DE102004034433A1

DE102004034433A1 - Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Nukleinsäuren unter Verwendung kationischer Detergentien

Info

Publication number: DE102004034433A1
Application number: DE102004034433A
Authority: DE
Inventors: Thorsten Singer
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2004-07-15
Filing date: 2004-07-15
Publication date: 2006-02-02
Also published as: EP1771562A2; JP4918037B2; CN101014707B; WO2006008090A3; CN101014707A; US8679744B2; EP1771562B1; JP2008506654A; ATE396260T1; WO2006008090A2; US20080113348A1; DE502005004209D1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Nukleinsäuren unter Verwendung von kationischen Detergentien der allgemeinen Formel (I): DOLLAR A Y·+·R¶1¶R¶2¶R¶3¶R¶4¶X·-·, DOLLAR A worin DOLLAR A Y Stickstoff oder Phosphor, DOLLAR A R¶1¶, R¶2¶, R¶3¶ und R¶4¶ unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C¶1¶-C¶20¶-Alkylrest, C¶3¶-C¶6¶-Alkenylrest, C¶3¶-C¶6¶-Alkinylrest und/oder einen C¶6¶-C¶20¶-Arylrest sowie einen C¶6¶-C¶26¶-Aralkylrest und DOLLAR A X·-· ein Anion einer anorganischen oder organischen, ein- oder mehrbasischen Säure DOLLAR A bedeuten können.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Isolierung von Nukleinsäuren unter Verwendung von kationischen Detergentien der allgemeinen Formel: Y⁺R₁R₂R₃R₄X^– (I)worin
Y Stickstoff oder Phosphor,
R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C₁-C₂₀-Alkylrest, C₃-C₆-Alkenylrest, C₃-C₆-Alkinylrest und/oder einen C₆-C₂₀-Arylrest sowie einen C₆-C₂₆-Aralkylrest und
X^– ein Anion einer anorganischen oder organischen, ein- oder mehrbasischen Säure
bedeuten können.
Bevorzugt sind Kompositionen, in denen die kationische Verbindungen aus einem Ammoniumsalz besteht, in dem R₁ einen höheren Alkylrest, vorzugsweise mit 12, 14, 16 oder 18 Kohlenstoffatomen, und R₂, R₃ und R₄ jeweils eine Methylgruppe bedeutet.
Bevorzugt sind weiterhin Kompositionen, in denen R₁ eine Aralkylgruppe, vorzugsweise eine Benzylgruppe, R₂ einen höheren Alkylrest, vorzugsweise mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen, und R₃ und R₄ eine Methylgruppe bedeutet.
C₁-C₆-Alkyl steht im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatom(en), der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) – vorzugsweise Fluor – substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können.
Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl (iso-Propyl), Butyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl und 1-Ethyl-2-methyl-propyl.
Höherer Alkylrest steht für einen verzweigten oder unverzweigten C₇-C₂₀-Alkylrest der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) – vorzugsweise Fluor – substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt: verzweigtes oder unverzweigtes Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Oktadecyl und Eicosyl.
C₃-C₆-Alkenyl steht im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, mit einer oder ggf. mehreren Doppelbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) – vorzugsweise Fluor – substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können.
Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
2-Propenyl (Allyl), 2-Butenyl, 3-Butenyl, 1-Methyl-2-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1,2-Dimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl-3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl- 2-Butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 1-Ethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenyl und 1-Ethyl-2-methyl-2-propenyl.
C₃-C₆-Alkinyl steht im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, mit einer oder ggf. mehreren Dreifachbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) – vorzugsweise Fluor – substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können.
Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
2-Propinyl (Propargyl), 2-Butinyl, 3-Butinyl, 1-Methyl-2-propinyl, 2-Methyl-2-propinyl, 2-Pentinyl, 3-pentinyl, 4-Pentinyl, 1-Methyl-2-butinyl, 2-Methyl-2-butinyl, 3-Methyl-2-butinyl, 1-Methyl-3-butinyl, 2-Methyl-3-butinyl, 3-Methyl-3-butinyl, 1,1-Dimethyl-2-propinyl, 1,2-Dimethyl-2-propinyl, 1-Ethyl-2-propinyl, 2-Hexinyl, 3-Hexinyl, 4-Hexinyl, 5-Hexinyl, 1-Methyl-2-pentinyl, 2-Methyl-2-pentinyl, 3-Methyl-2-pentinyl, 4-Methyl-2-pentinyl, 1-Methyl-3-pentinyl, 2-Methyl-3-pentinyl, 3-Methyl-3-pentinyl, 4-Methyl-3-pentinyl, 1-Methyl-4-pentinyl, 3-Methyl-4-pentinyl, 4-Methyl-4-pentinyl, 1,1-Dimethyl-2-butinyl, 1,1-Dimethyl-2-butinyl, 1,1-Dimethyl-3-butinyl, 1,2-Dimethyl-2-butinyl, 1,2-Dimethyl-3-butinyl, 1,3-Dimethyl-2-butinyl, 1,3-Dimethyl-3-butinyl, 2,2-Dimethyl-3-butinyl, 2,3-Dimethyl-2-butinyl, 2,3-Dimethyl-3-butinyl, 1-Ethyl-2-butinyl, 1-Ethyl-3-butinyl, 2-Ethyl-1-butinyl, 2-Ethyl-2-butinyl, 2-Ethyl-3-butinyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propinyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propinyl und 1-Ethyl-2-methyl-2-propinyl.
Aryl steht – sofern nicht anders definiert – für einen aromatischen ein- oder mehrkernigen Rest mit 4 bis 22 C-Atomen, der ggf. ein oder zwei Heteroatome enthalten kann. Als Beispiele seien genannt: Phenyl, Naphthyl, Anthracyl bzw. Pyrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin oder Pyrazin, und die ggf. mit einem oder mehreren Halogenatom(en) – vorzugsweise Fluor – oder durch eine Alkylgruppe unabhängig voneinander ein- oder mehrfach substituiert sein können.
Aralkyl bedeutet einen ein oder mehrkernigen Arylrest im Sinne der vorstehenden Definition, der über eine C₁-C₆-Alkylen-, C₃-C₆-Alkenylen- oder eine C₃-C₆-Alkinylenbrücke, für welche die Definition der C₁-C₆-Alkyl-, C₃-C₆-Akenyl- und C₃-C₆-Alkinylgruppen entsprechend gelten, an die kationische Partialstruktur gebunden ist. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Benzylgruppe bevorzugt.
Als Anionen werden Bromid, Chlorid, Phosphat, Sulfat, Formfiat, Acetat, Propionat, Oxalat oder Succinat bevorzugt.

Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Demgemäß erfolgt, nach einer der im Stand der Technik etabliertesten Methoden, die Isolierung von DNA aus biologischen Ausgangsmaterialien – wie z. B. Zellen und Geweben – dadurch, dass die Nukleinsäure enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingung (teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen) aufgeschlossen und die so freigesetzten Nukleinsäuren auf dem Wege der Dialyse oder mittels einer Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase isoliert werden [J. Sambrock, E.F. Fritsch und T. Maniatis, 1989, Cold Spring Harbor, „Molecular Cloning"].

Der wesentliche Nachteil dieser Verfahrensweise ist darin zu sehen, dass sich die Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und insbesondere aus Geweben als sehr zeitaufwändig erweist und häufig mehr als zwei Tage in Anspruch nehmen kann. Daneben macht diese Verfahrensweise einen erheblichen apparativen Aufwand erforderlich und beinhaltet den Einsatz von hautreizenden bzw. gesundheitsgefährdenden Stoffen wie z. B. Phenol oder Chloroform.

Angesichts dieser Umstände wurden im Stand der Technik frühzeitig alternative Verfahren entwickelt, die es ermöglichen sollten, die oben geschilderten Nachteile bei der Extraktion von Nukleinsäuren zu umgehen.

Alle diese Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1979, 76, 615-619) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA-Bande enthaltenden Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2], 200 mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und danach von den Trägerpartikeln desorbiert.

Diese Methodik erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren unterschiedlicher Provenienz angewendet (Marko, M.A., Chipperfield, R. und Birnboim, H.G., Anal. Biochem., 121, (1982) 382-387).

Zur Durchführung derartiger Nukleinsäureextraktionen sind demgemäß zahlreiche Reagenzien-Zusammenstellungen (sog. Kits) kommerziell erhältlich.

Diese fast ausschließlich kommerziell verfügbaren Kits basieren auf dem hinlänglich bekannten Prinzip der Bindung von Nukleinsäure an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze, und verwenden als Trägermaterialien Suspensionen fein gemahlener Glaspulver (z. B. Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), Diatomeenerden (Fa. Sigma) oder auch Silicagele (Europäische Patentanmeldung 616 639).

Ein für eine Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen prinzipiell praktikables Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren ist in Boom et al. [ EP 389 063 A1 ] offenbart worden. In dieser Europäischen Patentanmeldung wird ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch die Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer aus einer DNA-bindenden festen Phase beschrieben. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist geeignet, um Nukleinsäuren auch aus kleinen Probenmengen zu isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung.

Probleme, die durch eine ggf. schwierige Lyse des Ausgangsmaterials erwachsen, können zwar durch eine Reihe von kommerziell verfügbaren Produkten für die Nukleinsäureisolierung (speziell für die Isolierung genomischer DNA aus komplexen Ausgangsmaterialien) gelöst werden, bergen aber den großen Nachteil in sich, dass es sich hierbei nicht mehr um ein klassisches "Single Tube-Verfahren" handelt, dass das o. a. Verfahren gemäß der Offenbarung von Boom et al. kennzeichnet, da die Lyse des Ausgangsmaterials in einem gebräuchlichen Puffer unter Einbeziehung eines proteolytischen Enzyms erfolgt. Die für die nachfolgende Bindung der Nukleinsäuren, an z. B. Zentrifugationsmembranen, notwendigen chaotropen Ionen müssen nach erfolgter Lyse dem Lyseansatz extra zugegeben werden. Sie können aber in keinem Fall Bestandteil des Lysepuffers sein, da die proteinzerstörende Funktion chaotroper Salze bekannt ist und natürlich sofort das für eine effiziente Lyse notwendige proteolytische Enzym ebenfalls zerstören würde.

Trotz einer Reihe von Nachteilen haben sich die Methoden der Nukleinsäureisolierung unter der Verwendung chaotroper Salze weltweit durchgesetzt, und werden mittels kommerziell verfügbarer Produkte millionenfach eingesetzt. Diese Systeme sind extrem einfach in ihrer Durchführung und verfahren immer nach folgendem Prinzip:

• Lyse des Ausgangsmaterials, nachfolgende Bindung der Nukleinsäure an die feste Phase einer Glas- oder Silicamembran, welche sich in einem Zentrifugationssäulchen an einer Trägersuspension befindet;
• Waschen der gebundenen Nukleinsäuren und
• Elution der Nukleinsäuren mit einem Puffer geringer Ionenstärke;

Alle diese Systeme beruhen auf der Bindung der Nukleinsäuren an die jeweiligen Trägeroberflächen in Anwesenheit chaotroper Salze, d. h. mindestens eine Pufferlösung enthält als Hauptkomponente ein chaotropes Salz. Dies betrifft u. U. schon den Lysepuffer oder – bei Systemen unter Einbeziehung proteolytischer Enzyme – einen notwendigen Bindungspuffer, welcher nach der erfolgten Lyse des Ausgangsmaterials zugegeben wird.

Die Basis für die Auswahl geeigneter chaotroper Salze bilden die Reihen von Hofmeister zur Aussalzung von negativ geladenen, neutralen oder basischen Eiweißlösungen. Die chaotropen Salze sind dadurch charakterisiert, Proteine zu denaturieren, die Löslichkeit unpolarer Substanzen in Wasser zu erhöhen sowie hydrophobe Wechselwirkungen zu zerstören. Gerade diese Eigenschaften bewirken nach dem Stand der Technik auch mit Puffersystemen chaotroper Salze die übergeordnete Struktur des wässrigen Milieus zu zerstören, um so die Bindung der Nukleinsäuren an ausgewählte feste Phasen zu vermitteln. Die bekanntesten Vertreter zur Nukleinsäureisolierung sind, Natriumperchlorat, Natriumjodid, Kaliumiodid, Guanidinium-iso-thiocyanat und Guanidinium-Hydrochlorid. Sie sind jedoch zum einen kostenintensiv und zum anderen teilweise toxisch oder ätzend.

Das physico-chemische Prinzip der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger in Anwesenheit chaotroper Salze gilt in der Fachwelt als erklärt. Die Bindung der Nukleinsäuren an die Überflächen der mineralischen Träger bestehe in der Störung übergeordneter Strukturen des wässerigen Milieus, durch welche die Nukleinsäuren an die Oberfläche von mineralischen Materialien, insbesondere von Glas- bzw. Silicapartikeln adsorbieren. Zur Störung der übergeordneten Strukturen des wässerigen Milieus ist immer die Anwesenheit chaotroper Ionen erforderlich. Bei hohen Konzentrationen der chaotropen Salze verläuft die Reaktion fast quantitativ. Aufgrund dieser beschriebenen physiko-chemischen Erkenntnisse wird deshalb im Stand der Technik davon ausgegangen, dass alle kommerziell verfügbaren Systeme zur Isolierung von Nukleinsäuren, Pufferkompositionen mit hohen Ionenstärken chaotroper Salze für die Bindung von Nukleinsäuren an eine nukleinsäurenbindende feste Phase enthalten müssen.

Daneben sind aus dem Stand der Technik auch entsprechende Verfahren bekannt, die ohne die Anwendung von chaotropen Substanzen oder ohne den Einsatz von Phenol auskommen, womit die oben geschilderten Nachteile vermieden werden können. So offenbart die Internationale Patentanmeldung WO 00/034463 derartige Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus komplexen Ausgangsmaterialien. Bei diesen Verfahren kommt ein Lyse/Bindungspuffersystem zum Einsatz, das mindestens eine antichaotrope Salzkomponente aufweist und mit einer sog. alkoholischen Bindechemie arbeitet (Invisorb^® Plasmid Kit der Fa. Invitek, Berlin).

Der Einsatz von Alkoholen weist allerdings ebenfalls einige Nachteile auf, zu denen insbesondere die folgenden gehören:

• Es müssen ganz bestimmte Volumenverhältnisse von Probelysat zu Alkohol für die Plasmidisolierung peinlich genau eingehalten werden, um die Kontamination des zu isolierenden Plasmids – insbesondere mit RNA – zu vermeiden.
• Sowohl die chaotrope als auch die alkoholische Bindechemie resultieren in DNA-Isolaten, die stark mit Endotoxinen kontaminiert sind. Zusätzliche Waschschritte sind dabei auf die Verwendung stark alkoholhaltiger Puffer eingeschränkt, um die Bindung an die feste Phase – meist eine Membran – aufrecht erhalten zu können. Selektive Waschschritte, die den Einsatz anderer Substanzen erforderlich machen, können daher kaum zu diesem Zweck eingesetzt werden.
• Der Gehalt an Endotoxinen in der isolierten DNA kann zu Problemen bei dem weiteren Einsatz der so isolierten DNA – beispielsweise in pharmazeutischen Anwendungen – führen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht demzufolge darin, zunächst die oben geschilderten Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.

Gelöst wird diese Aufgabe durch den Einsatz von kationischen Detergentien der allgemeinen Formel (I), um die Nukleinsäuren an eine feste Matrix zu binden. Geeignete Matrizes sind aus dem Stand der Technik bekannt – wie beispielsweise Cellulose. Erfindungsgemäß bevorzugt wird allerdings eine Silica- bzw. Glasfaser-Matrix.

In den Grundzügen lässt sich die prinzipielle Abfolge des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Plasmidpräparation, wie folgt, beschreiben:
Zunächst werden die Bakterien aus dem sie enthaltenden Medium isoliert, wonach sie praktischerweise in Form eines Pellets vorliegen. Im nachfolgenden Schritt wird das Pellet unter Verwendung eines Resuspendierungspuffers resuspendiert. Derartige Resuspendierungspuffer sind aus dem Stand der Technik bekannt (beispielsweise: 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, mit RNase A).

Die so erhaltene Suspension wird mit einem Lysepuffer versetzt (die hier einsetzbaren Lysepuffer sind dem Fachmann ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt), wie zum Beispiel 200 mM NaOH, 1 % SDS. Nach der Lyse wird der Ansatz mittels eines Neutralisationspuffers neutralisiert. Auch die hier einsetzbaren Neutralisationspuffer sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik in großer Zahl geläufig. Sie umfassen beispielsweise Puffer wie eine wässrige 3 M Kaliumacetat-Lösung mit einem pH-Wert von 5.

Das resultierende Reaktionsgemisch wird gegebenenfalls filtriert. Geeignete Filter sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt und kommerziell erhältlich (wie z. B. QIAfilter^® Midi der Firma QIAGEN, D-40724 Hilden). Danach wird das Lysat mit einer oder mehreren Verbindungen der allgemeinen Formel (I), vorzugsweise in wässriger Lösung, versetzt, und nach dem Vermischen auf eine Silicasäule, vorzugsweise eine sog. Spinsäule, gegeben. Falls das innerhalb der Spin-Säule zur Verfügung stehende Volumen zur Aufnahme der gesamten Menge nicht ausreicht, kann auf die Spinsäule ein Extender in Form eines Trichter aufgesetzt werden, der die Aufnahme der gesamten Flüssigkeitsmenge ermöglicht.

Das Reaktionsgemisch wird praktischerweise unter Anlegen eines Vakuums durch die Säule transportiert bzw. gesogen, wobei die Plasmid-DNA an die Oberfläche, vorzugsweise an eine Silica-Oberfläche, bindet.

Danach wird die Säule mit einem Waschpuffer ggf. mehrfach gewaschen. Derartige Waschpuffer sind aus dem Stand der Technik ebenfalls bekannt und umfassen Puffer, wie z. B. „Puffer PE" (Firma QIAGEN, Hilden).

Eventuell vorhandene Reste an Waschpuffer können erforderlichenfalls mittels Zentrifugation vom Säulenmaterial entfernt werden.

Abschließend wird die Plasmid-DNA mit einem ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannten Elutionspuffer von der Säule eluiert.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren, das sich allgemein durch folgende Schritte beschreiben lässt:

– lysieren einer Nukleinsäure enthaltende biologische Probe;
– gegebenenfalls neutralisieren des aus der Lyse resultierenden Ansatzes;
– versetzen des so erhaltenen Reaktionsgemisches mit einer oder mehreren Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder deren wässeriger Lösung, und in Kontakt bringen des Reaktionsgemisches mit einer auf Silica basierenden Matrix;
– waschen der Nukleinsäuren;
– isolieren der Nukleinsäuren.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung das oben beschriebene Verfahren, in dem als Lysepuffer eine wässerige Lösung enthaltend 200 mM NaOH und 1 Gew.-%/V SDS eingesetzt wird.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung das oben beschriebene Verfahren in dem als Neutralisationspuffer eine wässrige 2 – 3 M Kaliumacetat-Lösung eingesetzt wird.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung das oben beschriebene Verfahren in dem als Waschpuffer eine wässrige 500 bis 600 mM – vorzugsweise eine 540 mM – Kochsalz-Lösung eingesetzt wird.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung das oben beschriebene Verfahren in dem als Waschpuffer eine bei einem pH-Wert von 7.5 puffernde, 70 – 90 %ige wässrige Lösung von Ethanol eingesetzt wird. Entsprechende Puffer sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise u. a. Tris/HCl oder ähnliche Puffergemische.

Daneben betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur reversiblen Bindung von Nukleinsäuren an eine mineralische Matrix, wobei die Matrix aus einem porösen und/oder nicht-porösen Träger auf der Basis von Metalloxiden oder Metallmischoxiden aufgebaut sein kann, und vorzugsweise aus einer Silizium-Sauerstoffverbindung, besonders bevorzugt Siliziumdioxid (Silica), bzw. aus einem Silicat oder einem Glas, Silicagel bzw. einem Zeolith bestehen kann.

Daneben kann die mineralische Matrix aus Aluminiumoxid, Titandioxid oder Zirkondioxid bestehen bzw. es können Mischungen der genannten Metalloxide eingesetzt werden.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur Bindung von DNA und/oder RNA, wobei es sich im Falle von DNA namentlich um genomische DNA, Plasmid-DNA und/oder plastidäre DNA und im Falle von RNA um mRNA, tRNA, rRNA und/oder sn-RNA handelt.

Schlussendlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zum Isolieren und oder Reinigen von Nukleinsäuren, mindestens enthaltend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I).

Die Erfindung wird nunmehr durch die nachfolgenden Beispiele erläutert: Folgende Abkürzungen werden verwandt:

CTAB: Cetyltrimethylammoniumbromid
TTAB: Tetradecyltrimethylammoniumbromid
DOTAB: Dodecyltrimethylammoniumbromid
DTAB: Decyltrimethylammoniumbromid
OTAB: Octcyltrimethylammoniumbromid
GEL: Ausbeute bestimmt über eine densitometrische Auswertung eines Agarosegels
min: Minute(n)
Puffer PE: handelsüblicher Waschpuffer (Firma QIAGEN, D-40724 Hilden)
Puffer EB: handelsüblicher Elutionspuffer (Firma QIAGEN, D-40724 Hilden)
OD: optische Dichte
RT: Raumtemperatur (ca. 20 – 25°C)
X: Durchschnittswert der Mehrfachbestimmungen

Alle beschriebenen Experimente wurden – sofern nicht anders angegeben – nach dem folgenden Protokoll durchgeführt:
Beispielprotokoll:
Protokoll für Plasmid-DNA Präparationen aus E.coli im „Midi-Maßstab" mittels kationischer Detergentien.

1. Bakterienpellet in 2 ml Resuspendierungspuffer resuspendieren;
2. Zugabe von 2 ml Lysepuffer – anschließend ca. 3 min lysieren;
3. Zugabe von 2 ml Neutralisationspuffer, mischen durch invertieren;
4. sofortiges Überführen in einen QIAfilter^® Midi, 3 min bei RT inkubieren und filtrieren;
5. 10 ml Extender auf die Spin-Säule setzen und auf QIAvac^® positionieren;
6. Zugabe von 2 ml der Detergentienlösung zum Lysat, durchmischen und auf die Säule geben;
7. durchsaugen der Mischung, Vakuum aufheben;
8. Extender verwerfen;
9. Spin-Säule in Collection-Tube setzen;
10. optionales Waschen der Membran durch Zugabe von 750 μl Salzpuffer, 1 min bei 14 000 Upm zentrifugieren;
11. waschen der Membran durch Zugabe von 750 μl Puffer PE, 1 min bei 14 000 Upm zentrifugieren;
12. zum Entfernen von Pufferresten noch einmal 1 min bei 14 000 Upm zentrifugieren;
13. Spin-Säule auf 1,5 ml Eppendorf-Tube platzieren;
14. Elution mit 200 μl Puffer EB. Auf die Membran pipettieren, 1 min inkubieren und zentrifugieren (1 min bei 14 000 Upm).

Beispiel 1: Vergleich der erfindungsgemäßen Bindechemie unter Verwendung von Detergentien gegenüber der sog. „alkoholischen" Bindechemie
Gemäß dem vorliegenden Protokoll wurden 25 ml einer DH5α/pCMVβ Kultur (high-copy Plasmid) mit jeweils 2 ml, 2,5 ml und 4 ml einer Detergentienlösung (4 Gew-% in 0,5 M NaCl) bzw. mit Isopropanol gefällt: Tabellen 1 und 2
Tabellen 3 und 4
Wie die obigen Daten belegen, weist das Detergentien-Bindesystem bei gleichen bis höheren Ausbeuten eine größere Stabilität gegenüber einer auf Alkohol basierenden Bindung auf.
Beispiel 2: Steuerung der Bindung und Selektivität über die Salzkonzentration
In dem vorliegenden Beispiel werden je 25 ml einer DH5α/pBRCMVβ Kultur (low-copy Plasmid) entsprechend dem Beispielprotokoll mit CTAB bei verschiedenen Salzkonzentrationen gebunden.
In den folgenden Tabellen 5 und 6 sind jeweils die Mittelwerte einer Doppelbestimmung wiedergegeben: CTAB-Bindung, Ausbeuten OD260 (μg)
CTAB-Bindung, Ausbeuten Gel (μg)
Die experimentellen Ergebnisse zeigen deutlich, dass sich durch die Wahl einer geeigneten Salzkonzentration optimale Bedingungen für die selektive Bindung einer gewünschten Nukleinsäure einstellen lassen. Außerdem liefern die identischen Werte der photo- und der densitometrischen Bestimmung bei einer Konzentration von 0.8 M NaCl einen Beleg dafür, dass sich in der jeweiligen Präparation ausschließlich die gewünschte Plasmid-DNA befindet.
Beispiel 3: Verwendung salzhaltiger Waschpuffer zur Entfernung von RNA Kontaminationen
Bei Betrachtung der kationischen Detergentien als „lösliche Anionenaustauscher" sollte es möglich sein, mittels eines Stufengradienten, unerwünschte Nukleinsäuren nach der Bindung auf der Membran abzulösen, und so eine zusätzliche Selektivität der Bindung zu erhalten.
Im dargestellten Beispiel wurden je 50 ml einer DH5α/pBRCMVβ Kultur (low-copy Plasmid) entsprechend dem Beispielprotokoll 1 mit 1 % CTAB in 0,8 M NaCl an die Membran gebunden. Dann wurde die gebundene DNA mit Waschpuffern verschiedener Kochsalzkonzentrationen gewaschen (optionaler Schritt 10 im Beispielprotokoll):

a) kein optionaler Waschschritt
b) 300 mM NaCl
c) 600 mM NaCl
d) 800 mM NaCl

₂₆₀

Die in den oben stehenden Tabellen aufgeführten experimentellen Daten werden in 1 graphisch wiedergegeben. Im Ergebnis zeigt sich, dass sich die Detergenz-Nukleinsäure-Komplexe auf der Membran wie Nukleinsäuren verhalten, die an einen Anionenaustauscher gebunden werden. Daher lassen sich Verunreinigungen bei geeigneter Salzkonzentration mit einem Waschpuffer selektiv entfernen.
Ferner konnte gezeigt werden, dass mit allen oben angegebenen Detergentien mit einer Kettenlänge von mehr als acht Kohlenstoffatomen, Plasmid DNA identischer Reinheit (OD/Gel-Werte praktisch identisch) an eine Silica-Membran gebunden werden kann. Die Ausbeuten hängen dabei vom verwendeten Detergenz und der dabei verwendeten Salzkonzentrationen (Ionenstärken) der Lösung ab.
Hierbei konnte gezeigt werden, dass eine Bindung auch bei niedrigen Salzkonzentrationen eintritt, bei denen keine Inhibierung der Präzipitation der DNA stattfindet.
Beispiel 4: Qualität der isolierten DNA:
Zur Beurteilung der Qualität der isolierten DNA wurden Vergleiche zwischen alkoholischer Bindechemie und der Bindung mit einem kationischen Detergenz durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen 9 und 10 dargestellt: Untersuchung auf Endotoxin-Kontamination (EU/μg DNA):
Während der Endotoxingehalt bei Anwendung einer alkoholischen Bindechemie im üblichen Bereich für DNA Präparationen mittels Silica-Technologie liegt, liegen die Verunreinigungen bei den CTAB-Präparationen in einem Bereich, der normalerweise nur unter Verwendung von Anionenaustauschersäulen erreicht wird.
Ergebnisse der Transfektion in endotoxinsensitiven Zellen (Huh7):
Transfektionen gelten als kritische Anwendungen, für welche die verwandte Plasmid-DNA möglichst frei von Verunreinigungen (besonders Endotoxinen) sein muss. Die Zellen wurden entsprechend dem SuperFect-Protokoll (Firma QIAGEN, D-40724 Hilden) transfiziert. Als Referenz (100%) diente das mittels einer Anionenaustauschersäule (Ultrapure 100 Firma QIAGEN, D-40724 Hilden) isolierte Plasmid.
Die erzielten Ergebnisse sind in der 2 wiedergegeben.
Die Ergebnisse der Transfektionen zeigten für die mit CTAB isolierte DNA-Werte von ca. 100%, d. h. identisch zu den Präparationen mit einer Anionenaustauschersäule (Ultrapure 100).
Dagegen ergaben die Präparationen mit iso-Propanol-Bindung, im Einklang mit den hohen Endotoxinwerten (s. o.) signifikant schlechtere Transfektionsergebnisse.

Claims

Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren aus einem Lysat dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine Nukleinsäure enthaltende biologische Probe mit einem Lysepuffer lysiert; b) den aus der Lyse resultierenden Ansatz gegebenenfalls mit einem Neutralisationspuffer neutralisiert; c) das so erhaltenen Reaktionsgemisch einer oder mehreren Verbindungen der allgemeinen Formel (I) Y⁺R₁R₂R₃R₄X^– (I)worin Y Stickstoff oder Phosphor R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C₁-C₂₀-Alkylrest, C₃-C₆-Alkenylrest, C₃-C₆-Alkinylrest und/oder einen C₆-C₂₀-Arylrest sowie einen C₆-C₂₆-Aralkylrest und X^– ein Anion einer anorganischen oder organischen, ein- oder mehrbasischen Säure bedeuten können, oder deren wässeriger Lösung versetzt, und mit einer mineralischen Matrix, bevorzugt mit einer auf Silica basierenden Matrix, in Kontakt bringt, d) die Nukleinsäuren mit einem Waschpuffer wäscht; e) die Nukleinsäuren isoliert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ einen höheren Alkylrest vorzugsweise mit 12, 14, 16 oder 18 Kohlenstoffatomen bedeutet, R₂, R₃ und R₄ jeweils eine Methylgruppe bedeuten und Y Stickstoff bedeutet.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ einen Aralkylrest, vorzugsweise eine Benzylgruppe, R₂ einen höheren Alkylrest, vorzugsweise mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen, bedeutet und R₃ und R₄ jeweils eine Methylgruppe bedeuten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Gegenion X Bromid, Chlorid, Phosphat, Sulfat, Formfiat, Acetat, Propionat, Oxalat oder Succinat ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Lysepuffer eine wässerige Lösung enthaltend 200 mM NaOH und 1 Gew-%/V SDS eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Neutralisationspuffer eine 2 – 3 M wässrige Kaliumacetat-Lösung eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Waschpuffer eine 500 – 600 mM, vorzugsweise 540 mM, wässrige Kochsalz Lösung und/oder als Waschpuffer eine Lösung enthaltend Tris/HCl, pH 7,5 in 70 – 90 %-iger Ethanol-Lösung in Wasser eingesetzt wird.
Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) Y⁺R₁R₂R₃R₄X^– (I)worin Y Stickstoff oder Phosphor R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C₁-C₂₀-Alkylrest, C₃-C₆-Alkenylrest, C₃-C₆-Alkinylrest und/oder einen C₆-C₂₀-Arylrest sowie einen C₆-C₂₆-Aralkylrest und X^– ein Anion einer anorganischen oder organischen, ein- oder mehrbasischen Säure zur Bindung von Nukleinsäuren an eine mineralische Matrix.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ einen höheren Alkylrest vorzugsweise mit 12, 14, 16 oder 18 Kohlenstoffatomen bedeutet, R₂, R₃ und R₄ jeweils eine Methylgruppe bedeuten und Y Stickstoff bedeutet.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ eine Aralkylgruppe, vorzugsweise eine Benzylgruppe, R₂ einen höheren Alkylrest, vorzugsweise mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen, bedeutet und R₃ und R₄ jeweils eine Methylgruppe bedeuten.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Gegenion X Bromid, Chlorid, Phosphat, Sulfat, Formfiat, Acetat, Propionat, Oxalat oder Succinat ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die mineralische Matrix aus einem porösen und/oder nicht-porösen Träger auf der Basis von Metalloxiden oder Metallmischoxiden aufgebaut ist.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die mineralische Matrix aus einer Silizium-Sauerstoff-Verbindung, bevorzugt Siliziumdioxid, bzw. aus einem Silikat besteht.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die mineralische Matrix aus Glas, Silicagel bzw. einem Zeolith besteht.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die mineralische Matrix aus Aluminiumoxid, Titandioxid und/oder Zirkondioxid besteht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass Mischungen der genannten Metalloxide eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 16 zur Bindung von DNA und/oder RNA.
Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der DNA um genomische DNA, Plasmid-DNA und/oder plastidäre DNA handelt.
Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der RNA um mRNA, tRNA, rRNA und/oder sn-RNA handelt.
Kit zum Isolieren und oder Reinigen von Nukleinsäuren, enthaltend folgende Bestandteile – eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) Y⁺R₁R₂R₃R₄X^– (I)worin Y Stickstoff oder Phosphor R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C₁-C₂₀-Alkylrest, C₃-C₆-Alkenylrest, C₃-C₆-Alkinylrest und/oder einen C₆-C₂₀-Arylrest sowie einen C₆-C₂₆-Aralkylrest und X^– ein Anion einer anorganischen oder organischen, ein- oder mehrbasischen Säure ggf. vorliegend in wässeriger Lösung und/oder – ggf. einen Lysepuffer und/oder – ggf. einen Neutralisationspuffer und/oder – ggf. eine Waschpuffer und/oder – ggf. eine mineralische Matrix, die Nukleinsäuren binden kann.
Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ einen höheren Alkylrest vorzugsweise mit 12, 14, 16 oder 18 Kohlenstoffatomen bedeutet, R₂, R₃ und R₄ jeweils eine Methylgruppe bedeuten und Y Stickstoff bedeutet.
Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ einen Aralkylrest, vorzugsweise eine Benzylgruppe, R₂ einen höheren Alkylrest, vorzugsweise mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen, bedeutet und R₃ und R₄ eine Methylgruppe jeweils eine Methylgruppe bedeuten.
Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Gegenion X Bromid, Chlorid, Phosphat, Sulfat, Formfiat, Acetat, Propionat, Oxalat oder Succinat ist.