CN109234415A - 一种海洋可培养细菌pcr快速检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种海洋可培养细菌pcr快速检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种适用于海洋可培养细菌PCR快速检测的方法及试剂盒，属于微生物检测技术领域。该试剂盒包括DNA提取试剂、PCR反应试剂、电泳试剂；其中，DNA提取试剂为Chelex‑100；PCR反应试剂包括2条通用16S rRNA引物（27F和1492R）和2×Taq PCR Mastermix溶液；电泳试剂包括琼脂糖、50×TBE、Goldview II型核酸染料、DNA Marker。本试剂盒可在短时间内对海洋可培养细菌进行DNA扩增，步骤简单，并且安全、经济、高效，菌体需要量小。

Description

一种海洋可培养细菌PCR快速检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种海洋可培养细菌快速PCR检测的方法及试剂盒。
背景技术
由于陆生资源的研究趋于常态化，可利用材料越来越少，现有微生物分子生态学研究表明海洋中蕴藏大量微生物资源，这些微生物对地球物质循环、生态平衡和人类健康具有十分重要的意义，因此，更多的国内外研究者将注意力放在了海洋上。因海洋独特的环境赋予了海洋细菌新颖、特意和多样化的代谢活性物质，海洋细菌的研究越来越多。细菌的鉴定是微生物研究的重要内容，是分析其独特生理生化和代谢活性多样性等必要的研究手段。这里说的海洋可培养细菌指的是海水、沉积物中存在的和海洋动植物上的共生菌。
目前，海洋细菌中常规的聚合酶链反应（PCR）检测中，通常采用的是SDS高盐提取法、碱性裂解法、酚、氯仿抽提法和溶菌酶法提取细菌DNA，这些传统的DNA提取方法步骤繁琐，费时费力，菌体需要量大，效果不理想。而本发明中DNA的提取采用的是Chelex-100法，该方法的优点是一步提取，是一种快速、高效、经济的DNA提取方法。而且现在还没有专门用于海洋细菌快速PCR的试剂盒。
发明内容
本发明的目的是针对海洋可培养细菌，提供一种检测快速快、操作简单、成本低且灵敏度高的PCR检测方法及试剂盒。为实现本发明目的所使用的技术方案为：
一种海洋细菌快速PCR试剂盒，包括DNA提取试剂、PCR反应试剂电泳试剂；其中：
（1）DNA提取试剂：Chelex-100，浓度为10%（w/v）；
（2）PCR反应试剂：16S rDNA通用引物、2×Taq PCR Mastermix和ddH2O；
其中，通用引物序列为现有技术中的27F和1492R，其序列分别为：
27F：5ʹ-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3ʹ；
1492R：5ʹ-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3ʹ。
（3）电泳试剂：琼脂糖、50×TBE、Goldview II型核酸染料、DNA Marker。
一种用海洋可培养细菌PCR快速检测试剂盒的方法包括如下步骤：
S1.海洋可培养细菌DNA的提取：
移取100µL 10%（w/v）无菌Chelex-100溶液至1.5mLEppendorf管中，用灭菌后的牙签挑取纯培养后的菌落，挑取米粒大小至管壁上碾碎分散并使Chelex-100溶液溶解混匀。沸水浴10min后冷却至室温后低速离心10min，上清液即为PCR模板，可于-20℃保持备用。
扩增反应体系制备：取0.5mLPCR管依次加入以下溶液形成50µL反应体系：
引物27F 1µL，
引物1492R 1µL，
2×Taq PCR Mastermix 25µL，
ddH2O 22µL，
DNA模板 1µL；
S3.PCR反应参数设定：
93-96℃变性、4-6min；
92-95℃变性、0.5-2min；
52-58℃复性、3-7min；
70-75℃延伸、1-3min；
70-75℃延伸、8-13min；共27-32个循环；
本发明中PCR反应参数的设置，本申请发明人通过大量的创造性试验，获得使模板DNA和PCR产物的充分变性的条件，能够在提高产量的同时保持酶活性。通过反应体系中的基本组成及扩增引物的长度和浓度，本申请发明人依据海洋可培养细菌DNA的特性，提高退火温度和复性时间，与现有技术中的复性时间相比，反应时间长，以此增加扩增的特异性；本申请通过对延伸温度和时间的控制，不仅能够保持扩增产物的特异性，同时可保证产量。通过本申请设置的循环次数范围内，扩增DNA增加明显，可进一步增加产量时，同时避免增加非特异扩增。因此，本发明中的PCR反应参数是本发明人依据海洋可培养细菌DNA的特性，通过大量创造性试验获得的，可保证模板DNA的特异性反应的进行以及提高扩增DNA的产量。
电泳检测：
制备浓度为1%琼脂糖TBE凝胶，其中加入1µL Goldview II型核酸染料，取2µLPCR产物上样，电压100V，电泳时间30min后，在260nm处凝胶成像分析系统观察。如果在1000bp处有清晰条带的，说明该样品PCR成功，可将样品扩增产物送测序公司进行测序。
本申请中针对海洋可培养细菌的特性，本申请发明人选用16SrDNA通用引物作为引物，是基于：（1）16SrRNA普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是18SrRNA）中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。（2）在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。（3）16SrRNA的相对分子量大小适中，约1540个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。分离菌株16SrRNA基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞,加入100μL无菌重蒸H2O中,旋涡混匀后,沸水浴2min,12000rmin-1离心5min,上清液中即含16SrRNA基因，可直接用于PCR扩增。由于所设计的引物具有高度的选择特异性，在进行对海洋可培养细菌的检测时，要求引物所针对的靶序列位点应当相当保守，这样所建立的反应体系才具有普遍的适用性。研究中也可以设计一些兼并引物以增强应用的广泛性，但兼并度过高的引物会对扩增造成负面影响，本申请使用的16SrDNA通用引物克服了上述问题，对于海洋可培养细菌的快速检测具有广泛适用性，可广泛适用于一般细菌菌种的鉴定与系统发生学研究。
本发明中，使用的Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，可以高度选择性结合多价阳离子。细胞在 100℃条件或碱性环境下破裂，DNA变性并释放出来，而Chelex可特异性吸附溶液中干扰离子并有效防止煮沸过程和金属离子对DNA的降解作用，之后即可通过离心作用除去溶液中Chelex颗粒，使DNA从结合物中分离出来。Chelex-100法提取DNA不仅简单易行，能缩短提取时间，而且极大的减小了DNA分子的损失，获取率比传统使用酚或氯仿提取法高，对样品的需要量小；并且因为操作步骤的简易，减少了样品在转移抽提等步骤中的所受污染，适用于绝大多数高精度、样品量少的DNA提取。本申请独创性的将Chelex-100试剂应用到海洋可培养细菌的检测当中，并且Chelex-100试剂能够结合多种可能影响下一步分析测试的海洋可培养细菌中的其他外源物质，并能通过结合金属离子，防止DNA降解。
在扩增条件的选择中，考虑到海洋细菌所处的特殊环境（低温、高盐），设定的预变性95℃ 5min；变性温度是模板DNA双链解离的关键温度，温度过高会对降低酶的活性，过低解链不完全，1min的94℃变性温度可以保证DNA完全解链且有较高Taq DNA酶活性；根据引物27F和1492R的序列特点（20个核苷酸，G+C含量约为50%），55℃的退火温度可以减少引物和模板DNA的非特异性结合，提高聚合酶链特异性反应，退火时间延长至5min保证引物与模板之间完全结合；PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合，细菌的目标DNA片段为1500bp，延伸1.5min足够合成“半保留复制链”并成为下次循环的模板。本试剂盒提供的PCR条件经多次实验设定，适合于细菌的快速基因扩增。
现有技术中所用的细菌鉴定技术难点，主要在于：（1）如何简化DNA提取的步骤以及进行微量提取。在一般细菌DNA提取试剂盒中，通常需要将菌液细胞悬浮，加入裂解液后使用吸附柱吸附核酸，分两次加入洗涤液洗去蛋白与盐，再使用洗脱液把柱上的核酸溶解出来；这类试剂盒的DNA提取时间一般在45分钟至1小时左右，而且步骤繁琐，所需材料（悬浮液、悬浮液、裂解液、漂洗液、洗脱液）多，提取菌样需是菌液，需要量在1-5ml。而本试剂盒提供的DNA提取方法一步到位，只需将样液加入Chelex-100后煮沸离心即可，整个操作在25min之内，简单快捷，对于样品状态并无要求（菌液直接加Chelex-100，菌落用竹签碾碎后加入），所需样品量小（菌液20-50µL，菌落10-100µg），DNA纯度高。（2）如何确定扩增条件。为了得到电泳条带清晰的条件，本申请发明人通过大量创造性试验，获得的扩增条件重复性好，扩增效率高，经过多次实验结果显示，适于海洋细菌的基因扩增。
本发明针对海洋可培养细菌菌体DNA微量提取和基因扩增。通过前期实验条件的选择优化，建立了面向海洋细菌DNA提取更简便快捷的方法、更高效的扩增条件以及以该体系为基础构建的样品量少、灵敏度高、方便快捷的试剂盒。与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：
1、菌体状态无要求，适用性广，需要量少；
2、操作简单、防污染；
3、速度快，可在3小时内完成20-25个样品的检测；
4、DNA纯度高；
5、PCR扩增重复性好，电泳条带清晰，使用的扩增条件具有很高的扩增效率。
、本发明对海洋微生物资源的研究，对地球物质循环、生态平衡和人类健康具有十分重要的意义。
附图说明
图1为实施例1南海沉积物可培养细菌基因扩增电泳检测图；
图2为实施例2北海斜阳岛附近海域内采集的柳珊瑚Anthogorgia caerulea共生放线菌基因扩增电泳检测图；
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
南海沉积物可培养细菌的PCR快速测试
S1.样品处理
将10g取至南海海洋沉积物样品放入带有玻璃珠的80ml无菌海水中，28℃，140rpm摇床培养30min后移取1ml悬液加入装有9ml无菌海水中混匀，依次做出10-1-10-5五个不同浓度梯度。采用涂布平板法将0.1ml不同浓度梯度的样品涂布在整个固体培养基上，四个平行，两两分别放置于28℃和10℃培养箱中培养2-7d。根据培养后菌落形态特征进行纯化。
提取
移取100µL 10%（w/v）无菌Chelex-100溶液至1.5mL Eppendorf管中，用灭菌后的牙签挑取纯培养后的菌落，挑取米粒大小至管壁上碾碎分散并使Chelex-100溶液溶解混匀。沸水浴10min后冷却至室温后低速离心10min，上清液即为PCR模板，可于-20℃保持备用。
基因扩增
取1µL模板DNA进行PCR扩增，并以此加入25µLPremix Taq、27F与1492R引物各1µL和1µLddH2O，形成50µLPCR反应体系。其中，通用引物序列为现有技术中的27F和1492R，其序列分别为：
27F：5ʹ-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3ʹ；
1492R：5ʹ-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3ʹ。
反应参数，95℃预变性5分钟，94℃变形1分钟，55℃退火5分钟，72℃延伸1.5分钟，31个循环后，72℃10分钟。
电泳检测
取2µL扩增产物在1%琼脂糖凝胶100V电泳30min，260nm紫外灯下观察并拍照。有目标条带（1000bp）出现，如图1所示，将扩增产物送测序公司进行测序。
实施例2
北海海域中柳珊瑚共生放线菌的PCR快速测试
S1.样品处理
将在北海海域内采集的柳珊瑚Anthogorgia caerulea样品取10g用研钵碾磨后装入到有100ml无菌海水三角形瓶中，28 ℃，140 rpm条件下摇床2天后取出，并取上清液制备10-1-10-5个不同稀释度，吸取0.5 ml各个倍数的稀释液涂布于固体培养上， 28℃下培养3-5 天。待培养出来后根据菌落特征先用肉眼初步区分，做好标记，再用显微镜进一步观察确定分离对象，然后用灭菌竹签挑取其单菌落，四分法重复划线分离纯化。
共生放线菌DNA提取
纯化后的菌株取一定量的单菌落放入含有100μL10%（w/v）无菌Chelex-100的PCR管中，碾碎混匀后离心取上清液作为其DNA模板。
基因扩增
在50μL反应体系中，取1μL DNA原液，25μL 2×Taq PCR Mastermix溶液，引物27F、1492R各1μL，ddH2O 22μL于PCR管，进行PCR扩增。其扩增程序为95℃变性5 min，94 ℃变性1min，55℃复性5 min，72 ℃延伸1.5 min并进行31个循环，72℃延伸10 min。其中，通用引物序列为现有技术中的27F和1492R，其序列分别为：
27F：5ʹ-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3ʹ；
1492R：5ʹ-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3ʹ。
电泳检测
扩增完后取PCR产物2.5μL放于1%琼脂糖凝胶电泳（100V，30min），凝胶成像系统观察并记录，如图2，将扩增产物送测序公司进行测序。
其中，第一到第八个泳道分别为Streptomyces malachitospinus、Micrococcus yunnanensis、Modestobacter versicolor、Kocuria polaris、Kocuria turfanensis、Rhodococcus pyridinivorans、Modestobacter marinus、Dietzia maris，第十二个泳道为Pseudonocardia carboxydivorans、第十四至十七个泳道为Micrococcus luteus、Nocardiopsis alba、Micromonospora sediminicola、Kocuria sediminis，第二十三、二十四个泳道为Saccharopolyspora pathumthaniensis、Saccharomonospora azurea，最后一个泳道为Marker。
实施例3
一种海洋可培养细菌快速PCR的试剂盒，其特征在于，包括：海洋细菌DNA提取试剂、PCR反应试剂、电泳试剂，其中，
（1）海洋细菌DNA提取样品制备及提取试剂浓度：海洋可培养细菌经海水培养基纯培养后的菌落、10%（w/v）无菌Chelex-100溶液；
（2）PCR反应试剂中各原料及其浓度：16S rDNA通用引物（27F、1492R）、10×PCRBuffe、5U/ Taq酶、10Mm dNTP和ddH2O；其中，通用引物序列为现有技术中的27F和1492R，其序列分别为：
27F：5ʹ-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3ʹ；
1492R：5ʹ-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3ʹ。
（3）电泳试剂：琼脂糖、50×TBE、Goldview II型核酸染料、DNA Marker；
一种上述海洋可培养细菌PCR快速检测的试剂盒快速PCR的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.海洋可培养细菌DNA的提取：
移取100µL 10%（w/v）无菌Chelex-100溶液至1.5mLEppendorf管中，用灭菌后的牙签挑取纯培养后的菌落，挑取米粒大小至管壁上碾碎分散并使Chelex-100溶液溶解混匀。沸水浴10min后冷却至室温后低速离心10min，上清液即为PCR模板，可于-20℃保持备用；
S2.DNA扩增反应体系制备：取0.5mLPCR管依次加入以下溶液形成50µL反应体系：
引物27F 1µL，
引物1492R 1µL，
2×Taq PCR Mastermix 25µL，
ddH2O 22µL，
DNA模板 1µL；
S3.PCR反应参数设定：
93℃变性、4min；
92℃变性、0.5min；
52℃复性、3min；
70℃延伸、1min；
70℃延伸、8min；共32个循环；
S4.电泳检测：
制备浓度为1%琼脂糖TBE凝胶，其中加入1µL Goldview II型核酸染料，取2µLPCR产物上样，电压100V，电泳时间30min后，在260nm处凝胶成像分析系统观察。如果在1000bp处有清晰条带的，说明该样品PCR成功。
实施例4
一种海洋可培养细菌快速PCR的试剂盒，其特征在于，包括：海洋细菌DNA提取试剂、PCR反应试剂、电泳试剂，其中，
（1）海洋细菌DNA提取样品制备及提取试剂浓度：海洋可培养细菌经海水培养基纯培养后的菌落、10%（w/v）无菌Chelex-100溶液；
（2）PCR反应试剂中各原料及其浓度：16S rDNA通用引物（27F、1492R）、10×PCRBuffe、5U/ Taq酶、10Mm dNTP和ddH2O；其中，通用引物序列为现有技术中的27F和1492R，其序列分别为：
27F：5ʹ-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3ʹ；
1492R：5ʹ-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3ʹ。
（3）电泳试剂：琼脂糖、50×TBE、Goldview II型核酸染料、DNA Marker；
一种上述海洋可培养细菌PCR快速检测的试剂盒快速PCR的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.海洋可培养细菌DNA的提取：
移取100µL 10%（w/v）无菌Chelex-100溶液至1.5mLEppendorf管中，用灭菌后的牙签挑取纯培养后的菌落，挑取米粒大小至管壁上碾碎分散并使Chelex-100溶液溶解混匀。沸水浴10min后冷却至室温后低速离心10min，上清液即为PCR模板，可于-20℃保持备用；
S2.DNA扩增反应体系制备：取0.5mLPCR管依次加入以下溶液形成50µL反应体系：
引物27F 1µL，
引物1492R 1µL，
2×Taq PCR Mastermix 25µL，
ddH2O 22µL，
DNA模板 1µL；
S3.PCR反应参数设定：
96℃变性、6min；
95℃变性、2min；
58℃复性、7min；
75℃延伸、3min；
75℃延伸、13min；共27个循环；
S4.电泳检测：
制备浓度为1%琼脂糖TBE凝胶，其中加入1µL Goldview II型核酸染料，取2µLPCR产物上样，电压100V，电泳时间30min后，在260nm处凝胶成像分析系统观察。如果在1000bp处有清晰条带的，说明该样品PCR成功。
实施例5
一种海洋可培养细菌快速PCR的试剂盒，其特征在于，包括：海洋细菌DNA提取试剂、PCR反应试剂、电泳试剂，其中，
（1）海洋细菌DNA提取样品制备及提取试剂浓度：海洋可培养细菌经海水培养基纯培养后的菌落、10%（w/v）无菌Chelex-100溶液；
（2）PCR反应试剂中各原料及其浓度：16S rDNA通用引物（27F、1492R）、10×PCRBuffe、5U/ Taq酶、10Mm dNTP和ddH2O；其中，通用引物序列为现有技术中的27F和1492R，其序列分别为：
27F：5ʹ-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3ʹ；
1492R：5ʹ-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3ʹ。
（3）电泳试剂：琼脂糖、50×TBE、Goldview II型核酸染料、DNA Marker；
一种上述海洋可培养细菌PCR快速检测的试剂盒快速PCR的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.海洋可培养细菌DNA的提取：
移取100µL 10%（w/v）无菌Chelex-100溶液至1.5mLEppendorf管中，用灭菌后的牙签挑取纯培养后的菌落，挑取米粒大小至管壁上碾碎分散并使Chelex-100溶液溶解混匀。沸水浴10min后冷却至室温后低速离心10min，上清液即为PCR模板，可于-20℃保持备用；
S2.DNA扩增反应体系制备：取0.5mLPCR管依次加入以下溶液形成50µL反应体系：
引物27F 1µL，
引物1492R 1µL，
2×Taq PCR Mastermix 25µL，
ddH2O 22µL，
DNA模板 1µL；
S3.PCR反应参数设定：
94℃变性、5.5min；
93℃变性、1.5min；
56℃复性、4min；
73℃延伸、2min；
73℃延伸、11min；共29个循环；
S4.电泳检测：
制备浓度为1%琼脂糖TBE凝胶，其中加入1µL Goldview II型核酸染料，取2µLPCR产物上样，电压100V，电泳时间30min后，在260nm处凝胶成像分析系统观察。如果在1000bp处有清晰条带的，说明该样品PCR成功。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过本领域任一现有技术实现。

Claims (2)

1.一种海洋可培养细菌快速PCR的试剂盒，其特征在于，包括：海洋细菌DNA提取试剂、PCR反应试剂、电泳试剂，其中，
（1）海洋细菌DNA提取样品制备及提取试剂浓度：海洋可培养细菌经海水培养基纯培养后的菌落、10%（w/v）无菌Chelex-100溶液；
（2）PCR反应试剂中各原料及其浓度：16S rDNA通用引物27F和1492R、10×PCRBuffe、5U/ Taq酶、10Mm dNTP和ddH2O；
（3）电泳试剂：琼脂糖、50×TBE、Goldview II型核酸染料、DNA Marker。
2.一种根据权利要求1所述的海洋可培养细菌PCR快速检测的试剂盒快速PCR的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.海洋可培养细菌DNA的提取：
移取100µL 10%（w/v）无菌Chelex-100溶液至1.5mLEppendorf管中，用灭菌后的牙签挑取纯培养后的菌落，挑取米粒大小至管壁上碾碎分散并使Chelex-100溶液溶解混匀；沸水浴10min后冷却至室温后低速离心10min，上清液即为PCR模板，可于-20℃保持备用；
S2.DNA扩增反应体系制备：取0.5mLPCR管依次加入以下溶液形成50µL反应体系：
引物27F 1µL，
引物1492R 1µL，
2×Taq PCR Mastermix 25µL，
ddH2O 22µL，
DNA模板 1µL；
S3.PCR反应参数设定：
93-96℃变性、4-6min；
92-95℃变性、0.5-2min；
52-58℃复性、3-7min；
70-75℃延伸、1-3min；
70-75℃延伸、8-13min；共27-32个循环；
S4.电泳检测：
制备浓度为1%琼脂糖TBE凝胶，其中加入1µL Goldview II型核酸染料，取2µLPCR产物上样，电压100V，电泳时间30min后，在260nm处凝胶成像分析系统观察；如果在1000bp处有清晰条带的，说明该样品PCR成功。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109852712A (zh) * 2019-01-27 2019-06-07 上海海洋大学 一种简单有效的细菌真菌菌落pcr通用程序
CN114592036A (zh) * 2022-04-02 2022-06-07 予果生物科技（北京）有限公司 放线菌核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103509785A (zh) * 2012-09-18 2014-01-15 上海金域医学检验所有限公司 军团菌dna提取试剂盒及提取军团菌dna的方法
US20170335374A1 (en) * 2012-03-06 2017-11-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for identification of source of microbial contamination in a sample

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170335374A1 (en) * 2012-03-06 2017-11-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for identification of source of microbial contamination in a sample
CN103509785A (zh) * 2012-09-18 2014-01-15 上海金域医学检验所有限公司 军团菌dna提取试剂盒及提取军团菌dna的方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HO IL PARK等: "Nitrate-reducing bacterial community in a biofilm-electrode reactor", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 *
P. SEAN WALSH等: "Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material", 《BIOTECHNIQUES》 *
刘晓颖等: "优化血小板制品中细菌基因组抽提方法", 《现代临床医学》 *
周双清等: "Chelex-100快速提取放线菌DNA作为PCR扩增模板", 《生物技术通报》 *
周月琴等: "用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA", 《复旦学报(医学版)》 *
姚纲等: "Chelex-100法快速提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA", 《当代医学》 *
文静等: "Chelex-100法快速提取白粉菌基因组DNA及ITS2序列的克隆", 《安徽农业科学》 *
王永等: "Chelex-100快速提取用于转基因检测DNA模板的研究", 《生物技术通报》 *
胡丽琴等: "斜阳岛珊瑚礁区海泥可培养细菌分离鉴定及活性研究", 《广西科学院学报》 *
赵秀玲等: "Chelex-100快速提取动物源饲料DNA方法的建立", 《上海交通大学学报(农业科学版)》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109852712A (zh) * 2019-01-27 2019-06-07 上海海洋大学 一种简单有效的细菌真菌菌落pcr通用程序
CN114592036A (zh) * 2022-04-02 2022-06-07 予果生物科技（北京）有限公司 放线菌核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用
CN114592036B (zh) * 2022-04-02 2023-03-31 予果生物科技（北京）有限公司 放线菌核酸提取检测试剂、试剂盒及其方法和应用

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