CN110511977A

CN110511977A - 基因组dna的提取方法、测序方法及试剂盒

Info

Publication number: CN110511977A
Application number: CN201910836168.9A
Authority: CN
Inventors: 刘晨; 黄金; 周荣芳; 周晏秋; 吴传文; 田志坚
Original assignee: Wuhan Huada Gene Technology Service Co Ltd
Current assignee: Wuhan Huada Gene Technology Service Co Ltd
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2019-11-29
Anticipated expiration: 2039-09-05
Also published as: CN110511977B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基因组DNA的提取方法、测序方法及试剂盒。所提供的提取方法包括(1)将待测样本和第一溶液混合，进行冷冻研磨，获得研磨样本，所述第一溶液包括异硫氰酸胍和巯基乙醇；(2)将所述研磨样本和第二溶液混合，提取、分离获得含有DNA的产物，所述第二溶液含有CTAB；(3)利用蛋白酶和RNA酶对所述含有DNA的产物进行消化处理，以便去除所述含有DNA的产物中的蛋白质和RNA；(4)对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理，以便获得所述基因组DNA。应用该方法可以获得纯度高的DNA，所获得DNA满足三代测序的需求。

Description

基因组DNA的提取方法、测序方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基因组DNA的提取方法、测序方法及试剂盒。

背景技术

土壤微生物群落是一个巨大的、相对未被开发的基因组多样性和代谢创新宝藏，它与陆地生态系统中的营养和能量流动密切相关。与栽培无关的环境基因组学，也被称为元基因组学，这种方法有望在高价值的治疗和生物量转化过程的通路重建和功能筛选方面获得前所未有的遗传信息。然而，由于难以获得足够高质量的高分子量DNA用于大规模插入文库的生产，土壤微生物群落仍然是一个挑战。

近年来，高通量测序技术突飞猛进，极大地推动了全基因组测序工作的展开，全球已有数万种植物、动物及微生物完成了全基因组测序工作。第三代测序技术凭借着片段读长更长的优势在基因组研究中得到广泛应用。其中基于单分子蛋白纳米孔基因测序技术是新一代单分子实时测序技术，无需PCR，无需DNA合成，以单分子DNA(RNA)通过生物纳米孔的电流变化来确定其碱基组成。在充满电解液的腔内，带有纳米级小孔的绝缘防渗膜将腔体分成2个小室，当电压作用于电解液室，离子或其他小分子物质可穿过小孔，形成稳定的可检测的离子电流。掌握纳米孔的尺寸和表面特性、施加的电压及溶液条件，可检测不同类型的生物分子。

由于组成DNA的四种碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的分子结构及体积大小均不同，单链DNA(ssDNA)在核酸外切酶的作用下被迅速逐一切割成脱氧核糖核苷酸分子，当单个碱基在电场驱使下通过纳米级的小孔时，不同碱基的化学性质差异导致穿越纳米孔时引起的电流的变化幅度不同，从而得到所测DNA的序列信息。样品主要要求指标为：样品溶液澄清无色，无不可溶解物质；电泳主带清晰，轻度降解，无蛋白、多糖及小片段污染，无RNA污染；样品A260/A280在1.8～2.0之间，A260/A230在2.0～2.2之间；样品NanoDrop所测浓度与Qubit所测浓度比值≤1.5；样品DNA总量≥10μg。

土壤DNA目前已有的基因组仅限于第二代测序方法，植物的基因组DNA溶液含有大量色素，A260/230始终偏低，无法满足下游建库的要求。因此，特别需要快速的收集方法以及高效的DNA提取方法来解决这些技术困难，满足第三代测序的要求。

由此，基因组DNA的提取方法还需要进一步改进，来满足第三代测序的需求。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种基因组DNA的提取方法、测序方法及试剂盒。

在对样本中的核酸提取，进行建库测序分析时，不同样本由于所含有的成分不同，在提取时会带来不同的难度。例如如果提取后的样本的DNA碎片较多，DNA片段的完整性不高，将不适宜进行三代测序。而从样本中所分离的基因组DNA的质量会影响到基因组文库的构建以及后续的测序结果。以土壤样本为例，在从土壤和/或其沉积物中提取高分子量、微生物群落基因组DNA的过程中，土壤中含有大量的色素等植物次生代谢产物，在提取基因组DNA的过程中很难去除。提取后DNA样本中含有的多糖多酚类的次生代谢产物，会对测序的酶反应的影响较高，所含有的色素也不利于高质量的文库的构建。而且通常为了获得高纯度的基因组DNA，需要利用酚、氯仿、异戊醇进行多次抽提，异丙醇沉淀，反复多次，操作复杂，而且用时很长。在一遍遍抽提纯化的过程中，使得DNA的提取得到很低，这样可能导致样本不能满足三代测序的最低起始量。同时如果所使用的有机物去除不彻底，残留在DNA中，也会影响到DNA的纯度和质量。因此，对于基因组DNA的提取方法或者提取工艺还需要进一步改进。

本发明提供了一种基因组DNA的提取方法，该方法在对待测样本进行裂解时，采用含有异硫氰酸胍和巯基乙醇的变性液以及研磨处理，使得细胞的细胞壁和细胞膜受到机械(研磨)和化学处理从而裂解，裂解充分完全。然后利用含有CTAB的提取液提取分离基因组DNA，以保持高分子量基因组DNA的完整性。在去除蛋白质和RNA之后，纯化获得基因组DNA，所获得的基因组DNA，能够保持较好的完整性。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种基因组DNA的提取方法，包括：(1)将待测样本和第一溶液混合，进行冷冻研磨，获得研磨样本，所述第一溶液包括异硫氰酸胍和巯基乙醇；(2)将所述研磨样本和第二溶液混合，提取、分离获得含有DNA的产物；(3)利用蛋白酶和RNA酶对所述含有DNA的产物进行消化处理，以便去除所述含有DNA的产物中的蛋白质和RNA；(4)对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理，以便获得所述基因组DNA。

本发明所提供的基因组DNA的提取方法，其利用含有异硫氰酸胍、巯基乙醇的第一溶液对待测样本进行裂解和冷冻研磨，使得待测样本的细胞壁和细胞膜受到机械和化学处理，发生细胞裂解。然后利用含有CTAB的第二溶液进行提取处理，分离获得含有DNA的产物，利用蛋白酶和RNA酶去除其中的蛋白质和RNA，对所获得的产物进行纯化处理，所获得的基因组DNA，分子量具有很高的完整性，例如可以实现30M以上完整的DNA片段长度的筛选。而且DNA纯度高，含有的蛋白质和RNA杂质很少，以A260/A280和A260/A230测定结果为例，A260/A280在1.8～2.0之间，A260/A230在2.0～2.2之间，能够满足第三代测序的建库需求和测序需求。

根据本发明的实施例，以上所述基因组DNA的提取方法可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述第一溶液中所述异硫氰酸胍的使用浓度为3M～5M，优选为4M。第一溶液中异硫氰酸胍的使用浓度在3M～5M时，尤其是3.5M～4.5M之间时，所提取获得的基因组DNA的浓度A260/A280在1.8～2.0之间，A260/A230在2.0～2.2之间，DNA中所含有的蛋白质杂质和RNA杂质很少，纯度高，满足三代测序的需求。

在本发明的一些实施例中，所述第一溶液还包括Tris-HCl和EDTA。

在本发明的一些实施例中，步骤(4)中所述纯化处理包括：采用含有磁珠的混合液对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理。通常在对所获得的DNA进行纯化时，采用酚、氯仿和异戊醇进行抽提，异丙醇进行沉淀，这种处理方法操作复杂，使用时间长，而且如果所用到的有机物去除不太彻底，会引起核酸纯度不够。通过含有磁珠的混合物对DNA进行纯化处理，能够有效获得高质量大片段的DNA，而且操作时间短，例如6小时就可以完成纯化处理过程，所获得的DNA纯度高，满足第三代建库和测序的需求。

在本发明的一些实施例中，所述含有磁珠的混合液包括磁珠和磁珠缓冲液，所述磁珠缓冲液包括PEG8000和缓冲盐。

在本发明的一些实施例中，所述磁珠缓冲液中PEG8000的使用浓度为10％～20％，优选为15％。PEG8000的使用浓度过高时，所获得的测序文库的出库量较高，但是由于PEG8000的浓度高，会吸附一些小片段，对测序的N50值会产生一些影响。PEG8000的使用浓度过低时，能够得到较长的DNA片段，即得到较长的N50值，但是测序文库的出库量较小。磁珠缓冲液中PEG8000的使用浓度在10％～20％时，所提取的DNA进行建库测序，能够拥有较好的出库量以及较长的片段。

在本发明的一些实施例中，所述磁珠缓冲液包括PEG8000，氯化钠，Tris-HCl，EDTA和吐温20。由此可以获得较长的DNA片段以及高的测序出库量。

在本发明的一些实施例中，步骤(2)中所述第二溶液还包括磷酸盐缓冲液，Tris-HCl、EDTA、盐和SDS。

在本发明的一些实施例中，所述待测样本选自土壤、酵母、石蜡包埋样本、革兰氏阳性菌中的至少一种。本发明所提供的基因组DNA的提取方法适合于在复杂样本中提取获得基因组DNA，尤其是一些富含糖类、多肽以及色素类物质的样本中提取获得基因组DNA。以土壤样本为例，通过本发明所提供的方法可以在保证核酸样品完整度的情况下最大可能的去除土壤样本中的盐离子及多糖多酚，保证提取之后的建库上机的成功率。能大幅度缩短土壤微生物提取的时间，并将单样本提取成本降低至0.2美元，较传统方法节约30％成本。并得到较好的结果。其中相同的样本得率能提升30％。测序读长及读长提升15％。当当然该方法还适合于酵母、石蜡包埋样本、革兰氏阳性菌样本中基因组DNA的提取。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种对测序样本进行测序的方法，包括：基于本发明第一方面任一实施例所述的方法提取所述待测样本中的基因组DNA，基于所述基因组DNA，构建测序文库，测序。

在本发明的一些实施例中，利用第三代测序技术进行所述测序。第三代单分子DNA测序技术提供了更长的读取长度，可以促进复杂基因组的组装和复杂结构变异的分析。以纳米孔平台为例，通过直接测量通过小孔的DNA介导的电流变化来进行单分子测序，可以以最小的成本产生数百kb的读取量。应用本发明所提供的方法能够保持高分子量基因组DNA的完整性，获得较长的DNA片段，从而可以利用纳米孔测序平台，实现更长的测序读取长度。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种试剂盒，包括：第一溶液，所述第一溶液包括异硫氰酸胍和巯基乙醇；第二溶液，所述第二溶液含有CTAB；磁珠和磁珠缓冲液，所述磁珠缓冲液包括PEG8000和缓冲盐。

在本发明的一些实施例中，所述第一溶液进一步包括：Tris-HCl、和EDTA。

在本发明的一些实施例中，所述磁珠缓冲液进一步包括氯化钠，Tris-HCl，EDTA和吐温20。

在本发明的一些实施例中，所述第二溶液进一步包括：磷酸盐缓冲液，Tris-HCl、EDTA、盐和SDS。

由本发明所提供的试剂盒对待测样本中的基因组DNA进行提取，可以实现高纯度的DNA提取，去除多糖多酚色素等植物次生代谢产物。实现样品A260/A280在1.8～2.0之间，A260/A230在2.0～2.2之间。较传统的琼脂糖凝胶的方法提取，得到能够提升40％，可实现低起始量的三代建库测序。而且该试剂盒能够稳定地从待测样本中提取DNA，能够提取微克级的高分子量基因组DNA(gDNA)，长度高达150kb。每个样本在单管中操作只需60分钟，成本低于0.20美元。而且从收集的细胞沉淀开始，进行高分子量(HMW)DNA提取。对于一个训练有素的本领域的技术人员来说，通常从细胞收集到完成HMW DNA提取需要6个小时。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，以下所描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提供了一种基因组DNA的提取方法，包括：(1)将待测样本和第一溶液混合，进行冷冻研磨，获得研磨样本，所述第一溶液包括异硫氰酸胍和巯基乙醇；(2)将所述研磨样本和第二溶液混合，提取、分离获得含有DNA的产物，所述第二溶液含有CTAB；

(3)利用蛋白酶和RNA酶对所述含有DNA的产物进行消化处理，以便去除所述含有DNA的产物中的蛋白质和RNA；(4)对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理，以便获得所述基因组DNA。

在本发明的至少一些实施方式中，所述第一溶液除异硫氰酸胍、2-巯基乙醇之外，还包括Tris-HCl和EDTA，其中所述2-巯基乙醇和所述第一溶液中其他成分至少分开放置，所述2-巯基乙醇可以在使用之前加入。在至少一些实施方式中，所述第一溶液包括3～5M异硫氰酸胍、0.01～0.05M的Tris-HCl、0.001～0.005M的EDTA和巯基乙醇。需要说明的是，第一溶液中各成分所示出的浓度代表在提取基因组DNA时，溶液的使用浓度。这也就是说，在第一溶液中各成分也可以按照其他浓度进行配制，例如是所示出的各浓度的倍数进行配制，然后在具体使用时，稀释到相应的浓度即可。另外，所述2-巯基乙醇和所述第一溶液中的其他成分至少分开放置，意思是2-巯基乙醇可以在使用之前再和第一溶液中的其他成分混合。但是这也并不意味着第一溶液中的其他成分必须要混合在一起放置，本领域技术人员可以根据需要，将第一溶液中的其他成分分开放置或者任意几种混合放置。

在本发明的一些实施方式中，所述第二溶液除含有CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)之外，还含有磷酸盐缓冲盐、Trsi-HCl、EDTA、盐和SDS。其中SDS的使用浓度可以在20％左右，所述CTAB的使用浓度可以在5％左右，SDS和CTAB可以在使用之前加入。也就是说，CTAB和SDS与第二溶液中的其他成分分别分开放置。同样地，这并不意味着第二溶液的其他成分必须要混合放置，本领域技术人员可以根据需要，混合或者任意成分混合放置。这些其他成分可以是磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、Tris-HCl、EDTA和氯化钠。

在本发明的一些实施方式中，所述提取包括将所述研磨样本和所述第二溶液在50～70摄氏度下提取20～80分钟。由此可以提取获得含有DNA的产物。在利用第二溶液对研磨样本中的核酸进行提取的过程中，可以在55～65摄氏度条件下，例如可以在60摄氏度温度下提取，或者在65摄氏度条件下提取。而且可以视情况，提取两次或者两次以上。

在将研磨样本和第二溶液混合后，在50～70摄氏度条件下提取20～80分钟后，可以离心的方式对提取产物进行分离，获得含有DNA的产物。

在本发明的至少一些实施方式中，所述RNA酶可以是RNase A，所述RNA酶的使用浓度可以为0.01mg/ml～0.3mg/ml，例如可以是0.01mg/ml～0.2mg/ml，0.01mg/ml～0.15mg/ml，0.05mg/ml～0.1mg/ml等浓度。由此可以有效去除RNA杂质。

在本发明的至少一些实施方式中，所述蛋白酶为蛋白酶K，所述蛋白酶K的使用浓度可以为0.1mg/ml～2.5mg/ml，例如可以为0.1mg/ml～2mg/ml，0.5mg/ml～2mg/ml，0.5mg/ml～1mg/ml等浓度。由此可以有效去除蛋白质。

在利用蛋白酶和RNA酶去除所述含有DNA的产物中的蛋白质和RNA时，可以先将RNA酶和所述含有DNA的产物混合，在37摄氏度条件下孵育1～2小时。然后将孵育后的产物中加入蛋白酶K，在45～55摄氏度条件下孵育1～2小时，进行消化处理。在本发明的至少一些实施方式中，对于经过蛋白酶和RNA酶混合孵育后的产物，可以利用酚、氯仿和异戊醇的混合溶液进行抽提，以便去除所述含有DNA的产物中的蛋白质和RNA。所用到的酚可以为苯酚，酚、氯仿和异戊醇的体积比可以为25:24:1。通过酚使得蛋白质变性，同时抑制DNase的降解作用，氯仿能够去除产物中的残留酚，而异戊醇可以降低表面张力，减少气泡产生，而且有利于通过离心去除不含有DNA的相。

在本发明的至少一些实施方式中，利用含有磁珠的混合液对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理。所述含有磁珠的混合液包括PEG8000和缓冲盐。在至少一些实施方式中，所述含有磁珠的混合液含有PEG8000、氯化钠、Tris-HCl、EDTA和吐温20。其中PEG8000的质量浓度可以为10％～20％，由此可以获得高质量的DNA。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。其中在下述实施例中，结合第一溶液和第二溶液所发挥的主要功能，第一溶液被称为变性液，第二溶液被称为提取液。

实施例1

实施例1提供了一种从土壤样本中获取微生物群落基因组DNA的方法，所用到的土壤样本为田间采集的土壤，应冻在干冰上运输，储存于-80℃。实验之前，可以根据实验需要，对所需要用到的实验工具进行前处理，对实验试剂进行配制。

具体包括如下步骤：

1、样本裂解

1)用2mm的筛子将土壤解冻并筛分。然后取2g土壤样本到预冷的研钵中，可以根据提取效果将土壤的初始量增加到10克。

2)向土壤中加入1毫升变性液。

其中，变性液的配方如下表1所示：

表1变性液配方

异硫氰酸胍(分子量118.16)	4.73g
		1M Tris-HCl(pH 7.0)	100μl
0.5M EDTA	20μl

上述表1中的配方利用水定容至10ml，高压灭菌。在使用前加入50μl 2-巯基乙醇。

注意：在4℃保存变性液。不要使用超过一周的试剂，尽量现用现配。

3)然后将土壤在液氮中冷冻研磨，直到土壤颗粒呈粉末状且均匀。重复两次。

4)用预冷的抹刀将土壤移至50ml锥形管中，研磨好的样本可以暂存于-80℃。

2、抽提DNA

(1)向研磨好的样本中加入9ml提取液。使溶液和土壤充分混合，在低速时进行短暂的涡旋。

注：为保证提取液混合均匀，使用前在60℃加热10-15分钟。在整个提取过程中，将其余的缓冲区保持在60℃。涡旋速度为8(10为最大值)。

其中所用到的提取液配方如下表2所示：

表2提取液配方

(2)在65℃杂交箱中孵育40分钟。培养过程中，以最低速度连续旋转试管，或每10分钟轻轻翻转试管一次。

注意：将试管水平放置于杂交箱中，使缓冲液能接触到大面积土壤。在孵育期间，溶液可能看起来有点粘稠。

(3)离心1800g，10-14℃，离心10分钟。

(4)将上清液倒入预冷的50ml锥形管中。

(5)重复提取土壤沉淀2次；

1)向土壤沉淀中加入5ml提取液，用1ml吸头轻轻搅拌，低速短暂涡旋。

注意：使用前先摇匀提取液。

2)在65℃杂交箱中孵育10分钟。

3)离心1800g，10-14℃，离心10分钟。在将上清液移入第(9)步试管中。

4)再次重复上两步

(6)加入0.02％RNase A(100mg/ml)，使用旋转板，非常轻柔地旋转混匀。在37℃孵育1小时。

(7)加入0.5％蛋白酶K(20mg/ml)，使用旋转板，非常轻柔地旋转混匀。在50℃孵育2小时。

(8)加入20ml酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，使用旋转板，非常轻柔地摇动含有收集的上清液(14-19ml)和酚-氯仿异戊醇的试管，速度为1.25rpm，持续10分钟。

注意：转移上清液时，注意不要干扰有机层(底层)。如果上清液太混浊，在上清液上重复一次氯仿-异戊醇萃取。

(9)制备2支50mL的凝胶管(MaXtract High Density tubes，Qiagen，129073)，在室温条件下，以1500g离心2分钟。

(10)将混匀的样品/本分混合溶液导入15)步的一个50ml凝胶管中。以3000g离心10分钟。

(11)将上清倒入新的50毫升试管中。加入10ml酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，混匀10分钟后，用第二支准备好的凝胶管重复步骤16)步一次。

(12)将水相转移到新的试管中。

3、沉淀获得DNA

下面针对不同得率，采用不同的沉淀方法来获得DNA，分别为：异丙醇沉淀法、Amicon Ultra-15超滤法和磁珠纯化法。

(1)使用异丙醇回收DNA

1)加入上清液体积0.6倍的异丙醇，将管子轻轻翻转几次，使其混合。

2)室温孵育30分钟。

3)离心16000g，20-25℃，20分钟。

注意：在试管上标出离心力的方向，以便在DNA产率较低时更容易检测到DNA沉淀。

4)倒出异丙醇，注意不要干扰DNA沉淀。

注：DNA颗粒的大小因土壤类型而异，从清晰可见(直径约9毫米)到几乎不可见。建议沿管壁仔细吸除异丙醇残留，以免吸出DNA沉淀。

5)室温干燥5-20分钟。

注意：不要过度干燥，否则会使DNA难以再溶解。

6)加入200μl TE溶液重悬DNA沉淀，轻轻弹匀。将试管放置4℃过夜，以便完全溶解DNA。然后将DNA溶液转移到1.5ml试管中。

注意：可以根据沉淀的大小调整TE的体积，通常为200-400μl。

(2)使用Ultra-15超滤管

若预计产量非常低，那么异丙醇沉淀法将很难产生肉眼可见的颗粒，而且很难回收。可采用如下方法：

1)预洗Ultra-15超滤管；加入15ml TE，以3500g离心10分钟，废弃滤液。

2)将步骤(12)的上清液加入预洗过的Ultra-15离心过滤管。3500g离心，直到DNA体积减少到200-500μl，废弃滤液。

3)用TE清洗DNA两次：向Ultra-15超滤管中添加10ml TE。3500g离心，直到DNA体积减少到200μl，废弃滤液。重复一遍本步骤。

4)将过滤管中的DNA溶液转移到1.5ml的新试管中。

5)添加40μl TE到Ultra-15超滤管中，上下冲洗滤膜的两侧，以便回收滤膜上的任何DNA残留物。将此洗涤液加入步骤d的试管中。

6)如有必要，可采用Microcon Ultracel YM-30超滤管进一步浓缩DNA。

(3)磁珠纯化法

所用到的磁珠储存液配方如下：

1)将上清液转移到新的2ml管中，加入1倍体积的磁珠缓冲液和Serapure磁珠(磁珠与磁珠缓冲液的体积比为1:18)，其中所用到的磁珠为Sera-Mag SpeedBead磁性羧酸盐改良粒子。

其中所用到的磁珠缓冲液配方如下表3所示：

表3磁珠缓冲液

PEG 8000	质量浓度为15％
		NaCl	1M
Tris-HCl pH 8.0	10mM
		EDTA pH 8.0	1mM
Tween 20	0.05％

2)颠倒混匀20次。在室温下旋转混匀10分钟。

3)瞬时离心1秒钟。将试管放在磁力架上静置5分钟(直到溶液变清)。收集珠子的实际时间可能会根据样品的不同而有所不同。

4)去掉上清液，不要扰动磁珠，加入1ml洗涤液(即70％的乙醇)，将试管从磁架上取下，颠倒混匀20次。

5)瞬时离心1秒钟。将试管放在磁力架上静置30秒(直到溶液变清)。

6)重复清洗1次。

7)瞬时离心1秒钟，去掉剩余的洗涤液。

8)打开盖子，让磁珠风干1分钟。

9)加入80μl预加热至50℃的洗脱缓冲液EB。

10)轻弹管子重悬磁珠。

11)瞬时离心1秒钟，将试管放在磁力架上静置5分钟(直到溶液变清)。

12)转移75μl洗脱的gDNA至新的离心管中。

4、检测DNA

1)对DNA进行定量：Qubit、Nanodrop测定DNA的浓度。

2)对应样本的FA结果。

3)对应样本建库、利用纳米孔测序平台平行上机测序，确定相应的样本的质量产量。

实验结果如下：

1、采用异丙醇沉淀法

核酸得率：以8g土壤样本投入量计算，所提取的核酸产量为0.52μg。

所提取的核酸的OD 260/230值为1.343，OD280/260为2.012。

上机N50测定值为:3023bp。

2、采用Amicon Ultra-15超滤法

核酸得率：以8g土壤样本投入量计算，所提取的核酸产量为0.92μg，可见采用该方法所获得的核酸的得率较异丙醇沉淀法较好。

经测定，所提取的核酸的OD 260/230值为1.832，OD280/260为1.893。

上机N50测定值为:4302bp。

3、采用磁珠纯化法

核酸得率：以8g土壤样本投入量计算，所提取的核酸产量为0.94μg。

所提取的核酸的OD 260/230值为1.845，OD280/260值为1.904。

上机N50测定值为:5123bp。

从以上测定结果不难看出，采用磁珠纯化方法纯化，来获取DNA，无论是相较于异丙醇沉淀法，还是相较于Amicon Ultra-15超滤法，所获得的核酸片段长度更长，而且核酸纯度更高，所含有的RNA或者蛋白质杂质均很少。

实施例2

实施例2研究了采用含有不同异硫氰酸胍浓度的变性液对土壤样本进行裂解处理，对应所获得的DNA的影响。

实验过程如下：将同一土壤样本分为11份，每份对应一个浓度的含有异硫氰酸胍的变形液，参照实施例1所提供的实验步骤提取DNA(其中通过磁珠纯化的方法来沉淀DNA)。同时为了观察可重复性，每份样本在进行处理时，进行8个平行实验。然后采用Nanodrop对所获得的DNA浓度进行测定。

其中，所用到的含有不同异硫氰酸胍浓度的变性液如表4所示，变性液中异硫氰酸胍的使用浓度分别为1M，1.5M，2M，2.5M，3M，3.5M，4M，4.5M，5M，5.5M，6M，同时含有Tris-HCl(pH 7.0)100μl，0.5M EDTA 20μl定容至10ml，高压灭菌，使用前分别加入50μl 2-巯基乙醇。

其中采用Nanodrop对所获得的DNA的260/280nm以及260/230nm结果测定如下表5所示。其中表5中的重复1～重复8代表8个平行实验。

表4含有不同异硫氰酸胍浓度的变性液

表5不同实验对应的ND260/280以及ND260/230值

从Nanodrop(260nm/280nm)结果可以看出，变性液中异硫氰酸胍的浓度过低时，所处理得到的DNA有蛋白质污染，异硫氰酸胍的浓度过高时，会引起RNA污染。

当变性液中含有异硫氰酸胍浓度为3.5M、4M、4.5M，5M时，所获得的Nanodrop(260nm/280nm)为1.80左右，Nanodrop(260nm/230nm)在2.0左右。由于Nanodrop(260nm/280nm)反应了样本中DNA的纯度，数值低了会有蛋白糖类污染。蛋白糖类污染会直接影响到测序过程中蛋白孔的活力，从而影响测序的读长及质量产量。而数值过高反映样本中有RNA污染。从测序数据上看，在这样的浓度配比条件下其测序过程的产量读长都在较好水平。尤其是异硫氰酸胍浓度为4M时，DNA的提取质量好。

实施例3

实施例3研究了在利用磁珠优化的过程中，调整含有磁珠的混合液中PEG浓度改变，对于测序质量的影响。实验过程如下：

取土壤样本，分成11份，每份样本分别对应含有不同质量浓度PEG的磁珠缓冲液(4％，5％，15％，19％，23％，28％，31％，33％，35％，38％，42％，如表6所示)，参照实施例1给出的方法提取DNA。其中为了验证实验的可重复性，每份样本在进行处理时，进行8个平行实验。

对所获得DNA的核酸量进行测定，所提取的核酸量结果如下表7所示。同时对所获得的DNA进行测序，所获得的测序平均N50结果如下表7所示，其中表7中重复1～重复8代表每份样本下的8个平行实验。

表6含有不同浓度的PEG的磁珠混合液

表7不同实验所获得的核酸量以及测序结果

从表7所示出的结果不难看出，采用较低的PEG浓度能得到较高的较长的片段，表现在测序中，在三代测序数据中能得到较长的N50数值，但所提取获得的核酸量较少。在较高的PEG浓度能提高所提取的核酸的量，但高浓度会吸附小片段，对测序N50值影响较大。当PEG的质量浓度为15％时，在这个浓度下，能够获得较多的核酸，同时能够获得较长的片段。

实施例4

实施例4研究了采用传统琼脂糖凝胶提取方法以及基于优化的异硫氰酸胍磁珠法对土壤样本进行提取，构建测序文库，测序，所获得的不同结果。其中传统琼脂糖凝胶提取方法是指在获得核酸DNA粗提产物后(即参照实施例1的方法，在进行步骤3沉淀获得DNA之前所获得的产物作为核酸DNA粗提产物)，不采用异丙醇沉淀法或者磁珠纯化法，而且将所获得的核酸DNA粗提产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶电泳中ladder的大小，对于大片段DNA进行切胶回收，通过该处理能够去除核酸DNA粗提产物中的污染和小片段核酸。基于优化的异硫氰酸胍磁珠法是指参照实施例1所提供的方法，所利用的变性液中异硫氰酸胍的使用浓度为4M，在进行磁珠纯化时，所使用的磁珠缓冲液中PEG8000的质量浓度为15％。

将实验土壤分成两份，每份对应不同的提取方法，同时为了验证实验的可重复性，每份样本进行8次平行实验。所获得的结果如下表8所示，其中表8中样本处理时间是指从开始对土壤样本进行裂解处理到提取获得基因组DNA的时间。

表8不同方法所获得的不同结果

从上表8所给出的结果不难看出，本发明所提供方法较传统的琼脂糖凝胶的方法的得率提升40％，可实现低起始量的三代建库测序。而且采用本发明所提供的方法能够提取微克级的高分子量基因组DNA(gDNA)，长度高达150kb。每个样本在单管中操作只需60分钟，成本低于0.20美元。

另外，我们所提供的方法从对土壤样本进行裂解处理开始，一直到获得高分子量(HMW)的高纯度的DNA，对于一个训练有素的本领域的技术人员来说，仅需要6个小时，操作简单可控。相较于采用传统的琼脂糖凝胶的方法，能够有效避免繁琐的操作步骤以及费时和较高的成本。

本发明所提供的方法实现了适应三代测序长片段土壤DNA提取的得率和质量的提升，特别对于短片段及多糖多酚盐离子的去除有很好的效果。整体比较市面的土壤DNA提取试剂盒，这个方法较其他的方法，无论是在样本的得率还是测序读长等方面均有了很大的提升，例如采用相同的样本，采用本发明所提供的方法得率能提升30％，测序读长能够提升15％。

本文中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括：

(1)将待测样本和第一溶液混合，进行冷冻研磨，获得研磨样本，所述第一溶液包括异硫氰酸胍和巯基乙醇；

(2)将所述研磨样本和第二溶液混合，提取、分离获得含有DNA的产物，所述第二溶液含有CTAB；

(3)利用蛋白酶和RNA酶对所述含有DNA的产物进行消化处理，以便去除所述含有DNA的产物中的蛋白质和RNA；

(4)对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理，以便获得所述基因组DNA。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述第一溶液中所述异硫氰酸胍的使用浓度为3M～5M，优选为4M；

任选地，所述第一溶液还包括Tris-HCl和EDTA。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述纯化处理包括：采用含有磁珠的混合液对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理。

4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述含有磁珠的混合液包括磁珠和磁珠缓冲液，所述磁珠缓冲液包括PEG8000和缓冲盐。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述磁珠缓冲液中PEG8000的质量浓度为10％～20％，优选为15％；

任选地，所述磁珠缓冲液包括PEG8000，氯化钠，Tris-HCl，EDTA和吐温20。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述第二溶液还包括：

磷酸盐缓冲液，Tris-HCl、EDTA、盐和SDS。

7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述待测样本选自土壤、酵母、石蜡包埋样本、革兰氏阳性菌中的至少一种。

8.一种对测序样本进行测序的方法，其特征在于，包括：

基于权利要求1～7中任一项所述的方法提取所述待测样本中的基因组DNA，

基于所述基因组DNA，构建测序文库，测序；

任选地，利用第三代测序技术进行所述测序。

9.一种试剂盒，其特征在于，包括：

第一溶液，所述第一溶液包括异硫氰酸胍和巯基乙醇；

第二溶液，所述第二溶液含有CTAB；

磁珠和磁珠缓冲液，所述磁珠缓冲液包括PEG8000和缓冲盐。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述第一溶液进一步包括：Tris-HCl、和EDTA；

任选地，所述磁珠缓冲液进一步包括氯化钠，Tris-HCl，EDTA和吐温20；

任选地，所述第二溶液进一步包括：磷酸盐缓冲液，Tris-HCl、EDTA、盐和SDS。