고, 경제적이고 신속하며 대량으로 분류할 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa)분석용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한 본 발명은 (a) 동물성 플랑크톤의 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 1차 증폭을 수행하는 단계; (c) 상기 (b)의 증폭 산물을 주형으로 하고 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 2차 증폭을 수행하는 단계; 및 (d) 상기 (c)의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하고 동물성 플랑크톤을 분석하는 단계;를 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석 방법을 제공한다.
상기 (c) 단계에서 증폭 산물에 대한 서열을 분석하는 것은 Illumina Miseq sequencer을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 상기 "Illumina Miseq sequencer"는 기존의 Sanger 방식과 달리 대량의 병렬 데이터 생산이 가능한 차세대 또는 제2세대 시퀀서(Next Generation Sequencer, 2nd Generation Sequencer) 기법을 이용하는 것 중 하나이다. 상기 NGS는 DNA 서열에 대한 증폭을 하고 그 후 형광 표식 등을 카메라로 찍어 이미지 처리를 하는 과정을 거쳐 염기를 읽어내는 것으로, 본 발명의 Illumina Miseq sequencer는 고체상 증폭(solid-phase amplification)을 사용한다. 본 발명의 Illumina Miseq sequencer는 기존 대용량 시퀀서인 HiSeq의 기법 (chemistry)을 그대로 유지하면도 장비의 크기가 작고 가격이 낮아 경제적이다. 기존의 454 sequencer를 이용했을 때 하나의 COI 서열을 읽는데 드는 비용이 1센트 정도이라면 본 발명에서 적용하는 Illumina Miseq sequencer는 2 x 300bp 에서 0.02 센트의 비용이 들어 약 50배 정도의 가격 경쟁력이 있으며 경제적이다.
상기 (b) 또는 (c) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), Nested-중합효소연쇄반응(Nested-Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 사과 속 식물에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 SSR 검출용 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 Triton X-100이 추가로 포함될 수도 있다.
상기 (b) 또는 (c) 단계의 증폭은 1차 증폭 및 2차 증폭으로 수행하였으며, 상기 1차 증폭의 PCR은 총 10~20회 반복하여 수행할 수 있고, 초기 변성은 90~96℃에서 1~5분; 변성은 90~96℃에서 20~60초, 45~53℃에서 20~60초, 68~75℃에서 20~60초씩 15~25회 반복 수행하였고, 최종 연장은 68~75℃에서 1~5분간 수행하였으나, 바람직하게는, 상기 1차 증폭의 PCR은 총 15회 반복하여 수행할 수 있고, 초기 변성은 94℃에서 3분; 변성은 94℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72℃에서 30초씩 15회 반복 수행하였고, 최종 연장은 72℃에서 3분간 수행할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 2차 증폭은 nested PCR을 이용하여 총 15~25회 반복하여 수행할 수 있고, 초기 변성은 90~96℃에서 1~5분; 변성은 90~96℃에서 20~60초, 45~53℃에서 20~60초, 68~75℃에서 20~60초씩 15~25회 반복 수행하였고, 최종 연장은 68~75℃에서 1~5분간 수행하였으나, 바람직하게는, 상기 2차 증폭의 nested PCR은 총 20회 반복하여 수행할 수 있고, 초기 변성은 94℃에서 3분; 변성은 94℃에서 30초, 48℃서 30초, 72℃에서 30초씩 15회 반복 수행하였고, 최종 연장은 72℃에서 3분간 수행 할 수 있으나 이에 제한 되지 않는다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 자세히 설명하도록 한다. 하기 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 동물성 플랑크톤 채집 및 DNA 추출
동물성 플랑크톤의 분류군을 정성적 또는 정량적으로 분석하기 위하여, 동물성 플랑크톤 채집하고 DNA 추출하였다.
동해 남부해역 21지역을 선정하고(도 1), CTD(Conductivity, Temperature, Depth)를 통하여 정점의 수온, 염분 등 해수의 특징을 관측하였다. 그 후, 봉고 네트(330㎛)를 이용하여 동물성 플랑크톤 및 어란을 채집한 후 알코올로 고정하였다. 상기 채집된 동물성 플랑크톤을 육안 관찰용 및 DNA 분석용으로 나눈 뒤, 생물체량(g)을 측정하였다. 그 후, DNA 분석용 동물성 플랑크톤을 균질기를 이용하여 균질화한 뒤, DNA를 추출하였다.
실시예
2. 동물성 플랑크톤의 분류군(
taxa
) 분석용
프라이머
제작
동물성 플랑크톤의 분류군을 정성적 또는 정량적으로 분석하기 위하여, 하기와 같이, 1차 및 2차 프라이머 세트를 디자인하였다. 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트는 디제너레이트(degenerate) 프라이머이다.
구체적으로, Miseq 분석 시스템의 최대 판독 서열은 600 bp(300 + 300)이기 때문에, 약 500 bp로 증폭하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 제작하기 위하여 동물성 플랑크톤의 미토콘드리아 DNA의 보존 영역을 찾았으며, 그 중 전장 COI 유전자의 71개 아미노산 시퀀스를 배열하였다. 상기 아미노산 시퀀스 데이터는 8 문(phylum) 71 종(species)으로 이루어져 있다: 환형 동물문(Annelida)-1, 절지 동물문(Arthropoda)-35, 모악 동물문(Chaetognatha)-1, 척삭 동물문(Chordata)-4, 자포 동물문(Cnidaria)-5, 반삭동물문(Hemichordata)-1, 연체 동물문(Mollusca)-20 및 선형 동물문(Nematoda)-3. 디자인된 동물성 플랑크톤 분석용 프라이머 세트는 전형적인 바코드 (~700 bp)에 비해서는 상대적으로 더 작은 서열(489-498 bp)이지만, 종을 분류하기에 충분한 매우 가변적인 COI 영역(아미노산 73~243)을 증폭하도록 디자인하였다(도 2). 디자인된 동물성 플랑크톤 분석용 프라이머 세트(서열번호 1 내지 4)를 하기 표 1에 나타내었다.
| Primer Name | 서열번호 | Sequences 5'-3' |
| CO1NGSF1 | 서열번호 1 | ATN GGN GGN TTY GGN AA |
| CO1NGSR1 | 서열번호 2 | GGN GGN TTY GGN AAY TG |
| CO1NGSF2 | 서열번호 3 | TAN ACY TCN GGR TGN CC |
| CO1NGSR2 | 서열번호 4 | GGR TGN CCR AAR AAY CA |
실시예
3. 동물성 플랑크톤의 분류군(
taxa
) 분석용
프라이머
세트를 이용한 DNA 증폭 및 라이브러리 구축
상기 실시예 2에서 제작한 프라이머 세트를 이용하여 동물성 플랑크톤의 DNA를 증폭한 후 각 DNA 라이브러리를 구축하였다.
3-1. 동물성 플랑크톤의 분류군(
taxa
) 분석용
프라이머
세트를 이용한 동물성 플랑크톤의 DNA 증폭
DNA 증폭 시, 전체 동물성 플랑크톤 중 특정 종의 과다 증폭 및 억제를 방지하기 위하여, 1차 및 2차 증폭으로 나누어 수행하였다.
구체적으로, 1차 증폭은 서열번호 1 및 2로 표시되는 CO1NGSF1 및 CO1NGSR1 프라이머를 이용하여 수행하였다. 구체적으로, PCR 반응액은 1μg의 동물 플랑크톤의 DNA 샘플, 2μl의 CO1NGSF1(서열번호 1) 및 CO1NGSR1(서열번호 2) 프라이머(200pM), 4μl의 dNTPs (10 mM), 0.4μl의 Ex Taq Hot Start Version (2U)(Takara Bio Inc. Japan), 4μl의 10X buffer 및 멸균 증류수를 혼합하여 총 40μl으로 맞추어 이용하였다. PCR은 총 15회 반복하고 하기와 같은 조건으로 수행하였다: 초기 변성(initial denaturation)은 94℃에서 3분; 변성은 94℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72℃에서 30초씩 20회 반복 수행; 최종 연장은 72℃에서 3분간 수행. PCR 산물은 AccuPrep® Gel Purification Kit(Bioneer, Republic of Korea)를 이용하여 정제한 후, 20μl의 용해 버퍼로 용해하였다.
2차 증폭은 상기 표 1의 서열번호 3 및 4로 표시되는 CO1NSGF2 및 CO1NGSR2 프라이머를 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 2μg의 상기 1차 증폭의 PCR 산물을 정제한 후 얻은 용해 버퍼, 2μl의 CO1NSGF2(서열번호 3) 및 CO1NGSR2(서열번호 4) 프라이머(200pM), 4μl의 dNTPs (10 mM), 0.4μl의 Ex Taq Hot Start Version (2U)(Takara Bio Inc. Japan), 4μl의 10X buffer 및 멸균 증류수를 혼합하여 PCR 반응액을 총 40μl으로 맞추어 이용하였다. PCR은 총 20회 반복하고 반복 횟수를 제외한 PCR 조건은 1차 PCR 증폭과 동일하게 수행하였다. 그 후, 전기영동 장치를 이용하여 PCR 산물의 사이즈를 선별하여 PCR 과정 중 변성 단계에서 생긴 비 표적 유전자를 제거하였다. 예상되는 사이즈(약 500 bp)를 포함하는 증폭 산물(Amplicons)을 an AccuPrep® Gel Purification Kit(Bioneer, Republic of Korea)를 이용하여 정제하였다. 그 후 정제된 증폭 산물은 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA)을 이용하여 정성 및 정량 분석하였다.
3-2. DNA 라이브러리 구축 및
Illumina
Miseq
seruencer
를 이용한 서열 분석
DNA 라이브러리는 TruSeq® Sample Preparation kit V2 (Illumina, USA)를 이용하여 제작하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3-1의 동물성 플랑크톤 DNA(약 500bp)을 포함하는 증폭 산물(Amplicons)에 대한 말단-복구(End-repair)를 수행한 후, DNA 단편의 각 3'말단에 단일 A 염기를 삽입하였다, 그 후, 어댑터 라이게이션(Adaptor ligation)을 통하여 다른 인덱스(index)를 지닌 어댑터를 5＇과 3＇말단에 붙여 한번에 24개 샘플을 시퀀싱할 수 있도록 하였다. PCR 강화(PCR enrichment) 후 샘플의 농도를 일정하게 맞추었다. 이후, 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA)를 이용하여 라이브러리 정량을 확인하였고, 시퀀싱은 Illumina Miseq(2 * 300 bp pair-ends)을 이용하여 동물성 플랑크톤의 DNA 서열 분석을 수행하였다.
실시예
4. 데이터 분석을 통한 동물성 플랑크톤의 분석
상기 실시예 3에서 Illumina Miseq sequencer를 이용하여 얻은 데이터 중 어댑터/인덱스 및 QV 20 미만 서열은 CLC Genomics Workbench v8.0(CLC Bio, USA)를 이용하여 잘라내었다(도 3). Mothur software package v1.35.0(Schloss, Westcott et al. 2009)을 이용하여 6 bp를 초과하는 오버랩핑(overlapping) 서열 및 오버랩핑 서열에 미스매치가 없을 시에만 정방향 및 역방향으로 조립하였다. 조립 서열(contig)은 pdiffs=1 및 keepprimer 옵션 조건으로 Mothur software package v1.35.0을 이용하여 조립 서열 내의 잘 보존된 아미노산 염기서열의 IUPAC codes를 통해서 5' 및 3' 지역을 잘라내었다. 바코드 데이터와 본 연구에 의해 생성된 조립 서열 간의 오버랩핑 서열은 약 320 bp이기 때문에, 바코드 데이터 베이스에 본 발명의 조립 서열들을 BLASTn search를 수행하였다. 구체적으로, 각 잘려진 서열(약 320 bp)에 대한 동물성 플랑크톤의 종 배열은 The Barcode of Life Data system (BOLD)(Ratnasingham and Hebert 2007)에서 얻어지고 변형된 COI 데어터를 기반으로 하여 BLASTn search (상동성 = 97%) 결과를 이용하여 측정하였다. 시퀀싱 데이터 프로세스 및 비-잘려진 COI 데이터를 삭제하면서 COI 데이터의 3백만개 이상은 조립 서열의 프로세스와 동일한 방법으로 5' 및 3' 지역을 제거(trimming)하여 약 320 bp로 변형하였다. 길이가 314bp에서 323bp인 조립 서열만이 BLASTn search에 사용되었고, 상동성이 97% 미만인 BLASTn 검색 결과가 나타나면, 그 서열은 "기타"로 표기하였다. 그 결과를 도 4 내지 도 11 및 표 2에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 동물성 플랑크톤의 분류군을 분석한 결과 상동성이 97% 이상으로 확인 된 조립 서열이 약 180여 종임을 확인하였다
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 주요 동물성 플랑크톤의 문(phylum)의 비율을 분석한 결과, 총 1,525,394 조립 서열이 분리되고 분류학적 분류로서 8 문(환형 동물문, 절지 동물문, 태형 동물문, 모악 동물문, 척삭 동물문, 자포 동물문, 극피 동물문(Echinodermata) 및 연체 동물문)이 포함됨을 확인하였다. 절지 동물문이 51% 이상이며, 태형 동물은 거의 0%임을 확인하였다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 종래의 형태학적 특징으로 분석된 동물성 플랑크톤 분석 결과와 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 분석한 결과를 비교하였다. 그 결과, 동물성 플랑크톤 집단을 주로 구성하는 것은 절지동물(arthropod), 특히 요각류(copepods)임을 확인하였으며, 전체 비율은 약간의 차이가 있으나 형태학적 분석과 유사하였다. 따라서, 본 발명의 동물성 플랑크톤 분석용 프라이머 세트를 이용한 분석은 형태학적 분석과 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다.
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 절지동물문(arthropoda)의 분석 결과, 절지동물문 중 특히 요각류가 85%로 가장 높은 비율로 존재함을 확인하였다. 또한, 난바다곤쟁이목(euphausiacea)이 7%, 새각목(Branchiopoda)이 3% 및 십각목(decapods)이 3.28%임을 확인하였다.
또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 극피 동물문의 다양한 분류 비율을 확인한 결과, 거미불가사리강(Ophiuroidea), 성게강(Echinoidea) 및 불가사리강(Asteroidea)과 같은 주요 3 강이 포함됨을 확인하였다.
또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 멸치(Engraulis japonicas)의 12,106개의 조립 서열을 분석한 결과, 총 18개의 단상형(haplotype)이 있음을 확인하였다. 이 중, Ej-E6 및 Ej-E15는 다른 멸치속(Engraulis)과 근접하게 관련되는 것으로 보이는 다른 종인 것으로 확인하였다.
또한, 도 10 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 멸치의 단상형을 분석한 결과, 주요 단상형의 약 80%이상이 Ej-E1(23%), Ej-E2(23%), Ej-E3(23%), Ej-E4(23%) 및 Ej-E(23%)이며, 나머지 13개의 단상형은 약 20%임을 확인하였다.
또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 프라이머 세트를 이용하여 살오징어(Todarodes pacificus) 위 내용물에 대한 분류군을 152,457개의 조립 서열로 분석한 결과, 약 50%가 농어목(Perciformes)임을 확인하다. 또한, 약 44%가 살오징어목(Teuthida) 인 것으로 확인하였으며, 나머지는 6%는 청어목(Clupeiformes), 숭어목(Mugiliformes), 복어목 (Tetraodontiformes) 등임을 확인하였다.
<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation
<120> The primer set for analysis of zooplankton taxa and method of
analyzing thereof
<130> 1-37
<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CO1NGSF1 primer
<400> 1
atnggnggnt tyggnaa 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CO1NGSR1 primer
<400> 2
ggnggnttyg gnaaytg 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CO1NGSF2 primer
<400> 3
tanacytcng grtgncc 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CO1NGSR2 primer
<400> 4
ggrtgnccra araayca 17
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> CO1NGSF1
<400> 5
Met Gly Gly Phe Gly Asn
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> CO1NGSF1
<400> 6
Ile Gly Gly Phe Gly Asn
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> CO1NGSR1
<400> 7
Gly His Pro Glu Val Tyr
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213>
CO1NGSF2
<400> 8
Gly Gly Phe Gly Asn Trp
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213>
CO1NGSR2
<400> 9
Trp Phe Phe Gly His Pro
1 5
Claims (9)
- 서열번호 1 및 2; 및, 서열번호 3 및 4;로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 서열번호 5 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열을 기반으로 하여 이를 코딩하는 염기서열로 디자인한 것을 특징으로 하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 기반으로 하여 이를 코딩하는 염기서열로 디자인한 것을 특징으로 하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 기반으로 하여 이를 코딩하는 염기서열로 디자인한 것을 특징으로 하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 기반으로 하여 이를 코딩하는 염기서열로 디자인한 것을 특징으로 하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물. - 제2항 내지 제5항에 있어서,
상기 서열번호 5 내지 9로 표시되는 아미노산 서열은 미토콘드리아 시토크롬 산화효소 I(mitochondrial cytochrome oxidase I, COI) 단백질인 것을 특징으로 하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 동물성 플랑크톤은 환형 동물문(Annelida), 절지 동물문(Arthropoda), 모악 동물문(Chaetognatha), 태형동물문(Bryozoa), 모악동물문(Chaetognatha), 모악동물문(Chordata), 자포동물문(Cnidaria), 유즐동물문(Ctenophora), 극피동물문(Echinodermata), 연체동물문(Mollusca), 선형동물문(Nematoda), 해면동물문(Porifera), 완족동물문(Tardigrada), 진와충동물문(Xenacoelomorpha), 구두동물문(Acanthocepha), 무장동물문(Acoelomorpha), 완족동물문(Brachiopoda), 구륜동물문(Cycliophora), 능형동물문(Dicyemida), 내항동물문(Entoprocta), 복모동물문(Gastrotricha), 약구동물문(Gnathostomulida), 반삭동물문(Hemichordata), 동문동물문(Kinorhyncha), 동갑동물문(Loricifera), 미악동물문(Micrognathozoa), 유선형동물문(Nematomorpha), 유형동물문(Nemertea), 유조동물문(Onychophora), 직유동물문(Orthonectida), 추형동물문(Phoronida), 판형동물문(Placozoa), 편형동물문(Platyhelminthes), 해면동물문(Porifera), 새예동물문(Priapulida), 윤형동물문(Rotifera), 성구동물문(Sipuncula), 방산충류(Radiolarida), 유공충류(foraminiferans), 청어류(herrings), 어란(fish egg), 치어(the young of fishes) 및 유생(larva)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 조성물. - 제1항의 조성물을 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석용 키트.
- (a) 동물성 플랑크톤의 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 (a)의 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2으로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 1차 증폭을 수행하는 단계;
(c) 상기 (b)의 증폭 산물을 주형으로 하고 서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 2차 증폭을 수행하는 단계; 및
(d) 상기 (c)의 증폭 산물에 대한 서열을 분석하고 동물성 플랑크톤을 분석하는 단계;를 포함하는 동물성 플랑크톤의 분류군(taxa) 분석 방법.
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2015
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