CN101014707B

CN101014707B - 用阳离子去污剂清除和分离核酸的方法

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Publication number: CN101014707B
Application number: CN2005800238004A
Authority: CN
Inventors: T·辛格
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2004-07-15
Filing date: 2005-07-15
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2025-07-15
Also published as: CN101014707A; EP1771562B1; ATE396260T1; WO2006008090A2; JP2008506654A; US20080113348A1; DE502005004209D1; US8679744B2; EP1771562A2; JP4918037B2; DE102004034433A1; WO2006008090A3

Abstract

本发明涉及用具有通式(I)的阳离子去污剂清除和分离核酸的方法：Y⁺R¹R₂R₃R₄X^- (I)式中，Y可表示氮或磷R₁、R₂、R₃和R₄可独立表示直链或支链C₁-C₂₀-烷基、C₃-C₆-烯基、C₃-C₆-炔基和/或C₆-C₂₀-芳基以及C₆-C₂₆-芳烷基，和X^-可表示无机或有机一元或多元酸的阴离子。

Description

用阳离子去污剂清除和分离核酸的方法

本发明涉及用具有以下通式的阳离子去污剂清除和分离核酸的方法：

Y⁺R₁R₂R₃R₄X^- (I)

式中，

Y可表示氮或磷，

R₁、R₂、R₃和R₄可独立表示直链或支链C₁-C₂₀-烷基、C₃-C₆-烯基、C₃-C₆-炔基和/或C₆-C₂₀-芳基以及C₆-C₂₆-芳烷基，和

X^-可表示无机或有机一元或多元酸的阴离子。

优选的组合物中，阳离子化合物由铵盐构成，其中R₁表示高级烷基，优选具有12、14、16或18个碳原子，R₂、R₃和R₄各自表示甲基。

此外，优选的组合物中，R₁表示芳烷基，优选苄基，R₂表示有12、14或16个碳原子的高级烷基，R₃和R₄表示甲基。

作为一般的原则，C₁-C₆-烷基表示有1-6个碳原子的支链或直链烃基，如果需要可被一个或多个相同或各不相同的卤原子取代，所述卤原子优选氟。

以下是烃基的例子：

甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基(异丙基)、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基-丙基。

高级烷基表示支链或直链C₇-C₂₀-烷基，如果需要可被一个或多个相同或各不相同的卤原子取代，所述卤原子优选氟。以下是烃基的例子：支链或直链庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基和二十烷基。

作为一般的原则，C₃-C₆-烯基表示含有3-6个碳原子的有一个或者可能多个双键的支链或直链烃基，如果需要可被一个或多个相同或各不相同的卤原子取代，所述卤原子优选氟。

以下是所述烃基的例子：

2-丙烯基(烯丙基)、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1，1-二甲基-2-丙烯基、1，2-二甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1，1-二甲基-2-丁烯基、1，1-二甲基-2-丁烯基、1，1-二甲基-3-丁烯基、1，2-二甲基-2-丁烯基、1，2-二甲基-3-丁烯基、1，3-二甲基-2-丁烯基、1，3-二甲基-3-丁烯基、2，2-二甲基-3-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-3-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1，1，2-三甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-甲基-2-丙烯基和1-乙基-2-甲基-2-丙烯基。

作为一般的原则，C₃-C₆-炔基表示含有3-6个碳原子的有一个或者可能多个三键的支链或直链烃基，如果需要可被一个或多个相同或各不相同的卤原子取代，所述卤原子优选氟。

以下是所述烃基的例子：

2-丙炔基(炔丙基)、2-丁炔基、3-丁炔基、1-甲基-2-丙炔基、2-甲基-2-丙炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-甲基-2-丁炔基、2-甲基-2-丁炔基、3-甲基-2-丁炔基、1-甲基-3-丁炔基、2-甲基-3-丁炔基、3-甲基-3-丁炔基、1，1-二甲基-2-丙炔基、1，2-二甲基-2-丙炔基、1-乙基-2-丙炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、1-甲基-2-戊炔基、2-甲基-2-戊炔基、3-甲基-2-戊炔基、4-甲基-2-戊炔基、1-甲基-3-戊炔基、2-甲基-3-戊炔基、3-甲基-3-戊炔基、4-甲基-3-戊炔基、1-甲基-4-戊炔基、3-甲基-4-戊炔基、4-甲基-4-戊炔基、1，1-二甲基-2-丁炔基、1，1-二甲基-2-丁炔基、1，1-二甲基-3-丁炔基、1，2-二甲基-2-丁炔基、1，2-二甲基-3-丁炔基、1，3-二甲基-2-丁炔基、1，3-二甲基-3-丁炔基、2，2-二甲基-3-丁炔基、2，3-二甲基-2-丁炔基、2，3-二甲基-3-丁炔基、1-乙基-2-丁炔基、1-乙基-3-丁炔基、2-乙基-1-丁炔基、2-乙基-2-丁炔基、2-乙基-3-丁炔基、1，1，2-三甲基-2-丙炔基、1-乙基-1-甲基-2-丙炔基和1-乙基-2-甲基-2-丙炔基。

除非另有说明，芳基表示含有4-22个碳原子的芳族单环或多环基团，可含有一个或两个杂原子。例子有：苯基、萘基、蒽基和吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基或吡嗪基，如果需要可被一个或多个卤原子取代，所述卤原子优选氟，或者可被烷基独立取代一次或多次。

根据上述定义，芳烷基指通过C₁-C₆-烷基、C₃-C₆-烯基或C₃-C₆-炔基桥键结合到阳离子部分结构的单环或多环芳基，其中C₁-C₆-烷基、C₃-C₆-烯基和C₃-C₆-炔基具有相应的定义。出于本发明的目的，优选苄基。

优选的阴离子是溴离子、氯离子、磷酸根离子、硫酸根离子、甲酸根离子、乙酸根离子、丙酸根离子、草酸根离子或琥珀酸根离子。

分离核酸的方法是本领域熟知的。因此，根据本领域最确定的方法之一，从生物原料(如细胞和组织)分离DNA的方法是，在强变性和还原条件(部分还可使用蛋白质降解酶类)下溶解含有核酸的原料并通过透析法或乙醇沉淀法从含水相分离由此释放出的核酸[J.Sambrock、E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Cold Spring Harbor，″分子克隆(Molecular Cloning)″]。

这种方法的主要缺点在于，从细胞，尤其从组织分离核酸非常耗时，通常需要2天以上。此外，该方法需要非常昂贵的设备，且包括使用苯酚或氯仿之类会刺激皮肤或损害健康的物质。

出于这种情况，本领域早期开发了一些其它的方法，这些方法能避免上述核酸提取中出现的缺点。

所有这些方法都基于由Vogelstein和Gillespie建立并首次描述(Proc.Natl.Acad.Sci，USA，1979，76，615-619)的方法从琼脂糖凝胶上制备性及分析性清除DNA片段。该方法包括将含有待分离DNA条带的琼脂糖溶于离液序列高的(chaotropic)盐(NaJ)的饱和溶液，并使DNA结合到玻璃颗粒上。固定到玻璃颗粒上的DNA随后用洗涤溶液(20mM Tris HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)[pH 7.2]，200mM NaCl；2mM EDTA；50％v/v乙醇)洗涤，然后从载体颗粒上解吸。

迄今为止该方法已经过一系列改进，目前被用于不同起源核酸的不同的提取和清除方法中(Marko，M.A.、Chipperfield，R.和Birnboim，H.G.，Anal.Biochem.，121，(1982)382-387)。

因此，可购得许多用于进行这种类型核酸提取的试剂组合(所谓的试剂盒)。

这些几乎专门的市售试剂盒是基于充分熟知的核酸在存在不同离液序列高的盐的溶液和使用精细研磨的玻璃粉(例如Glasmilk，BIO 101，La Jolla，CA、二价碱土金属(Sigma)或者甚至硅胶(欧洲专利申请616 639)作为载体物质时能结合无机载体的原则。

Boom等已经描述了原则上可用于大量不同应用的分离核酸的方法[EP 389 063A1]。在该欧洲专利申请中，描述了通过将含有核酸的原料和DNA-结合固相的离液序列高的缓冲液一起孵育而从原料分离核酸的方法。离液序列高的缓冲液能裂解原料并使核酸结合固相。该方法也适合从小的样品量分离核酸，并且特别适合分离病毒核酸。

尽管由于可能难以裂解原料而造成的问题可通过一系列市售的分离核酸的产品(尤其是用于分离复合原料的基因组DNA时)解决，但他们的主要缺点在于，由于原料的裂解是在采用蛋白水解酶的常规缓冲液中进行的，因此这不再是以Boom等披露的上述方法为特征的经典的“单管法”。随后核酸结合到离心膜所需的离液序列高的离子，例如，必须在裂解完成时再加入裂解制品中。由于熟知离液序列高的盐的蛋白质破坏功能，且自然会立即破坏有效裂解所需的蛋白水解酶，因此无论何时它们都不能形成裂解缓冲液的一部分。

尽管有许多缺点，但用离液序列高的盐分离核酸的方法已被全世界认可并被广泛用于市售产品。这些系统使用非常简单，在所有情况下都按照以下程序使用：

·裂解原料，随后将核酸结合到位于离心柱内载体悬浮液上的玻璃或二氧化硅膜的固相上；

·洗涤结合的核酸，和

·用低离子强度缓冲液洗脱核酸；

所有这些系统都基于在存在离液序列高的盐，即存在至少一种以离液序列高的盐作为其主要组分的缓冲液时核酸与各载体表面的结合。某些情况下甚至可用于所述裂解缓冲液，或者在采用蛋白水解酶类的系统中用于必需的结合缓冲液(在裂解完成后加入原料)。

用来盐析出负电、中性或碱性蛋白质溶液的霍夫迈斯特序列形成了选择合适离液序列高的盐的基础。离液序列高的盐的特征在于能够使蛋白质变性、增加非极性物质在水中的溶解度、和破坏疏水相互作用。根据本领域的现状，仅这些特征也能破坏水环境与离液序列高的盐缓冲系统的叠加结构，促进核酸与所选固相的结合。最常见的分离核酸的试剂是高氯酸钠、碘化钠、碘化钾、异硫氰酸胍和盐酸胍。然而，它们一方面成本较高另一方面有一定程度的毒性或刺激性。

专家已经解释了存在离液序列高的盐时核酸结合无机载体的物理-化学原理。核酸与无机载体表面的结合在于破坏水环境的叠加结构，通过这样核酸就吸附到无机材料尤其是玻璃或二氧化硅颗粒表面。通常必需存在离液序列高的离子以破坏水环境的叠加结构。当离液序列高的盐的浓度高时，反应几乎定量进行。由于已经描述了这种物理-化学原理，就本领域现状可以假设，所有分离核酸的市售系统必须含有高离子强度的离液序列高的盐的缓冲组合物以将核酸结合到核酸结合固相。

此外，本领域还已知不使用离液序列高的物质或苯酚的合适的方法，这样可避免上述缺点。国际专利申请WO 00/034463公开了这种类型的从复合原料分离核酸的方法。在这些方法中，采用了含有至少一种离液序列低的盐组分并以所谓醇结合化学工作的裂解/结合缓冲系统(Invitek(柏林)制造的

质粒试剂盒)。

然而，使用醇类也有一些缺点，具体包括以下这些：

·为进行精确质粒分离以防止要分离的质粒(尤其是含有RNA的质粒)出现污染，必须小心维持样品裂解产物与醇的精确体积比。

·离液序列高和醇的结合化学都导致DNA分离物被内毒素强烈污染。为了能够持续结合固相(通常是膜)，其它洗涤步骤必须限制为使用含有大量醇的缓冲液。使用其它必需物质的可选洗涤步骤因此难以用于该目的。

·分离的DNA中所含的内毒素可导致与进一步使用以这种方式分离的DNA有关的问题-例如药物应用。

因此，本发明的目的首先包括克服上述缺点。

通过使用通式(I)的阳离子去污剂来使核酸结合到固体基质可解决该问题。适合的基质-例如纤维素-是本领域已知的。然而，根据本发明，优选二氧化硅或玻璃纤维基质。

本发明方法的主要顺序原则可描述如下，以使用质粒制品为例：

首先从含有细菌的培养基分离细菌，之后，出于实践目的，使它们以团的形式存在。在随后的步骤中，将该团重悬于重悬缓冲液。这种类型的重悬缓冲液是本领域已知的(例如，50mM Tris-Cl，pH 8.0，10mMEDTA，含RNA酶A)。

将如此获得的悬浮液与裂解缓冲液(这里可使用的裂解缓冲液与精通本领域的技术人员已知的类似)，例如200mM NaOH，1％SDS混合。裂解后，根据制品的形式用中和缓冲液将制品中和。这里可使用的中和缓冲液也是精通本领域的技术人员熟知的。它们包括，例如，pH值为5的3M的乙酸钾水溶液。

需要的话过滤所得反应混合物。合适的滤器是本领域熟知的并可购得(如来自QIAGEN公司(D-40724Hilden)的

Midi)。然后将裂解产物与一种或多种通式(I)的化合物(优选水溶液)混合，混合后置于二氧化硅柱上，优选所谓的旋转柱。(根据操作过程，通式(I)的化合物可以已经加入裂解缓冲液以进行“温和裂解”，可参见第4部分)

如果旋转柱的体积不足以容纳所有的量，可在旋转柱上放置漏斗形式的延长器，以便能够容纳所有量的液体。通过施加真空或通过离心使反应混合物转移或吸收通过柱，从而所需核酸(这里是质粒DNA)结合到表面，优选结合到二氧化硅表面。

如果需要然后用洗涤缓冲液将柱洗涤数次。这种类型的洗涤缓冲液是本领域熟知的，并包括诸如“PE缓冲液”(QIAGEN，Hilden)的缓冲液。

如果需要可通过离心除去任何存在的残余洗涤缓冲液。

最后，用同样是本领域已知的洗脱缓冲液从柱上洗脱结合的核酸。

因此，本发明涉及分离和清除核酸的方法，该方法通常包括以下步骤：

-裂解含有核酸的生物样品；

-需要的话中和裂解所得制品；

-将如此获得的反应混合物与一种或多种通式(I)的化合物或其水溶液混合，并使反应混合物接触硅基基质(silica-based matrix)；

-洗涤核酸；

-分离核酸。

此外，本发明涉及上述方法，其中，将含有200mM NaOH和1重量％/V SDS的水溶液用作裂解缓冲液。

此外，本发明涉及上述方法，其中，用2-3M的乙酸钾水溶液作为中和缓冲液。

此外，本发明涉及上述方法，其中，优选用300-1000mM、特别优选400-800mM、尤其优选500-600mM的氯化钠水溶液作为洗涤缓冲液。

此外，本发明涉及上述方法，其中，用pH值为7.5的70-90％的缓冲乙醇水溶液作为洗涤缓冲液。合适的缓冲液是本领域已知的，其中包括，例如，Tris/HCl、MOPS和类似的缓冲液混合物。

此外，本发明涉及通式(I)的化合物的在将核酸可逆结合到无机基质中的应用，其中所述基质可由基于金属氧化物或金属氧化物混合物的多孔和/或非多孔载体构成，并可优选由硅-氧化合物，特别优选二氧化硅(硅石)，或由硅酸盐，或由玻璃、硅胶或沸石构成。

此外，所述无机基质可由氧化铝、二氧化钛或二氧化锆构成，或者可使用上述金属氧化物的混合物。

具体地说，本发明涉及通式(I)的化合物的应用，用于结合单链和/或双链DNA和/或RNA形式的核酸以及单个核苷酸和/或核糖核苷酸，若为DNA，该DNA是基因组DNA、质粒DNA和/或质体DNA，若为RNA，该RNA是mRNA、tRNA、rRNA和/或sn-RNA。

最后，本发明涉及分离和/或清除核酸的试剂盒，该试剂盒至少包含通式(I)的化合物。

实施例：

之后用以下实施例例证本发明：

采用以下缩写：

CTAB 鲸腊基三甲基溴化铵

十六烷基三甲基溴化铵

TTAB 十四烷基三甲基溴化铵

DoTAB 十二烷基三甲基溴化铵

DTAB 癸基三甲基溴化铵

OTAB 辛基三甲基溴化铵

GEL 通过琼脂糖凝胶密度评价得到的产量

min 分钟

PE缓冲液市售洗涤缓冲液(QIAGEN，D-40724 Hilden)

EC缓冲液市售细胞培养缓冲液(QIAGEN，D-40724 Hilden)

RLT缓冲液市售裂解/结合缓冲液(QIAGEN，D-40724 Hilden)

EB缓冲液市售洗脱缓冲液(QIAGEN，D-40724 Hilden)

DP3缓冲液市售中和缓冲液(QIAGEN，D-40724 Hilden)

S3缓冲液市售中和缓冲液(QIAGEN，D-40724 Hilden)

CE3缓冲液市售抽提缓冲液(QIAGEN，D-40724 Hilden)

OD 通过260nm光度测量得到的产量(光密度)

RT 室温(约20-25℃)

X 多次测量的平均值

第1部分：用阳离子去污剂清除和分离核酸

除非另有说明，实施例1-4按照以下方法进行：

方法(1)用于以“中等规模”从大肠杆菌制备质粒DNA：

1.将细菌团重悬于2ml重悬缓冲液；

2.加入2ml裂解缓冲液，然后裂解约3min；

3.加入2ml中和缓冲液，通过翻转混合；

4.立即转移到

Midi，在RT培育3min，然后过滤；

5.在旋转柱上接上10ml延长器，并放置在

上；

6.在裂解产物中加入2ml去污剂溶液，充分混合并放在柱上；

7.吸出混合物，除去真空；

8.弃去延长器；

9.将旋转柱置于收集管内；

10.任选地通过加入750μl盐缓冲液来洗涤膜，在14,000rpm下离心1min；

11.加入750μl PE缓冲液洗涤膜，在14,000rpm下离心1min；

12.再在14,000rpm下离心1min以除去残余缓冲液；

13.将旋转柱置于1.5ml离心管上；

14.用200μl EB缓冲液洗脱。用移液管移到膜上，培育1min并离心(14,000rpm1min)。

实施例1：比较本发明的使用去污剂的结合化学和所谓的“醇”结合化学

根据本发明的方法(1)，分别用2ml、2.5ml和4ml去污剂溶液(4重量％，用0.5MNaCl配制)或用异丙醇沉淀25ml DH5α/pCMVβ培养物(高拷贝质粒)：

表1和2

CTAB结合，OD₂₆₀产量(μg)

	2ml	2.5ml	4ml
				1	448	460	502
2	453	532	379
				X	450	491	440

20异丙醇结合，OD₂₆₀产量(μg)

	2ml	2.5ml	4ml
				1	331	439	716
2	325	381	679
				X	328	410	698

表3和4

CTAB结合，GEL产量(μg)

	2ml	2.5ml	4ml
				1	421	456	384
2	421	464	357
				X	421	460	370

25CTAB结合，GEL产量(μg)

	2ml	2.5ml	4ml
				1	308	428	354
2	374	374	352
				X	341	401	353

如以上数据所示，去污剂结合系统比醇基结合系统更稳定，且产量更高。

实施例2：通过盐浓度控制结合和选择性

在该实施例中，按照方法(1)，每次使25ml DH5α/pBRCMVβ培养物(低拷贝质粒)与不同盐浓度的CTAB结合。

两次测定的平均值在下表5和6的各次情况中重现：

CTAB结合，OD₂₆₀产量(μg)

0.4M	0.5M	0.6M	0.7M	0.8M	0.9M	1.0M
							40	26	21	12	14	11	220

CTAB结合，GEL产量(μg)

0.4M	0.5M	0.6M	0.7M	0.8M	0.9M	1.0M
							9	8	11	9	14	8	0

试验结果明确显示，通过选择合适的盐浓度可以设置选择性结合所需核酸的最佳条件。此外，NaCl浓度为0.8M时的光度测量和密度测量值一致证明，只有需要的质粒DNA在相应制品中出现。

实施例3：使用含有盐的洗涤缓冲液除去RNA污染

如果将阳离子去污剂作为“可溶性阴离子交换剂”，则可以通过分阶梯度在结合到膜之后除去不需要的核酸并因此可获得额外的结合选择性。

在所示实施例中，按照方法(1)，每次使50ml DH5α/pBRCMVβ培养物(低拷贝质粒)与具有用0.8M NaCl配制的1％CTAB的膜结合。结合的DNA然后用不同氯化钠浓度的洗涤缓冲液洗涤(方法(1)的任选步骤10)：

a)无任选洗涤步骤

b)300mM NaCl

c)600mM NaCl

d)800mM NaCl

表7和8

CTAB结合，OD₂₆₀产量(μg)

	a)	b)	c)	d)
					1	122	60	23	1.7
2	97	76	43	1.4
					X	110	68	33	1.5

CTAB结合，GEL产量(μg)

	a)	b)	c)	d)
					1	47	28	19	0.2
2	47	41	48	0.4
					X	47	35	34	0.3

上表显示的试验数据以图的形式重现于图1。结果显示，膜上的去污剂-核酸复合物的表现与核酸相同，能够结合阴离子交换剂。因此可用具有合适盐浓度的洗涤缓冲液选择性除去污染物。

此外还显示，具有相同纯度(OD/GEL值几乎相同)的质粒DNA可与上述所有链长在8个碳原子以上的去污剂一起结合到二氧化硅膜上。同时，产量取决于所用去污剂和溶液的使用浓度(离子强度)。

文中显示，结合也可在低盐浓度下发生，此时不会抑制DNA沉淀。

实施例4：分离的DNA的品质：

为评价分离的DNA的品质，将醇结合化学和阳离子去污剂结合进行比较。结果示于下面的表9和10：

a)检测内毒素污染(EU/μg DNA)：

高拷贝质粒：

	异-丙醇	CTAB
			1	1241	3
2	1466	11
			X	1354	7

低拷贝质粒(无额外洗涤步骤)：

	异丙醇	CTAB
			1	2395	15
2	2536	19
			X	2466	17

虽然使用醇结合化学时的内毒素浓度在通过二氧化硅技术得到的DNA制品的正常范围内，但CTAB制品的污染物在通常只能通过阴离子交换柱获得的范围内。

b)内毒素敏感细胞(Huh7)的转染结果：

转染是临界应用，其中，所用质粒DNA必须尽可能不含污染物(尤其是内毒素)。

细胞按照SuperFect方法(QIAGEN，D-40724 Hilden)转染。采用通过阴离子交换柱(Ultrapure100，QIAGEN，D-40724 Hilden)分离的质粒作为参比(100％)。

所得结果示于图2。

转染结果显示，用CTAB分离的DNA的值约为100％，即与阴离子交换柱(Ultrapure 100)得到的制品相同。

另一方面，用异丙醇结合得到的制品的转染结果明显较差，有高内毒素值(见上)。

第2部分：省略细胞裂解产物的预先纯化

除非另有说明，按照以下方法进行实施例5-8：

方法(2)用于以“小规模”(1.5ml细菌培养物)从大肠杆菌快速制备质粒DNA：

1.将细菌团重悬于150ml重悬缓冲液；

2.加入150μl裂解缓冲液，裂解约3min；

3.加入150ml中和缓冲液，通过翻转混合；

4.在裂解产物中加入300ml去污剂溶液，充分混合并放在柱上；

5.离心(14,000rpm，1min)；

6.通过加入750μl PE缓冲液进行洗涤，在14,000rpm下离心1min；

7.再在14,000rpm下离心1min以除去残余缓冲液；

8.将旋转柱置于1.5ml离心管上；

9.用100μl EB缓冲液洗脱。用移液管移到膜上，放置1min并离心(14,000rpm，1min)。

实施例5：省略裂解产物纯化时结合的最佳化

在该实施例中，按照方法(2)，每次使1.5ml DH5α/pBRCMVβ培养物(高拷贝)与不同盐浓度的CTAB结合。

给出每种情况下两次测定的平均值。

基于采用裂解产物纯化的结果使去污剂溶液所需盐浓度最佳：

每次采用具有规定盐浓度的300μl1％CTAB溶液。

从图3可见，用1.2和1.4MNaCl得到了最佳结果。这里需要注意，在这些盐浓度时采用裂解产物纯化未发生进一步结合。相反，0.8MNaCl-采用裂解产物纯化时确定的最佳浓度(参见实施例2)-此时导致相当差的结果。

实施例6：以旋转模式制备

在该实施例中，按照方法(2)，每次用以1.2M NaCl配制的1％CTAB或异丙醇沉淀1.5ml DH5α/pBRCMVβ培养物(高拷贝)。

各种情况下用DP3缓冲液(3M 乙酸铵，pH 5.5)和S3缓冲液(2M乙酸钾，pH 5.5)作为中和缓冲液。用来自QIAGEN GmbH公司的QIAprep制品作为额外对照。

如图4所示，采用阳离子去污剂CTAB获得的产量为使用异丙醇的两倍。采用S3缓冲液仅使阳离子结合量略低，和以往一样，OD和GEL之间良好相对应。与此相反，当使用异丙醇时OD的量非常高。

实施例7：以96孔模式制备，自动

在该实施例中，将DH5α/pCMVβ培养物(高拷贝)的摇瓶培养物分布到96孔板中，每孔1.5ml。

随后在分析仪(例如BR8000/QIAGEN GmbH)上用CTAB或异丙醇同时制备一块96孔板以形成DNA结合。

选择最新的DP96法用于用异丙醇分离(每次100μl裂解缓冲液，180μl异丙醇；所谓的“小体积法”)。为用CTAB分离，选择尽可能与之前采用的旋转方法类似的方法(每次150μl裂解缓冲液，300μl CTAB溶液)。

确定所有96个孔的OD₂₆₀产量(见表11和12)。此外，同时对7个孔进行琼脂糖凝胶密度分析以确定产量。

图5比较了随机选择的7个孔的OD和GEL。新结合化学的优点可从所选范围的产量清楚看出。两种情况下OD和GEL之间的一致性一样好。

下面的表11和12的值(对所有96个孔测定的值)与7个选择样品的值的差异不明显，但仍高出约2-3倍。

CTAB：

OD₂₆₀：

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 15,0 4,0 13,4 15,4 13,1 11,4 12,0 11,4 11,7 8,0 8,0 6,4

B 14,8 16,9 15,4 14,9 7,7 10,2 10,9 14,7 10,8 7,1 7,6 9,1

C 12,0 13,4 9,0 13,2 12,3 12,3 8,6 10,3 6,4 9,2 10,7 8,7

D 14,0 13,9 9,2 16,2 12,9 11,1 11,3 11,9 11,6 9,1 8,7 6,9

E 12,7 14,9 15,1 11,2 11,2 12,3 9,3 12,0 9,3 9,0 9,8 11,0

F 14,5 14,2 12,0 8,6 11,8 12,0 16,4 11,7 10,0 11,6 7,1 3,4

G 15,9 14,9 19,6 12,2 13,9 13,7 14,9 14,5 10,4 7,4 8,4 11,6

H 15,0 9,3 11,5 13,3 8,9 8,7 3,4 11,3 13,1 6,0 10,2 11,9

平均：114μg

异丙醇：

OD₂₆₀：

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 2,8 4,1 5,0 3,4 3,6 1,6 3,1 2,5 0,5 2,6 0,4 0,03

B 4,7 4,2 4,5 3,5 3,4 5,0 4,3 4,0 4,7 3,8 3,2 3,1

C 3,5 4,2 5,3 4,9 4,7 1,9 1,9 4,2 4,5 4,8 3,5 1,7

D 4,2 4,5 4,5 3,7 2,8 4,1 4,4 4,3 1,9 4,4 3,1 4,2

E 4,8 5,8 5,9 5,5 4,6 5,0 3,7 4,5 4,2 3,9 4,5 4,6

F 5,1 4,9 4,7 4,8 2,8 4,8 4,6 3,9 2,7 5,4 5,0 4,0

G 4,8 4,8 5,2 6,1 3,9 3,4 4,3 6,4 4,6 4,0 5,0 2,4

H 4,0 5,5 6,9 4,2 3,9 4,4 5,2 4,8 5,3 3,8 3,2 4,0

平均：4.0μg

实施例7：所得DNA的品质：

进行不同应用以确定分离的DNA的品质：

a)限制性分析

用盐敏感性限制性酶消化实施例7中分离的质粒DNA样品。对照采用同样的质粒，但首先用阳离子交换柱(例如UP100/QIAGEN GmbH)分离。图6明确显示，所有消化的样品在0.7kb都有预期的额外条带。未检测到与对照样品有何不同。

b)测序能力

从下表13可见，所有DNA样品都有平均约800bp的阅读长度。各碱基的信号强度和可读性的早期启动也显示，分离的质粒DNA的品质非常适合测序。

名称	G	A	T	C	起点	终点	阅读长度
								A942_a_P1.ab1	990	1205	1173	1533	21	838	817
A942_b_P1.ab1	691	856	822	1117	20	803	783
								A942_c_P1.ab1	823	1009	1014	1348	20	804	784
A942_d_P1.ab1	1158	1525	1379	1907	21	731	710
								A942_e_P1.ab1	1230	1580	1481	2049	21	808	787
A942_f_P1.ab1	1197	1507	1539	2030	16	808	792
								A942_g_P1.ab1	1136	1560	1627	2247	21	822	801
A942_h_P1.ab1	1101	1326	1223	1620	21	808	787
								A942_i_P1.ab1	1094	1334	1360	1771	19	840	821

c)内毒素含量检测：

用LAL Kinetic Kit(Cambrex)测定序列4中样品的内毒素含量。

内毒素单位/所用DNA的微克数：

序列4	A	B	C	D	E	F	G	H	平均
											2442	2420	778	2230	1242	1329	1968	1833	1780

测量显示，内毒素污染水平与采用离液序列高的结合化学的常规二氧化硅制品(参见实施例4)在相同数量级上。

与此相反，未经裂解产物纯化的醇结合化学的值高出约10倍。

结论：

如实施例5-7所示，在与醇结合化学类似的方法中(也可参见WO 03/040364)，新的结合化学也能省略裂解产物纯化，就高通量应用或自动系统而言这是最大的优点。

如实施例6所示，自动方法(2)可非常方便地与已有系统相适应。与醇结合化学相比，阳离子结合化学制造的质粒DNA就品质而言是相同的或者更高，但产量明显较高。

第3部分：随后清除DNA

下面给出了有关清除任意大小DNA的一些例子。此时的目标在于在酶反应之后分离游离核苷酸或引物以及选择性分离引物和较大DNA分子。

除非另有说明，按照下面的方法(3)进行实施例9-11，该方法显示了随后用阳离子去污剂清除DNA的顺序，以便以小规模结合二氧化硅膜。

方法(3)用于根据大小选择性结合DNA

1.将样品与去污剂溶液混合；

2.充分混合并置于柱上；

3.离心(14,000rpm，1min)；

4.加入750μl PE缓冲液进行洗涤，在14,000rpm下离心1min；

5.再在14,000rpm下离心1min以除去残余缓冲液；

6.将旋转柱置于1.5ml离心管上；

7.用100μl EB缓冲液洗脱。用移液管移到膜上，放置1min并离心(14,000rpm，1min)。

给出的实施例9-11证实了三个不同参数，这些参数可用于区分不同DNA分子的结合：

·所用去污剂的量

·pH值

·结合制备中所含的离子(阳离子)

这三个参数可提供足够的组合选项，从而能够方便地获得任何所需选择性。

实施例9：选择性结合100bp片段

每次将2μg 100bp片段或20聚体溶于50μl EB缓冲液，与不同稀释度的TTAB溶液(每次300μl)混合，再按照上述方法(3)处理。

图7所示结果显示，仅通过改变所用去污剂的量(这里为0.07％)便可几乎定量除去20聚体。

实施例10：通过选择合适的pH值选择性结合20聚寡核苷酸

每次将1μg20聚体或100bp片段溶于100μl EB缓冲液(10mM Tris/HCl，pH 8.5)，并与300μl 0.05％乙酸盐缓冲的TTAB溶液(15mM乙酸/乙酸钠，pH值为5、7和9)混合。

再按照上述方法(3)处理样品。

图8所示结果显示了回收率，因此在pH5时同时结合20聚体和100bp片段。与此相反，在较高pH值时仅结合20聚体。这显示，通过本发明的结合化学，仅通过选择合适的pH值便可实现所需DNA片段的分离。

实施例11：通过选择合适的阳离子选择性结合或不结合100bp片段

每次将2μg 20聚体或100bp片段或pUC21质粒溶于50μl EB缓冲液(10mMTris/HCl，pH 8.5)，并与50μlpH值约为5.5的合适的乙酸盐溶液(见下面a-d所列)混合。在其中加入50μl用500mM NaCl配制的4％的CTAB溶液，并再按照上述方法(3)处理。

a)2M乙酸钾

b)1M乙酸镁

c)1M乙酸钙

d)1M乙酸锰(II)

每次都能分离20聚体而质粒pUC21每次都保持结合。根据所用阳离子，100bp片段可结合或不结合。

因此，图9显示，仅通过选择所用阳离子就能实现对所需DNA分子的某些选择。

第4部分：分离RNA(包含DNA和天然蛋白质)

下面将显示如何将新的结合化学用于从生物材料分离RNA。这里，用常规的温和裂解缓冲液(如长期用于分离蛋白质的裂解缓冲液)进行裂解。然而，根据本发明，这种缓冲液含有阳离子去污剂，这一方面能稳定RNA，另一方面能促进与二氧化硅膜的结合。

采用这种方法，所有核酸在最初的结合步骤中结合，然后用已知缓冲液逐个选择性洗脱。

与已知的用高浓度离液序列高的盐钝化RNA酶以稳定DNA的常规方法不同，在结合阳离子去污剂时，RNA被保护以免遭攻击。这意味着样品中存在的蛋白质仍保留其生物学功能，并且可在通过二氧化硅旋转柱之后能以天然形式被进一步加工。

相比已知系统这提供了非常显著的优点，在已知系统中，必须将样品分开，一份用于分离天然蛋白质并同时进行RNA降解，另一份用于分离核酸并同时使蛋白质变性，这样做的缺点是每次必须丢弃一半样品，当分开不均匀的样品材料时这样会非常容易地导致错误结果。

采用本发明的方法，可以首次在RNA和蛋白质水平对一份相同裂解产物进行功能研究。

有益的是，也可分离基因组DNA，基因组DNA在核查观察结果以了解它们在遗传背景中的原因(突变)的分析中非常重要。

除非另有说明，下面的实施例12和13按照以下方法进行：

方法(4)用于从样品分离RNA、gDNA和天然蛋白质

(用于12孔细胞培养模式的方法)

1.除去培养基并用1ml EC缓冲液洗涤细胞；

2.将平板在冰上冷却5min；

3.将细胞与400μl裂解缓冲液(1.6份体积抽提缓冲液CE3+1份体积8％TTAB的水溶液)混合，并在室温放置5min。

(通常用于分离天然蛋白质的任何缓冲液可用作裂解缓冲液的基础，然后将其与适量阳离子去污剂混合。)

4.刮下细胞并通过上下吸取3次均质裂解产物；

5.用市售旋转柱(例如RNeasy旋转柱/QIAGEN GmbH)离心裂解产物；

6.发现流出液中有蛋白质组分，随后个别分析；

7.用350μl市售离液序列高的缓冲液(例如RLT缓冲液/QIAGEN GmbH)洗脱加载了所得核酸的旋转柱；

8.收集流出液并在步骤10中进一步处理；

9.旋转柱随后用PE缓冲液洗涤，保留在柱子上的gDNA用EB缓冲液洗脱；

10.将含有RNA的RLT流出液与250μl 100％乙醇混合；

11.用新的RNeasy旋转柱离心；

12.分离所需RNA，例如采用RNeasy Mini手册(QIAGEN GmbH/Status 2001-6)第32页“从动物细胞分离总RNA的RNeasy Mini法”的步骤4。

实施例12：RNA和DNA的分离

HeLa S3细胞以12孔细胞培养模式培育，每次用两种不同的常规蛋白质裂解缓冲液(见列表a和b)和作为去污剂的CTAB裂解4个孔。用合适的Rneasy制品作为参比c)(QIAGEN GmbH)。

a)含1％CTAB的β-G半乳糖苷酶裂解缓冲液(见下文)，用100mM NaCl配制(终浓度为188 mM)

b)含1％CTAB的细胞抽提缓冲液CE3，用300mMNaCl配制(终浓度为804mM)

c)RNeasy Mini(QIAGEN)

β-半乳糖苷酶裂解缓冲液：10mM Tris(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)，pH 7.4

1mM EDTA

100mM NaCl

5mM MgCl₂

1％NP40

然后按照上述方法(4)分离RNA和gDNA。

图10和11所示结果清楚显示，尤其在比较制品a)和c)时，用本发明的方法和已知缓冲液组合可同时分离RNA和DNA。其产量和品质可与已有系统相媲美。

在开发过程中最佳化裂解缓冲液CE3的NaCl浓度至最终375mM随后也能得到可以相媲美的结果。

实施例13：分离的蛋白质的品质

HeLa S3细胞以12孔细胞培养模式培育，并用携带β-半乳糖苷酶基因的质粒转染。48小时后，按照上述方法(4)裂解细胞，每次将4个孔与两种不同的常规蛋白质裂解缓冲液(见列表a和b)混合。

采用如用于β-半乳糖苷酶活性测定的标准裂解缓冲液进行裂解作为参比。

a)含3％TTAB的裂解缓冲液

b)用3％TTAB裂解缓冲液，随后用RNeasy旋转柱离心

c)标准β-半乳糖苷酶裂解缓冲液(组合物见实施例12)

然后将蛋白质组分与一定体积3％的SDS溶液混合以沉淀TTAB。SDS沉淀之前和之后测量酶的活性。

通过在孔(未显示)中用β-半乳糖苷酶处理反应溶液显示出黄色可以证明，所得蛋白质仍具有生物学活性。用本领域已知方法不可能得到这种结果，已知方法采用高摩尔离液序列高的盐，因此强烈变性缓冲液，这在客观上造成RNA酶灭活。

Claims

1.一种从裂解产物中分离和清除核酸的方法，其特征在于，所述方法包括

a)用裂解缓冲液裂解含有核酸的生物样品；

c)然后将如此获得的反应混合物与一种或多种通式(I)的化合物或其水溶液混合，并与无机基质接触：

Y⁺R₁R₂R₃R₄X^- (I)

式中，

Y表示氮，

R₁表示具有12、14、16或18个碳原子的直链烷基，

R₂、R₃和R₄彼此独立地表示甲基、乙基、丙基、或丁基，和

X^-表示无机或有机一元或多元酸的阴离子，且X^-是溴离子、氯离子、磷酸根离子、硫酸根离子、甲酸根离子、乙酸根离子、丙酸根离子、草酸根离子或琥珀酸根离子；

d)用洗涤缓冲液洗涤该核酸；

e)分离该核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在步骤a)之后和步骤c)之前，用中和缓冲液中和步骤a)裂解所得制品的步骤。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，R₁表示具有12、14、16或18个碳原子的直链烷基，R₂、R₃和R₄各自表示甲基，Y表示氮。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，R₁具有14或16个碳原子。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机基质为硅基基质。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用含200mM NaOH和1重量％/V SDS的水溶液作为裂解缓冲液。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，用2-3M的乙酸钾水溶液作为中和缓冲液。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用300-1000mM的氯化钠水溶液作为洗涤缓冲液，和/或用pH值为7.5的70-90％的缓冲乙醇水溶液作为洗涤缓冲液。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，用400-800mM的氯化钠水溶液作为洗涤缓冲液。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，用500-600mM的氯化钠水溶液作为洗涤缓冲液。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述缓冲乙醇水溶液含有Tris/HCl。

12.通式(I)的化合物在将核酸结合到无机基质中的用途，

Y⁺R₁R₂R₃R₄X^- (I)

式中，

Y表示氮，

R₁表示具有12、14、16或18个碳原子的直链烷基，

X^-表示无机或有机一元或多元酸的阴离子，且X^-是溴离子、氯离子、磷酸根离子、硫酸根离子、甲酸根离子、乙酸根离子、丙酸根离子、草酸根离子或琥珀酸根离子。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，R₁表示具有12、14、16或18个碳原子的直链烷基，R₂、R₃和R₄各自表示甲基，Y表示氮。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，R₁具有14或16个碳原子。

15.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述无机基质由基于金属氧化物或金属氧化物混合物的多孔和/或非多孔载体构成。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述无机基质由硅-氧化合物或硅酸盐构成。

17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述硅-氧化合物为二氧化硅。

18.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述无机基质由玻璃、硅胶或沸石构成。

19.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述无机基质由氧化铝、二氧化钛和/或二氧化锆构成。

20.如权利要求16-19中任一项所述的用途，其特征在于，使用所述金属氧化物的混合物。

21.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述核酸是单链和/或双链DNA和/或RNA形式的核酸以及单核苷酸和/或核糖核苷酸。

22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述DNA是基因组DNA、质粒DNA和/或质体DNA。

23.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述RNA是mRNA、tRNA、rRNA和/或sn-RNA。

24.一种分离和/或清除核酸的试剂盒，所述试剂盒包含以下成分：

-通式(I)的化合物

Y⁺R₁R₂R₃R₄X^- (I)

式中，

Y表示氮，

R₁表示具有12、14、16或18个碳原子的直链烷基，

25.如权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述通式(I)的化合物存在于水溶液中。

26.如权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有：

-裂解缓冲液，和/或

-中和缓冲液，和/或

-洗涤缓冲液，和/或

-洗脱缓冲液，和/或

-可结合核酸的无机基质。

27.如权利要求25所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有：

-裂解缓冲液，和/或

-中和缓冲液，和/或

-洗涤缓冲液，和/或

-洗脱缓冲液，和/或

-可结合核酸的无机基质。

28.如权利要求24-27中任一项所述的试剂盒，其特征在于，R₁表示具有12、14、16或18个碳原子的直链烷基，R₂、R₃和R₄各自表示甲基，Y表示氮。

29.如权利要求28所述的试剂盒，其特征在于，R₁具有14或16个碳原子。