CN103509785A - 军团菌dna提取试剂盒及提取军团菌dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种临床样本及环境水样本中军团菌DNA提取方法及提取试剂盒。即通过叠氮钠、Chelex-100溶液，使标本中的蛋白质变性，在蛋白酶K充分消化作用后，通过Chelex-100将非核酸有机物螯合，再离心除去Chelex颗粒，使其它杂质与DNA分离，从而将上清DNA溶解在三羟甲基氨甲烷盐酸盐和乙二胺四乙酸溶液中，DNA得以纯化回收。本发明的方法可以在较短时间内同时提取多个样品，正常工作时间小于60min，获得适合后续分子生物学分析的DNA样品。本发明方法建立的试剂盒获得的DNA样品纯度高，且在单管操作，可有效避免因转换而引起的污染，成本低廉，使用范围广泛。

Description

军团菌DNA提取试剂盒及提取军团菌DNA的方法

技术领域

本发明属于基因组DNA分离纯化技术领域，具体是一种基因组DNA试剂盒及其用于快速从临床标本及环境水样本中提取军团菌DNA的方法。 

背景技术

军团菌是一种兼性胞内寄生菌，是引起人类军团菌病的重要病原体。近年来，军团菌病在世界各地时有爆发流行，我国已将其例入14种新发传染病之一。据国外报道，院内不明原因肺炎感染有10％是由军团菌引起。目前已知军团菌虽有52个种，70多个血清型。因此，军团菌的鉴定对于军团菌病诊断具有重大价值。 

DNA的提取是分子生物学研究的基础技术，提取的DNA的纯度及结构完整性是进行细菌分子生物学研究的基础。军团菌的鉴定主要依靠分子分型检测技术，主要包括传统的聚合酶链反应（PCR）电泳及探针杂交检测方法、扩增长度多态性分析（AFLP）、限制性片段长度多态性分析（RFCP）、随机扩增多态性分析（RAPD）、限制性酶切分析、DNA测序分析等。但以上的检测方法均需要高质量DNA的提取。目前，细菌基因组DNA提取方法常见的有碱裂解法、Chelex-100法、溶菌酶法、煮沸法及SDS裂解法等，而Chelex-100法、煮沸法作为一种简单有效地快速DNA提取方法，广泛应用于细菌DNA的提取，但常规的Chelex-100法、煮沸法在处理临床标本时都具有一定的局限性。本发明对传统的Chelex-100法、煮沸法加以改良，建立了一种有效地军团菌及及其他病原菌的快速简便、经济适用并能满足临床需要的基因组DNA提取方法及提取试剂盒。 

发明内容

本发明的目的是提供一种快速从临床标本及环境水样标本中获得军团菌基因组DNA的方法，并提供成套的军团菌基因组DNA提取试剂盒。 

为了实现以上目的，本发明提供一种军团菌DNA提取试剂盒，包括DNA提取液，所述提取液由0.1～0.3%叠氮钠、5～10%Chelex-100溶液、8～12mM 三羟甲基氨甲烷盐酸、0.1～0.3mM乙二胺四乙酸二钠、100～200μg/ml蛋白酶K组成。 

同时，本发明还提供一种提取军团菌DNA的方法，包括以下步骤， 

先配置200ml的DNA提取液：称取三羟甲基氨甲烷盐酸0.24g，加无菌水至100ml，混合溶解；再加浓盐酸10μl，调ph值至8.3；加乙二胺四乙酸二钠7.5mg混合溶解；再加叠氮钠0.2g，加无菌水至200ml；最后再加入10g的Chelex-100溶液和40mg的蛋白酶K，充分混合后，于-20℃保存； 

再提取军团菌DNA：向浓缩处理的待提取样品中加入50～100μl的DNA提取液，充分混匀，置于55℃水浴30min，100℃水浴10min，置于13000rpm离心3min，取上清即为提取的军团菌基因组DNA。 

本发明使用叠氮钠、Chelex-100溶液，最大程度的使临床标本及环境水样标本中的蛋白质变性，在蛋白酶K充分消化作用后，利用Chelex-100除去非核酸有机物，再离心除去Chelex颗粒，使其它杂质与DNA分离。从而将上清DNA溶解在三羟甲基氨甲烷盐酸盐和乙二胺四乙酸溶液中，使DNA得以纯化回收。 

根据本发明的方法建立的试剂盒可以在60min时间内同时提取多个样品，获得的DNA可直接用于后续分子生物学分析，不仅可用于军团菌基因组DNA的提取，也可用于其他病原细菌基因组DNA的提取，具有广阔的应用前景。 

本发明根据上述方法配置的DNA提取液，通过一系列优化建立的军团菌基因组DNA提取试剂盒，其主要优点如下： 

（1）无需专门抽提蛋白质、沉淀DNA、洗涤DNA和溶解DNA，所用试剂少，提取成本低廉。 

（2）单管操作，提取过程中不需要更换基因组DNA的器皿，可有效避免交叉污染。 

（3）试剂盒配置简单，操作方法简单快速。 

（4）使用范围广泛，除军团菌外，对其他细菌基因组DNA的提取也有很好的效果。 

具体实施方式

本发明从临床标本及环境水样本中提取军团菌基因组DNA为具体实施例，进一步阐述本发明。 

1、军团菌DNA提取试剂盒的制备 

成分	浓度	最佳值
			Chelex100 溶液	5～10%	5%
三羟甲基氨甲烷盐酸盐（Tris-HCL）	8～12mM	10mM
			乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）	0.1～0.3mM	0.1mM
叠氮钠（NaN3）	0.1～0.3%	0.1%
			蛋白酶K（Protease-k）	100～200μg/ml	200μg/ml
水H2O	----

表1  军团菌DNA提取液的主要成分：（表中的mM为毫摩尔每升） 

2、200ml军团菌DNA提取液试剂盒的配置： 

先称取三羟甲基氨甲烷0.24g，加无菌水至100ml，混合溶解；再加浓盐酸 10μl，调ph值至8.3；加乙二胺四乙酸二钠7.5mg混合溶解；再加叠氮钠0.2g，加无菌水至200ml；最后再加入10g的Chelex-100溶液和40mg的蛋白酶K，充分混合后，于-20℃保存。按5ml分装制备成试剂盒（50人份）。 

军团菌DNA提取试剂盒的应用实施例1——环境水样本 

将200ml采集的环境水样本样品，经微孔抽滤器抽滤浓缩或离心浓缩后将沉淀物直接置于离心管中，13000rpm离心5min；再向沉淀物种中加入该DNA提取液60μl，充分混匀后，55℃水浴30min，100℃水浴10min，13000rpm离心3min，取上清液即为提取的军团菌基因组DNA。 

军团菌DNA提取试剂盒的应用实施例2——临床痰液标本 

首先取采集临床痰液标本1ml进行消化处理（痰消化液），然后将样品直 

接置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清液，沉淀用无菌水洗2次，再13000 rpm离心3min，于沉淀物种中加入该DNA提取液60μl，充分混匀，55℃水浴30min，100℃水浴10min，13000rpm离心3min，取上清液即为提取的军团菌基因组DNA。 

Claims (2)

1.一种军团菌DNA提取试剂盒，包括DNA提取液，其特征在于：所述提取液由0.1～0.3%叠氮钠、5～10%Chelex-100溶液、8～12mM 三羟甲基氨甲烷盐酸、0.1～0.3mM乙二胺四乙酸二钠、100～200μg/ml蛋白酶K组成。

2.一种提取军团菌DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

先配置200ml的DNA提取液：称取三羟甲基氨甲烷盐酸0.24g，加无菌水至100ml，混合溶解；再加浓盐酸10μl，调ph值至8.3；加乙二胺四乙酸二钠7.5mg混合溶解；再加叠氮钠0.2g，加无菌水至200ml；最后再加入10g的Chelex-100溶液和40mg的蛋白酶K，充分混合后，于-20℃保存。

再提取军团菌DNA：向浓缩处理的待提取样品中加入50～100μl的DNA提取液，充分混匀，置于55℃水浴30min，100℃水浴10min，置于13000rpm离心3min，取上清即为提取的军团菌基因组DNA。