CN104195131A - 一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，包括将含烟粉虱内共生菌的菌胞提取物用变性溶液处理，加入蛋白酶和溶菌酶进行裂解，再加入SDS溶液进行处理，再加入萃取剂进行萃取后的上清液用异丙醇沉淀，最后用核酸吸附树脂进行纯化，得到DNA。本发明方法直接提取宏基因组DNA，整个过程简单、不需要花费贵重的药品，比较经济、实用，本发明方法可以从烟粉虱内共生菌菌胞中提取出高纯度，分子大小在30kb以上的微生物宏基因组DNA。本发明方法特别适用于从昆虫内共生菌提取物中提取宏基因组DNA，同时也适合从其它一些微生物样品中提取宏基因组DNA。

Description

一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种从少量微生物样品中提取宏基因组DNA的方法，具体涉及一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法。

背景技术

自然界中内共生菌与昆虫宿主生物学密切相关，烟粉虱与其体内共生细菌的互作引起了广泛的关注，相信对其共生细菌的深入研究将有助于对烟粉虱这些同翅类害虫的防治。但目前内共生菌功能研究的“瓶颈”在于无法实现体外纯培养，因此对烟粉虱内共生菌的功能了解甚少。通过去除昆虫体内共生细菌是内共生菌功能研究的间接手段，但是热处理、溶菌酶处理和抗生素处理都有很大程度上的不适用性。以核酸物质为基础的分子生物学技术的应用克服了培养技术的限制，为研究昆虫共生微生物提供了强有力的手段。但是昆虫共生微生物，尤其是昆虫内共生微生物含量很少，现有技术中的DNA提取方法在操作中由于宿主大量残留物质的干涉，抽提过程中的降解与损失，酶类、抑制剂等杂质的共提取及纯化效率的高低都影响所得到的核酸物质的质量，从而限制了研究开发的进行，因此有必要建立一种方法用于高效率地提取昆虫共生微生物，尤其是昆虫内共生微生物的宏基因组DNA。

许多实验方法已经描述了如何从各种混合物(如：土壤)中提取微生物宏基因组DNA，也有商业用途的试剂盒，但现有的技术中DNA提取方法对实验设备和操作技术要求较高，并且这些方法都是针对生物量多或样品量多的样品，获得的DNA在大小，纯度方面有很多的区别。而昆虫内共生菌由于生物量少，抑制剂成分复杂，而且样品获取不易。因此建立一种经济而又实用的高效提取昆虫体内微生物DNA的方法显得尤为必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，解决了现有技术中存在的难以从少量微生物样品中提取出高纯度，分子大小在30kb以上的微生物宏基因组DNA的问题。

本发明所采用的技术方案是，一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，将含烟粉虱内共生菌的菌胞提取物用变性溶液处理，加入蛋白酶和溶菌酶进行裂解，加入SDS(十二烷基磺酸钠)溶液进行处理，再加入萃取剂进行萃取后的上清液用异丙醇沉淀，最后用核酸吸附树脂进行纯化，得到DNA。

具体包括如下步骤：

步骤1：

将含烟粉虱内共生菌菌胞提取物用变性溶液处理，烟粉虱内共生菌菌胞提取物与变性溶液的湿重量-体积比为1g：(1-2)mL，得到混合溶液；

步骤2：

向步骤1得到的混合溶液中加入核酸提取缓冲液和酶，混合均匀后在37℃的条件下温育1h-2h，再加入质量浓度为20％的SDS溶液，在65℃的水浴中温育1h-2h，每15min轻微地颠倒混匀数次，然后离心处理得到上清液；重复此步骤三次，收集三次离心处理得到的上清液；

其中，核酸提取缓冲液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为(1-6)mL：1g，SDS溶液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为(0.2-2)mL：1g；

酶为蛋白酶K和溶菌酶同时使用，其中加入蛋白酶K的量为加入蛋白酶K后其终浓度达到30-45μg/mL，加入溶菌酶的量为加入溶菌酶后其终浓度达到2-3mg/mL；

步骤3：

向步骤2得到的上清液中加入高盐溶液，混匀，接着加入阳离子去污剂，混匀，在65℃条件下水浴保温5min，再加入pH为4.5的萃取剂I，充分混匀后离心处理，吸收上层水相溶液转移入一个经过消毒处理后的容器中；

其中，加入高盐的量为加入高盐后其终浓度达到30-45μg/mL，加入阳离子去污剂的量为加入阳离子去污剂后其终浓度达到0.2-1.5μg/mL，萃取剂I的体积加入量为加入阳离子去污剂后溶液体积的2倍；

步骤4：

向步骤3得到的上层水相溶液中加入pH为4.5的萃取剂II，充分混合均匀后离心处理，吸收上层水相溶液转移入另一个经过消毒处理后的容器中，重复此步骤直至抽提液中没有絮状物；

萃取剂II的体积加入量与步骤3中得到的上层水相溶液的体积相等；

步骤5：

向步骤4得到的水相溶液中加入步骤4得到的水相溶液的1/10倍体积的3M醋酸钠和与步骤4得到的水相溶液等体积的在-20℃-(-40)℃下预冷的异丙醇，混合均匀后在-20℃下沉淀2-3h，离心处理去除上清液，用70％的乙醇冲洗数次，吹干，加入DEPC处理过的双蒸水，在-70℃的温度中保存，得到核酸物质粗提液；

其中，双蒸水与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为(0.5-3)mL：1g；

步骤6：

向步骤5得到的核酸物质粗提液中加入核酸吸附树脂，核酸吸附树脂与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-比湿重量为(0.5-2)mL：1g，用洗脱液洗脱吸附于树脂上的核酸物质，然后离心处理得到含有核酸物质的滤液，最后用与含有核酸物质的滤液等体积的在-20℃-(-40)℃下预冷的异丙醇沉淀滤液，得到的沉淀即为DNA。

本发明的特点还在于，

步骤1中的变性溶液组成为：4-6M的异硫氰酸胍，pH7.0-pH8.0的10mM的Tris-HCl(Tris为三羟甲基氨基甲烷)缓冲液，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，体积终浓度为0.5％的2-巯基乙醇。

步骤2中的核酸提取缓冲液组成为：pH为7.5的10mM磷酸钠缓冲液，pH为7.5的10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为8.0的10mM的EDTA，1-2M的NaCl，质量终浓度为1％的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，质量终浓度为5-10％的蔗糖。

步骤2中离心处理转速为4000g、时间为15min。

步骤3中高盐为5mol/L的NaCl溶液，阳离子去污剂为10mol/L的CTAB溶液；萃取剂I由体积比为25：24：1的苯酚、氯仿、异戊醇组成。

步骤3中加入萃取剂I后离心处理的转速为15000g、时间为15-20min。

步骤4中萃取剂II由体积比为24:1的氯仿与异戊醇组成。

步骤4离心处理的转速为15000g、时间为15-20min。

步骤5离心处理的转速为18000g、离心时长为15-20min。

步骤6中洗脱液由pH为8.0的40mmol/L的醋酸和pH为8.0的2mM的EDTA组成；步骤6离心处理转速为15000g、时间为5min。

本发明的有益效果是：本发明一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，提取过程中先加入了变性溶液处理之后再进行提取有利于分离出高分子量核酸；核酸提取缓冲液加入蔗糖溶液能减少提取过程中对DNA分子的剪切，加入溶菌酶能保证最大限度地裂解菌胞提取物中的微生物；本发明一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，提取到的宏基因组DNA纯度比较高，分子大小足够满足后续实验的需要，且从操作上来说，本方法简单容易实行，所需试剂都比较普通，能够节省实验室经济成本。

附图说明

图1是提取的宏基因组DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，将含烟粉虱内共生菌的菌胞提取物(菌胞提取物采用已公开的发明名称为“一种烟粉虱内共生菌菌胞的提取方法”的发明专利中的提取方法进行提取得到，该发明申请号：CN20120145628，申请日：2012.05.09，公开号：CN103387945A，公开日：2013.11.13)用变性溶液处理，加入蛋白酶和溶菌酶进行裂解，加入SDS溶液进行处理，再加入萃取剂进行萃取后的上清液用异丙醇沉淀，最后用核酸吸附树脂进行纯化，得到DNA。

具体包括如下步骤：

步骤1：

将含烟粉虱内共生菌菌胞提取物用变性溶液(变性溶液组成为：4-6M的异硫氰酸胍，pH7.0-pH8.0的10mM的Tris-HCl缓冲液，1mM的EDTA，体积终浓度为0.5％的2-巯基乙醇)处理，烟粉虱内共生菌菌胞提取物与变性溶液的湿重量-体积比为1g：(1-2)mL，得到混合溶液；

步骤2：

向步骤1处理后的样品中加入核酸提取缓冲液(核酸提取缓冲液组成为：pH为7.5的10mM的磷酸钠缓冲液，pH为7.5的10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为8.0的10mM的EDTA，1-2M的NaCl，质量终浓度为1％的CTAB，质量终浓度为5-10％的蔗糖)和酶(酶为蛋白酶K和溶菌酶同时使用，其中加入蛋白酶K的量为加入蛋白酶K后其终浓度达到30-45μg/mL，加入溶菌酶的量为加入溶菌酶后其终浓度达到2-3mg/mL)，核酸提取缓冲液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为(1-6)mL：1g，SDS溶液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为(0.2-2)mL：1g，混合均匀后在37℃的条件下温育1h-2h，再加入质量浓度为20％SDS溶液，在65℃的水浴中温育1h-2h，每15min轻微地颠倒混匀数次，然后以4000g的转速离心处理15min得到上清液；重复此步骤三次，收集三次离心处理得到的上清液；

步骤3：

向步骤2得到的上清液中加入5mol/L的NaCl溶液，加入高盐后高盐的终浓度达到30-45μg/mL，混匀，接着加入10mol/L的CTAB溶液，加入CTAB溶液后CTAB溶液的终浓度达到0.2-1.5μg/mL，混匀，在65℃下水浴保温5min，再加入pH为4.5的萃取剂I(萃取剂I由体积比为25：24：1的苯酚、氯仿、异戊醇组成，萃取剂I的体积加入量为加入CTAB溶液体积的2倍)，充分混匀后以15000g的转速离心处理15-20min，吸收上层水相溶液转移入一个经过消毒处理后的容器中；

步骤4：

向步骤3得到的上层水相溶液中加入pH为4.5的萃取剂II(萃取剂II由体积比为24:1的氯仿与异戊醇组成，萃取剂II的体积加入量与步骤3中得到的上层水相溶液的体积相等)，充分混合均匀后以15000g的转速离心处理15-20min，吸收上层水相溶液转移入另一个经过消毒处理后的容器中，重复此步骤直至抽提液中没有絮状物；

步骤5：

向步骤4得到的水相溶液中加入步骤4得到的水相溶液的1/10倍体积的3M的醋酸钠和与步骤4得到的水相溶液等体积的在-20℃-(-40)℃下预冷的异丙醇，混合均匀后在-20℃下沉淀2-3h，离心处理去除上清液，用70％乙醇冲洗数次，吹干，加入DEPC处理过的双蒸水，双蒸水与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为(0.5-3)mL：1g，在-70℃的温度中保存，得到核酸物质粗提液；

步骤6：

向步骤5得到的核酸物质粗提液中加入核酸吸附树脂，核酸吸附树脂与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-比湿重量为(0.5-2)mL：1g，用洗脱液(洗脱液由pH为8.0的40mmol/L的醋酸和pH为8.0的2mMEDTA组成)洗脱吸附于树脂上的核酸物质，然后以15000g的转速离心处理5min得到含有核酸物质的滤液，最后用与含有核酸物质的滤液等体积的在-20℃-(-40)℃下预冷的异丙醇沉淀滤液，得到DNA。

本发明中所有的试剂和容器均经DEPC浸泡处理，或180℃烘干3h。

本发明中所使用的烟粉虱采集后用75％乙醇进行体表杀菌消毒，然后立即进行菌胞提取，放于-80℃以下的温度中冷冻保存。

实施例1

步骤1：

将含烟粉虱内共生菌菌胞提取物用变性溶液(变性溶液组成为：4M的异硫氰酸胍，pH为7.0的10mM的Tris-HCl缓冲液，1mM的EDTA，体积终浓度为0.5％的2-巯基乙醇)处理，烟粉虱内共生菌菌胞提取物与变性溶液的湿重量-体积比为1g：1mL，得到混合溶液；

步骤2：

向步骤1处理后的样品中加入核酸提取缓冲液(核酸提取缓冲液组成为：pH为7.5的10mM的磷酸钠缓冲液，pH为7.5的10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为8.0的10mM的EDTA，1.5M的NaCl，质量终浓度为1％的CTAB，质量终浓度为10％的蔗糖)和酶(酶为蛋白酶K和溶菌酶同时使用，其中加入蛋白酶K的量为加入蛋白酶K后其终浓度达到30μg/mL，加入溶菌酶的量为加入溶菌酶后其终浓度达到3mg/mL)，核酸提取缓冲液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为4mL：1g，SDS溶液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为1mL：1g，混合均匀后在37℃的条件下温育1h，再加入质量浓度为20％SDS溶液，在65℃的水浴中温育2h，每15min轻微地颠倒混匀数次，然后以4000g的转速离心处理15min得到上清液；重复此步骤三次，收集三次离心处理得到的上清液；

步骤3：

向步骤2得到的上清液中加入5mol/L的NaCl溶液，加入高盐后高盐的终浓度达到40μg/mL，混匀，接着加入10mol/L的CTAB溶液，加入CTAB溶液后CTAB溶液的终浓度达到1.5μg/mL，混匀，在65℃下水浴保温5min，再加入pH为4.5的萃取剂I(萃取剂I由体积比为25：24：1的苯酚、氯仿、异戊醇组成，萃取剂I的体积加入量为加入CTAB溶液体积的2倍)，充分混匀后以15000g的转速离心处理15min，吸收上层水相溶液转移入一个经过消毒处理后的容器中；

步骤4：

向步骤3得到的上层水相溶液中加入pH为4.5的萃取剂II(萃取剂II由体积比为24:1的氯仿与异戊醇组成，萃取剂II的体积加入量与步骤3中得到的上层水相溶液的体积相等)，充分混合均匀后以15000g的转速离心处理20min，吸收上层水相溶液转移入另一个经过消毒处理后的容器中，重复此步骤直至抽提液中没有絮状物；

步骤5：

向步骤4得到的水相溶液中加入步骤4得到的水相溶液的1/10倍体积的3M的醋酸钠和与步骤4得到的水相溶液等体积的在-20℃下预冷的异丙醇，混合均匀后在-20℃下沉淀2.5h，离心处理去除上清液，用70％乙醇冲洗数次，吹干，加入DEPC处理过的双蒸水，双蒸水与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为2mL：1g，在-70℃的温度中保存，得到核酸物质粗提液；

步骤6：

向步骤5得到的核酸物质粗提液中加入核酸吸附树脂，核酸吸附树脂与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-比湿重量为1mL：1g，用洗脱液(洗脱液由pH为8.0的40mmol/L的醋酸和pH为8.0的2mM EDTA组成)洗脱吸附于树脂上的核酸物质，然后以15000g的转速离心处理5min得到含有核酸物质的滤液，最后用与含有核酸物质的滤液等体积的在-20℃下预冷的异丙醇沉淀滤液，得到DNA。

实施例2：

步骤1：

将含烟粉虱内共生菌菌胞提取物用变性溶液(变性溶液组成为：6M的异硫氰酸胍，pH为7.5的10mM的Tris-HCl缓冲液，1mM的EDTA，体积终浓度为0.5％的2-巯基乙醇)处理，烟粉虱内共生菌菌胞提取物与变性溶液的湿重量-体积比为1g：2mL，得到混合溶液；

步骤2：

向步骤1处理后的样品中加入核酸提取缓冲液(核酸提取缓冲液组成为：pH为7.5的10mM的磷酸钠缓冲液，pH为7.5的10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为8.0的10mM的EDTA，1M的NaCl，质量终浓度为1％的CTAB，质量终浓度为5％的蔗糖)和酶(酶为蛋白酶K和溶菌酶同时使用，其中加入蛋白酶K的量为加入蛋白酶K后其终浓度达到40μg/mL，加入溶菌酶的量为加入溶菌酶后其终浓度达到2mg/mL)，核酸提取缓冲液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为1mL：1g，SDS溶液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为0.2mL：1g，混合均匀后在37℃的条件下温育1.5h，再加入质量浓度为20％SDS溶液，在65℃的水浴中温育1h，每15min轻微地颠倒混匀数次，然后以4000g的转速离心处理15min得到上清液；重复此步骤三次，收集三次离心处理得到的上清液；

步骤3：

向步骤2得到的上清液中加入5mol/L的NaCl溶液，加入高盐后高盐的终浓度达到45μg/mL，混匀，接着加入10mol/L的CTAB溶液，加入CTAB溶液后CTAB溶液的终浓度达到1μg/mL，混匀，在65℃下水浴保温5min，再加入pH为4.5的萃取剂I(萃取剂I由体积比为25：24：1的苯酚、氯仿、异戊醇组成，萃取剂I的体积加入量为加入CTAB溶液体积的2倍)，充分混匀后以15000g的转速离心处理20min，吸收上层水相溶液转移入一个经过消毒处理后的容器中；

步骤4：

向步骤3得到的上层水相溶液中加入pH为4.5的萃取剂II(萃取剂II由体积比为24:1的氯仿与异戊醇组成，萃取剂II的体积加入量与步骤3中得到的上层水相溶液的体积相等)，充分混合均匀后以15000g的转速离心处理18min，吸收上层水相溶液转移入另一个经过消毒处理后的容器中，重复此步骤直至抽提液中没有絮状物；

步骤5：

向步骤4得到的水相溶液中加入步骤4得到的水相溶液的1/10倍体积的3M的醋酸钠和与步骤4得到的水相溶液等体积的在-30℃下预冷的异丙醇，混合均匀后在-20℃下沉淀3h，离心处理去除上清液，用70％乙醇冲洗数次，吹干，加入DEPC处理过的双蒸水，双蒸水与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为3mL：1g，在-70℃的温度中保存，得到核酸物质粗提液；

步骤6：

向步骤5得到的核酸物质粗提液中加入核酸吸附树脂，核酸吸附树脂与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-比湿重量为2mL：1g，用洗脱液(洗脱液由pH为8.0的40mmol/L的醋酸和pH为8.0的2mM EDTA组成)洗脱吸附于树脂上的核酸物质，然后以15000g的转速离心处理5min得到含有核酸物质的滤液，最后用与含有核酸物质的滤液等体积的在-40℃下预冷的异丙醇沉淀滤液，得到DNA。

实施例3

步骤1：

将含烟粉虱内共生菌菌胞提取物用变性溶液(变性溶液组成为：5M的异硫氰酸胍，pH为8.0的10mM的Tris-HCl缓冲液，1mM的EDTA，体积终浓度为0.5％的2-巯基乙醇)处理，烟粉虱内共生菌菌胞提取物与变性溶液的湿重量-体积比为1g：1.5mL，得到混合溶液；

步骤2：

向步骤1处理后的样品中加入核酸提取缓冲液(核酸提取缓冲液组成为：pH为7.5的10mM的磷酸钠缓冲液，pH为7.5的10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为8.0的10mM的EDTA，2M的NaCl，质量终浓度为1％的CTAB，质量终浓度为8％的蔗糖)和酶(酶为蛋白酶K和溶菌酶同时使用，其中加入蛋白酶K的量为加入蛋白酶K后其终浓度达到45μg/mL，加入溶菌酶的量为加入溶菌酶后其终浓度达到2.5mg/mL)，核酸提取缓冲液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为6mL：1g，SDS溶液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为2mL：1g，混合均匀后在37℃的条件下温育2h，再加入质量浓度为20％SDS溶液，在65℃的水浴中温育1.5h，每15min轻微地颠倒混匀数次，然后以4000g的转速离心处理15min得到上清液；重复此步骤三次，收集三次离心处理得到的上清液；

步骤3：

向步骤2得到的上清液中加入5mol/L的NaCl溶液，加入高盐后高盐的终浓度达到30μg/mL，混匀，接着加入10mol/L的CTAB溶液，加入CTAB溶液后CTAB溶液的终浓度达到0.2μg/mL，混匀，在65℃下水浴保温5min，再加入pH为4.5的萃取剂I(萃取剂I由体积比为25：24：1的苯酚、氯仿、异戊醇组成，萃取剂I的体积加入量为加入CTAB溶液体积的2倍)，充分混匀后以15000g的转速离心处理18min，吸收上层水相溶液转移入一个经过消毒处理后的容器中；

步骤4：

向步骤3得到的上层水相溶液中加入pH为4.5的萃取剂II(萃取剂II由体积比为24:1的氯仿与异戊醇组成，萃取剂II的体积加入量与步骤3中得到的上层水相溶液的体积相等)，充分混合均匀后以15000g的转速离心处理15min，吸收上层水相溶液转移入另一个经过消毒处理后的容器中，重复此步骤直至抽提液中没有絮状物；

步骤5：

向步骤4得到的水相溶液中加入步骤4得到的水相溶液的1/10倍体积的3M的醋酸钠和与步骤4得到的水相溶液等体积的在-40℃下预冷的异丙醇，混合均匀后在-20℃下沉淀2h，离心处理去除上清液，用70％乙醇冲洗数次，吹干，加入DEPC处理过的双蒸水，双蒸水与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为0.5mL：1g，在-70℃的温度中保存，得到核酸物质粗提液；

步骤6：

向步骤5得到的核酸物质粗提液中加入核酸吸附树脂，核酸吸附树脂与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-比湿重量为0.5mL：1g，用洗脱液(洗脱液由pH为8.0的40mmol/L的醋酸和pH为8.0的2mM EDTA组成)洗脱吸附于树脂上的核酸物质，然后以15000g的转速离心处理5min得到含有核酸物质的滤液，最后用与含有核酸物质的滤液等体积的在-30℃下预冷的异丙醇沉淀滤液，得到DNA。

本发明提取的DNA评价：

图1为采用本发明一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法所提取的宏基因组DNA经50V电压琼脂糖凝胶电泳3h后的电泳结果，所用Marker为λDNA/HindⅢ。从图上可以看出经50V电压电泳3h后，泳道中的宏基因组DNA已清晰显现且远在Marker最大条带23130bp之上，说明所提宏基因组DNA足够大且纯度比较好能满足后续实验的要求。

本发明一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法同时也可以应用于其它昆虫样品中微生物宏基因组DNA的提取。

Claims (10)

1.一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，其特征在于，首先将含烟粉虱内共生菌的菌胞提取物用变性溶液处理，加入蛋白酶和溶菌酶进行裂解，再加入SDS溶液进行处理，再加入萃取剂进行萃取后的上清液用异丙醇沉淀，最后用核酸吸附树脂进行纯化，得到DNA。

2.根据权利要求1所述的一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤1：

将含烟粉虱内共生菌的菌胞提取物用变性溶液处理，烟粉虱内共生菌的菌胞提取物与变性溶液的湿重量-体积比为1g：(1-2)mL，得到混合溶液；

步骤2：

向所述步骤1得到的混合溶液中加入核酸提取缓冲液和酶，混合均匀后在37℃的条件下温育1h-2h，再加入质量浓度为20％的SDS溶液，在65℃的水浴中温育1h-2h，每15min轻微地颠倒混匀数次，然后离心处理得到上清液；重复此步骤三次，收集三次离心处理得到的上清液；

其中，核酸提取缓冲液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为(1-6)mL：1g，SDS溶液与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为(0.2-2)mL：1g；

酶为蛋白酶K和溶菌酶同时使用，其中加入蛋白酶K的量为加入蛋白酶K后其终浓度达到30-45μg/mL，加入溶菌酶的量为加入溶菌酶后其终浓度达到2-3mg/mL；

步骤3：

向所述步骤2得到的上清液中加入高盐溶液，混匀，接着加入阳离子去污剂，混匀，在65℃条件下水浴保温5min，再加入pH为4.5的萃取剂I，充分混匀后离心处理，吸收上层水相溶液转移入一个经过消毒处理后的容器中；

其中，加入高盐的量为加入高盐后其终浓度达到30-45μg/mL，加入阳离子去污剂的量为加入阳离子去污剂后其终浓度达到0.2-1.5μg/mL，萃取剂I的体积加入量为加入阳离子去污剂后溶液体积的2倍；

步骤4：

向所述步骤3得到的上层水相溶液中加入pH为4.5的萃取剂II，充分混合均匀后离心处理，吸收上层水相溶液转移入另一个经过消毒处理后的容器中，重复此步骤直至抽提液中没有絮状物；

萃取剂II的体积加入量与步骤3中得到的上层水相溶液的体积相等；

步骤5：

向所述步骤4得到的水相溶液中加入步骤4得到的水相溶液的1/10倍体积的3M醋酸钠和与步骤4得到的水相溶液等体积的在-20℃-(-40)℃下预冷的异丙醇，混合均匀后在-20℃下沉淀2-3h，离心处理去除上清液，用70％的乙醇冲洗数次，吹干，加入DEPC处理过的双蒸水，在-70℃的温度中保存，得到核酸物质粗提液；

其中，双蒸水与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-湿重量比为(0.5-3)mL：1g；

步骤6：

向所述步骤5得到的核酸物质粗提液中加入核酸吸附树脂，核酸吸附树脂与所述步骤1中烟粉虱内共生菌菌胞提取物的体积-比湿重量为(0.5-2)mL：1g，用洗脱液洗脱吸附于树脂上的核酸物质，然后离心处理得到含有核酸物质的滤液，最后用与含有核酸物质的滤液等体积的在-20℃-(-40)℃下预冷的异丙醇沉淀滤液，得到的沉淀即为DNA。

3.根据权利要求2所述的一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤1中的变性溶液组成为：4-6M的异硫氰酸胍，pH7.0-pH8.0的10mM的Tris-HCl缓冲液，1mM的乙二胺四乙酸，体积终浓度为0.5％的2-巯基乙醇。

4.根据权利要求2所述的一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤2中的核酸提取缓冲液组成为：pH为7.5的10mM的磷酸钠缓冲液，pH为7.5的10mM的Tris-HCl缓冲液，pH为8.0的10mM的EDTA，1-2M的NaCl，质量终浓度为1％的CTAB，质量终浓度为5-10％的蔗糖。

5.根据权利要求2所述的一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤2中离心处理转速为4000g、离心时长为15min。

6.根据权利要求2所述的一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤3中高盐为5mol/L的NaCl溶液，阳离子去污剂为10mol/L的CTAB溶液；

萃取剂I由体积比为25：24：1的苯酚、氯仿、异戊醇组成。

7.根据权利要求2所述的一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤3中加入萃取剂I后离心处理的转速为15000g、离心时长为15-20min。

8.根据权利要求2所述的一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤4中萃取剂II由体积比为24:1的氯仿与异戊醇组成；

所述步骤4离心处理的转速为15000g、离心时长为15-20min。

9.根据权利要求2所述的一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤5离心处理的转速为18000g、离心时长为15-20min。

10.根据权利要求2所述的一种从烟粉虱内共生菌菌胞中提取宏基因组DNA的方法，其特征在于，所述步骤6中洗脱液由pH为8.0的40mmol/L的醋酸和pH为8.0的2mM的EDTA组成；

所述步骤6离心处理转速为15000g、离心时长为5min。