JP4665124B2 - 環境サンプルからのｄｎａの回収方法 - Google Patents

環境サンプルからのｄｎａの回収方法 Download PDF

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Description

本発明は、環境サンプルからＤＮＡを回収する方法に関する。
土壌等の環境中には様々な微生物が生息しており、膨大なる多様性を秘めている。しかし現在その９９％以上が培養できない、もしくは極めて難培養な微生物であるとされており、培養法に頼った土壌微生物の群集構造解析には限界があり、また培養法に頼る限りにおいて、培養できない土壌微生物の遺伝子解析ができないことは明らかである（Ｒｏｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９９）。土壌に含まれるＤＮＡを直接抽出し解析することができれば、培養できないものも含め土壌にどのような微生物がいるのか知ることができ、また新規の遺伝子の情報を塩基配列という形で入手することも可能になる。
群集構造解析においては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子や１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のように細菌や真菌といった幅広い生物群が共通して保有する遺伝子について、ユニバーサルプライマーもしくは標的とする生物群（属、種レベル）のみに適合するようなプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ＤＧＧＥ、ＴＧＧＥもしくはクローニングを経て、塩基配列を解読することにより解析が行われている。この群集構造解析において最も問題となるのが「バイアス」である。ＰＣＲバイアスの問題も無視できないが、それ以前に、土壌からの抽出の段階であらゆる微生物からバイアスがかかることなくＤＮＡが抽出されているのかという疑問がある。より正確に微生物の群集構造を解析しようとするならば、まずは土壌からの抽出の段階であらゆる微生物から偏りなくＤＮＡが抽出されていることが求められる。
また最近、環境ＤＮＡ（＝ｅＤＮＡ、ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ＤＮＡ）という言葉が用いられることがある。環境（土壌や汚泥、湖水、海水など）から培養を経ずに直接抽出されたＤＮＡ（特に土壌から直接抽出されたＤＮＡを土壌ＤＮＡ（＝ｓＤＮＡ、ｓｏｉｌ ＤＮＡ）と呼ぶ）を、新規微生物の情報をも大量に保持している遺伝子のプールとして考え、これをもとにライブラリーを作成し、クローニングを行い、遺伝子発現系に導入することにより、土壌微生物の遺伝子由来の有用物質（抗生物質、酵素など）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの宿主に生産させることが試みられている（Ｓｅｏｗ １９９７、Ｈａｎｄｅｌｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９８）。培養困難な新規微生物は現在知られている種の少なくとも１００倍以上は存在すると考えられているため、これらの遺伝子の情報を含んでいる環境ＤＮＡや土壌ＤＮＡの潜在的利用価値は非常に高いと考えられる（植田２０００、長谷部２００３）。これらを利用した研究はコンビナトリアル生物学（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）もしくはコンビナトリアル遺伝学（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）と呼ばれ、今後の発展が期待されている分野である。このような研究のためにも、様々な土壌から、そしてより多くの微生物からＤＮＡを抽出する技術は重要であろう。
土壌ＤＮＡ抽出法の開発の歩み
土壌からＤＮＡを抽出する試みはＴｏｒｓｖｉｋ ＆ Ｇｏｋｓｏｙｒ（１９７８、１９８０）によって初めて行われた（Ｔｏｒｓｖｉｋ ＶＬ、Ｇｏｋｓｏｙｒ Ｊ；Ｓｏｉｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；１９７８、１０：ｐ．７−１２）。彼らの方法は、土壌から微生物をピロリン酸緩衝液などにより分離回収し、この微生物画分よりＤＮＡを抽出するものであり、こうして得られたＤＮＡを彼らは「土壌ＤＮＡ」とした。この方法は、いったん土壌から微生物画分を回収し、ここからＤＮＡを抽出するため間接抽出法（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）と呼ばれている。しかしながら、この方法では、緩衝液で土壌を洗浄しても回収できない微生物のＤＮＡを得ることはできない。すなわち放線菌の一部など土壌粒子に強固に吸着しているものや、植物遺体内に生息している微生物、また団粒の内部に生息している微生物のＤＮＡは、この方法では抽出できなかった可能性がある。その後、Ｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８７）やＴｓａｉ ＆ Ｏｌｓｏｎ（１９９１）、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）などにより直接抽出法（ｄｉｒｅｃｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）が相次いで開発された。これらの方法は、ｌｙｓｏｚｙｍｅやｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋといった酵素やＳＤＳを含むアルカリ性抽出液で土壌を処理し、タンパク質を変性させることにより、菌体を土壌から分離することなく、すなわち土壌というマトリックスの存在する溶液中で、溶菌させＤＮＡを抽出するものである。この方法は、原理的には間接抽出法よりもより実際の土壌の微生物群集構造を反映した組成から成るＤＮＡが得られると考えられ、また収量の面で優れている。しかしこの方法では、緩衝液のアルカリ性条件下で土壌を長時間加熱処理するため、相当量の腐植物質の混入が問題となる。
間接抽出法は土壌の群集構造を正確に反映していない可能性があるが、いったん土壌から微生物を分離した後にＤＮＡを抽出するので、直接抽出法よりも腐植物質の混入が少ないのみならず、土壌粒子がＤＮＡと衝突することによって生じる物理的なせん断によるＤＮＡの断片化を抑えることが可能であり、より高分子のＤＮＡを得ることができる。また近年、クローニング効率が高い高分子ＤＮＡを導入することができるベクターが開発されたことから、間接抽出法は、群集構造解析よりも遺伝子探索の研究においてよく使用されるようになってきた（Ｂａｋｋｅｎ ＆ Ｌｉｎｄａｈｌ １９９５、Ｓａａｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９５、Ｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．２００３、Ｇａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．２００３）。
一方、より短時間に、より多くの土壌微生物からＤＮＡを抽出することを目的に、ｂｅａｄｓ ｂｅａｔｅｒを用いて細胞を機械的に破壊する方法が新たに登場した（Ｋｕｓｋｅ ＣＲ，Ｂａｎｔｏｎ ＫＬ，Ａｄｏｒａｄａ ＤＬ，ｅｔ ａｌ．；Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８、６４：（７）ｐ．２４６３−２４７２）。ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇの条件検討はＢ▲ｕ▼ｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）により極めて詳細に検討されている（Ｂ▲ｕ▼ｒｇｍａｎｎ Ｈ．，Ｐｅｓａｒｏ Ｍ．，Ｗｉｄｍｅｒ Ｆ．ａｎｄ Ｚｅｙｅｒ Ｊ．；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ；２００１、４５：（１）ｐ．７−２０）。この方法では、細胞外多糖膜をもつためＳＤＳなどの界面活性剤の影響を受けにくいグラム陽性菌であっても機械的に破砕されるため、極めて高収率でＤＮＡが抽出できるという利点がある。またｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇは抽出が短時間で終わるため、腐植物質の混入が少ない土壌ＤＮＡ試料を得ることができる。しかしｂｅａｄｓ（ガラスビーズ、シリカジルコニアビーズ、アルミナビーズなど）による機械的な衝撃破砕は菌体から抽出されてきた高分子であるＤＮＡにも作用し、ＤＮＡが物理的にせん断されてしまうこともある。このように様々な微生物群から偏りなくＤＮＡが取れる一方、ＤＮＡが低分子化することから比較的短い配列をターゲットとするＤＧＧＥなどの群集構造解析には、この方法が多く用いられている。
また近年Ｂｉｏ１０１ Ｆａｓｔ ＤＮＡ ｓｐｉｎ ｋｉｔ（Ｑｂｉｏ，ＵＳＡ）やＵｌｔｒａ Ｃｌｅａｎ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ ｋｉｔ（ＭｏＢｉｏ，ＵＳＡ）など、試薬メーカーから独自の方法により短時間で土壌からのＤＮＡを調製するキットも製品化されている。いずれもがｂｅａｄｓ ｂｅａｔｅｒを使用し、短時間で土壌ＤＮＡ抽出が可能になっているものである。
上記のように、これまで土壌ＤＮＡの様々な抽出法が考案されたが、用いる界面活性剤や緩衝液の組成や濃度などは研究によってまちまちであり、これらの条件とＤＮＡ抽出効率、あるいは抽出されたＤＮＡの質（純度や断片化の程度など）との関係について体系的に検討した例はほとんどない。
土壌ＤＮＡの精製法に関する従来の知見
ＤＮＡ試料に混入した腐植物質は極めて微量でもＰＣＲ反応を阻害する（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．１９９１）。このためＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）らは抽出した土壌ＤＮＡをアガロースゲルでいったん電気泳動することで腐植物質とＤＮＡを分離し、その後ゲルからＤＮＡのみを回収するという方法をとっている（Ｚｈｏｕ ＪＺ，Ｂｒｕｎｓ ＭＡ，Ｔｉｅｄｊｅ ＪＭ；Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；１９９６；６２：（２）ｐ．３１６−３２２）。また、低融点アガロースゲルを利用した方法としてａｇａｒｏｓｅ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎがあげられる（Ｍｏｒｅｉｒａ １９９８）。これは、ＤＮＡが腐植物質より高分子であることを利用し、いったん腐植物質を含んだ土壌ＤＮＡ溶液を低融点アガロースゲル中に閉じ込めるように固化し、そのゲル片をＴＥ ｂｕｆｆｅｒで透析し、低分子である腐植物質を徐々に取り除くものである。透析処理において高分子ＤＮＡはアガロースゲル中に留まり、低分子である腐植物質は拡散によりアガロースゲルから抜けてゆき、腐植物質をゲル片から取り除いた後にアガロースを溶解させＤＮＡを回収するものである。このようにＤＮＡと腐植物質を分離できる物性の違いとしてとしてその分子量の差が上げられ、多くの精製法がこの原理に基づいている。分子量に基づいた代表的分離法として、ゲルろ過法があげられる。ＳｅｐｈａｄｅｘやＳｅｐｈａｒｏｓｅといった多孔質の樹脂を利用し、サイズ分画により、比較的大きなＤＮＡ分子を小さな腐植物質から分離して回収しようとするものである（ｅ．ｇ．Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｍｉｌｌｅｒ ２００１）。その他には、カオトロピック塩溶液中ではカオトロピック効果によりＤＮＡがガラス表面に吸着しやすくなることを利用して、ガラスパウダー、シリカゲルパウダー、シリカメンブレンなどにＤＮＡをまず吸着させ、その後エタノールなどで吸着していな夾雑物を洗浄して取り除き、極性の高い水を用いてＤＮＡを再抽出する精製方法がある。Ｂｉｏ１０１ Ｆａｓｔ ＤＮＡ ｓｐｉｎ ｋｉｔ（Ｑｂｉｏ，ＵＳＡ）やＵｌｔｒａ Ｃｌｅａｎ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ ｋｉｔ（ＭｏＢｉｏ，ＵＳＡ）などは抽出した土壌ＤＮＡの精製にこの原理を用いていると考えられる。また、磁性ビーズを利用した精製法も実用化されている（製品名Ｗｉｚａｒｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ，ＵＳＡ）。一方、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）やセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）なども腐植物質の除去剤として使用されてきたが、これらの使用によって土壌ＤＮＡ試料への腐植物質の混入を軽減する効果は見られるものの、完全な除去までには至っておらず、ＰＶＰＰについてはＤＮＡの収量が下がるなどの問題が生じる場合もあった（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．１９９６）。
本発明は、高収量でかつ高純度のＤＮＡを土壌から抽出するための方法を提供することを目的とする。
本発明者は、高収量かつ高純度に土壌ＤＮＡを抽出する手法を開発するため、まず化学的な条件として、土壌微生物細胞の溶解に適し、土壌由来の腐植物質や粘土など様々な物質が共存する条件下でも十分に微生物を溶菌させることが可能な界面活性剤を検索した。次に細胞破壊の物理的な条件として、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇによる破砕や加熱の条件の検討を行った。また、抽出液に使用するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＥＤＴＡ溶液、リン酸緩衝液の特性や、得られた土壌ＤＮＡの精製および沈殿方法として陽イオン界面活性剤であるＣＴＡＢによる精製およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によるＤＮＡの沈殿操作を最適な条件で組み合わせることなど、性質の異なる様々な土壌からより簡便な操作でより高収量かつ高純度なＤＮＡを得る抽出−精製手法を確立するため、鋭意検討を行なった。
その結果、高収量かつ高純度な土壌ＤＮＡを抽出する手法を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）５％以下の界面活性剤を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルを処理することを特徴とする、環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法。
（２）界面活性剤がＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群から選ばれるいずれかのものである（１）記載の方法。
（３）ＤＮＡ抽出液が、さらにリン酸緩衝液及び／又はＥＤＴＡを含むものである（１）記載の方法。
（４）ＤＮＡ抽出液のｐＨが７以上である（１）記載の方法。
（５）リン酸緩衝液の濃度が１００ｍＭ〜１５００ｍＭである（３）記載の方法。
（６）ＥＤＴＡの濃度が５０ｍＭ〜６００ｍＭである（３）記載の方法。
（７）リン酸緩衝液の濃度が１００ｍＭ〜７５０ｍＭであり、かつ、ＥＤＴＡの濃度が５０ｍＭ〜６００ｍＭである（３）記載の方法。
（８）環境サンプルが、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥及び糞便からなる群から選ばれる少なくとも１つである（１）記載の方法。
（９）環境サンプルの処理が、環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理するものである（１）記載の方法。
（１０） 環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理後の抽出液を遠心し、
（ｃ）遠心後上清を採取し、
（ｄ）上清の採取後の残存環境サンプルについて、上記（ａ）〜（ｃ）工程を１回〜４回繰り返す
工程を含む前記方法。
（１１） ＤＮＡ抽出液が、さらにリン酸緩衝液及び／又はＥＤＴＡを含むものである（１０）記載の方法。
（１２） ＥＤＴＡの濃度が５０〜６００ｍＭである（１１）記載の方法。
（１３） リン酸緩衝液の濃度が１００〜２０００ｍＭである（１１）記載の方法。
（１４） 環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤及び５０〜６００ｍＭのＥＤＴＡを含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理後の抽出液を遠心して上清を採取し、
（ｃ）採取された上清と６００〜１１００ｍＭのＥＤＴＡとを混合する
工程を含む前記方法。
（１５） 環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤及び５０〜６００ｍＭのＥＤＴＡを含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理後の抽出液を遠心し、
（ｃ）得られる上清と６００〜１１００ｍＭのＥＤＴＡとの混合物を加熱処理する
工程を含む前記方法。
（１６） 環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法であって、
５％以下の界面活性剤及び２５０〜２０００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理する
工程を含む前記方法。
（１７） 環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法であって、
５％以下の界面活性剤、１００〜８００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜２０００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理する
工程を含む前記方法。
（１８） ＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭであり、かつ、リン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭである（１７）記載の方法。
（１９） 環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤を含むＤＮＡ抽出液Ｉの存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理後の抽出液Ｉを、７５〜１２００ｍＭのＥＤＴＡ、２５０〜３０００ｍＭのリン酸緩衝液、又は前記ＥＤＴＡとリン酸緩衝液との混合物と混合して抽出液ＩＩを調製し、
（ｃ）前記抽出液ＩＩからＤＮＡを抽出する
工程を含む前記方法。
（２０） 抽出液Ｉと混合するＥＤＴＡの濃度が４００〜８００ｍＭである（１９）記載の方法。
（２１） 抽出液Ｉと混合するリン酸緩衝液の濃度が７５０〜１５００ｍＭである（１９）記載の方法。
（２２） 抽出液Ｉと混合するＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭであり、かつ、抽出液Ｉと混合するリン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭである（１９）記載の方法。
（２３） 環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤、４００ｍＭ以下のＥＤＴＡ及び２５０ｍＭ以下のリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液ＩＩＩの存在下で土壌サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液ＩＩＩを、４００〜１０００ｍＭのＥＤＴＡ、７５０〜２０５０ｍＭのリン酸緩衝液、又は前記ＥＤＴＡとリン酸緩衝液との混合物と混合して抽出液ＩＶを調製し、
（ｃ）前記抽出液ＩＶからＤＮＡを抽出する
工程を含む前記方法。
（２４） ＤＮＡを抽出する工程が、抽出液ＩＶを加熱処理した後、遠心するものである（２３）記載の方法。
（２５） 抽出液ＩＩＩにおいて、ＥＤＴＡの濃度が３００ｍＭであり、かつ、リン酸緩衝液の濃度が１００ｍＭである（２３）記載の方法。
（２６） 抽出液ＩＩＩと混合するＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭであり、かつ、抽出液ＩＩＩと混合するリン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭである（２３）記載の方法。
（２７） 環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法であって、
（ａ）１００〜４００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜１５００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液Ｖの存在下で環境サンプルを加熱処理し、
（ｂ）加熱処理後の抽出液Ｖを遠心して上清を採取し、
（ｃ）残存した環境サンプルを、５％以下の界面活性剤、４００ｍＭ以下のＥＤＴＡ及び２５０ｍＭ以下のリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液ＩＩＩの存在下でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｄ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液ＩＩＩを遠心して上清を採取する
工程を含む前記方法。
（２８） 環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法であって、
（ａ）１００〜４００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜１５００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液Ｖの存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液Ｖを遠心して上清を採取し、
（ｃ）残存した環境サンプルを、５％以下の界面活性剤、４００ｍＭ以下のＥＤＴＡ及び２５０ｍＭ以下のリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液ＩＩＩの存在下でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｄ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液ＩＩＩを遠心して上清を採取する
工程を含む前記方法。
（２９） 環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法であって、
（ａ）２００〜８００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜２０００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルを第一加熱処理し、
（ｂ）第一加熱処理後の環境サンプルと、５％以下の界面活性剤とを混合して当該混合物を第二加熱処理する
工程を含む前記方法。
（３０） 環境サンプルからＤＮＡを抽出する方法であって、
（ａ）１００〜４００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜１５００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の環境サンプルと５％以下の界面活性剤とを混合して当該混合物を加熱処理する
工程を含む前記方法。
（３１） 抽出液Ｖにおいて、ＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭであり、かつ、リン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭである（２７）又は（２８）記載の方法。
（３２） ＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭであり、かつ、リン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭである（２９）又は（３０）記載の方法。
（３３） 環境サンプル由来のＤＮＡを、陽イオン界面括性剤及び塩の存在下で精製することを特徴とするＤＮＡの精製方法。
（３４） 環境サンプル由来のＤＮＡが、（１）〜（３２）のいずれか１項に記載の方法により抽出されたＤＮＡである（３３）記載の方法。
（３５） 陽イオン界面活性剤がＣＴＡＢである（３３）又は（３４）記載の方法。
（３６） 塩が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも１つである（３３）又は（３４）記載の方法。
（３７） 陽イオン界面活性剤の濃度が１〜３％である（３３）又は（３４）記載の方法。
（３８） 塩の濃度が０．７〜２．１Ｍである（３３）又は（３４）記載の方法。
（３９） 陽イオン界面活性剤の濃度が２〜３％であり、かつ、塩の濃度が１．０Ｍである（３３）又は（３４）記載の方法。
（４０） ｐＨ７．０未満の条件で精製することを特徴とする（３３）又は（３４）記載の方法。
（４１） 上記（３３）〜（４０）のいずれか１項に記載の方法により精製されたＤＮＡを、２−プロパノール、エタノール又はポリエチレングリコールの存在下で沈殿させることを特徴とするＤＮＡの回収方法。
（４２） ｐＨ７．０以上の条件で沈殿させることを特徴とする（４１）記載の方法。
（４３） ポリエチレングリコールの濃度が５〜７．５％である（４１）記載の方法。
（４４） 上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法により抽出されたＤＮＡを、２−プロパノール、エタノール又はポリエチレングリコールの存在下で沈殿させることを特徴とするＤＮＡの回収方法。
（４５） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理後の抽出液を遠心し、
（ｃ）得られる上清からＤＮＡを回収する
工程を含む前記方法。
（４６） ＤＮＡ抽出液が、さらにリン酸緩衝液及び／又はＥＤＴＡを含むものである（４５）記載の方法。
（４７） ＥＤＴＡの濃度が５０〜６００ｍＭである（４６）記載の方法。
（４８） リン酸緩衝液の濃度が１００〜２０００ｍＭである（４６）記載の方法。
（４９） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理又は加熱処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理又は加熱処理後の抽出液を遠心し、
（ｃ）得られる上清からＤＮＡを回収し、
（ｄ）ＤＮＡ回収後の残存環境サンプルについて、上記（ａ）〜（ｃ）工程を１回〜４回繰り返す
工程を含む前記方法。
（５０） ＤＮＡ抽出液が、さらにリン酸緩衝液及びＥＤＴＡを含むものである（４９）記載の方法。
（５１） ＥＤＴＡの濃度が５０ｍＭ〜６００ｍＭである（５０）記載の方法。
（５２） リン酸緩衝液の濃度が１００〜２０００ｍＭである（５０）記載の方法。
（５３） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤及び５０〜６００ｍＭのＥＤＴＡを含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理後の抽出液を遠心して上清を採取し、
（ｃ）採取された上清と６００〜１１００ｍＭのＥＤＴＡとを混合して当該混合物を遠心し、
（ｄ）得られる上清からＤＮＡを回収する
工程を含む前記方法。
（５４） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤及び５０〜６００ｍＭのＥＤＴＡを含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理後の抽出液を遠心し、
（ｃ）得られる上清と６００〜１１００ｍＭのＥＤＴＡとを混合して当該混合物を加熱処理し、
（ｄ）加熱後の抽出液を遠心し、
（ｅ）得られる上清からＤＮＡを回収する
工程を含む前記方法。
（５５） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤及び２５０〜２０００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理後の抽出液を遠心し、
（ｃ）得られる上清からＤＮＡを回収する
工程を含む前記方法。
（５６） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤、１００〜８００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜２０００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理後の抽出液を遠心し、
（ｃ）得られる上清からＤＮＡを回収する
工程を含む前記方法。
（５７） ＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭであり、かつ、リン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭである（５６）記載の方法。
（５８） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤を含むＤＮＡ抽出液Ｉの存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理及び／又は加熱処理後の抽出液Ｉを、７５〜１２００ｍＭのＥＤＴＡ、２５０〜３０００ｍＭのリン酸緩衝液、又は前記ＥＤＴＡとリン酸緩衝液との混合物と混合して抽出液ＩＩを調製し、
（ｃ）抽出液ＩＩを遠心し、
（ｄ）得られる上清からＤＮＡを回収する
工程を含む前記方法。
（５９） 抽出液Ｉと混合するＥＤＴＡの濃度が４００〜８００ｍＭである（５８）記載の方法。
（６０） 抽出液Ｉと混合するリン酸緩衝液の濃度が７５０〜１５００ｍＭである（５８）記載の方法。
（６１） 抽出液Ｉと混合するＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭであり、かつ、抽出液Ｉと混合するリン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭである（５８）記載の方法。
（６２） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）５％以下の界面活性剤、４００ｍＭ以下のＥＤＴＡ及び２５０ｍＭ以下のリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液ＩＩＩの存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液ＩＩＩを、４００〜１０００ｍＭのＥＤＴＡ、７５０〜２０５０ｍＭのリン酸緩衝液、又は前記ＥＤＴＡとリン酸緩衝液との混合物と混合して抽出液ＩＶを調製し、
（ｃ）抽出液ＩＶを遠心し、
（ｄ）得られる上清からＤＮＡを回収する
工程を含む前記方法。
（６３） 抽出液ＩＶを加熱処理した後、遠心することを特徴とする（６２）記載の方法。
（６４） 抽出液ＩＩＩにおいて、ＥＤＴＡの濃度が３００ｍＭであり、かつ、リン酸緩衝液の濃度が１００ｍＭである（６２）又は（６３）記載の方法。
（６５） 抽出液ＩＩＩと混合するＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭであり、かつ、抽出液ＩＩＩと混合するリン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭである（６２）又は（６３）記載の方法。
（６６） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）１００〜４００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜１５００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液Ｖの存在下で環境サンプルを加熱処理し、
（ｂ）加熱処理後の抽出液Ｖを遠心して上清を採取し、
（ｃ）残存した環境サンプルを、５％以下の界面活性剤、４００ｍＭ以下のＥＤＴＡ及び２５０ｍＭ以下のリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液ＩＩＩの存在下でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｄ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液ＩＩＩを遠心して上清を採取し、
（ｅ）工程（ｂ）及び／又は（ｄ）において得られた上清からＤＮＡを回収する
工程を含む前記方法。
（６７） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）１００〜４００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜１５００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液Ｖの存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液Ｖを遠心して上清を採取し、
（ｃ）残存した環境サンプルを、５％以下のＳＤＳ、４００ｍＭ以下のＥＤＴＡ及び２５０ｍＭ以下のリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液ＩＩＩの存在下でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｄ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液ＩＩＩを遠心して上清を採取し、
（ｅ）工程（ｂ）及び／又は（ｄ）において得られた上清からＤＮＡを回収する
工程を含む前記方法。
（６８） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）２００〜８００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜２０００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルを第一加熱処理し、
（ｂ）５％以下の界面活性剤と環境サンプルとを混合して当該混合物を第二加熱処理し、
（ｃ）第二加熱処理後の抽出液を遠心し、
（ｄ）得られる上清からＤＮＡを回収する
工程を含む前記方法。
（６９） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）１００〜４００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜１５００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の環境サンプルと５％以下の界面活性剤とを混合して当該混合物を加熱処理し、
（ｃ）加熱処理後の抽出液を遠心し、
（ｄ）得られる上清からＤＮＡを回収する
工程を含む前記方法。
（７０） 抽出液Ｖにおいて、ＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭであり、かつ、リン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭである（６６）又は（６７）記載の方法。
（７１） ＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭであり、かつ、リン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭである（６８）又は（６９）記載の方法。
（７２） ＤＮＡの回収が、遠心後の上清と陽イオン界面活性剤及び塩とを混合してＤＮＡを精製する工程を含む（４５）〜（５７）のいずれか１項に記載の方法。
（７３） ＤＮＡの回収が、抽出液ＩＩと陽イオン界面活性剤及び塩とを混合してＤＮＡを精製する工程を含む（５８）〜（６１）のいずれか１項に記載の方法。
（７４） ＤＮＡの回収が、抽出液ＩＶと陽イオン界面活性剤及び塩とを混合してＤＮＡを精製する工程を含む（６２）〜（６５）のいずれか１項に記載の方法。
（７５） ＤＮＡの回収が、加熱処理後の抽出液Ｖ及び／又はｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ後の抽出液ＩＩＩと陽イオン界面活性剤及び塩とを混合してＤＮＡを精製する工程を含む（６６）記載の方法。
（７６） ＤＮＡの回収が、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ後の抽出液ＩＩＩ及び／又はｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ後の抽出液Ｖと陽イオン界面活性剤及び塩とを混合してＤＮＡを精製する工程を含む（６７）記載の方法。
（７７） ＤＮＡの回収が、第二加熱後の抽出液と陽イオン界面活性剤及び塩とを混合してＤＮＡを精製する工程を含む（６８）記載の方法。
（７８） ＤＮＡの回収が、加熱処理後の抽出液と陽イオン界面活性剤及び塩とを混合してＤＮＡを精製する工程を含む（６９）記載の方法。
（７９） 陽イオン界面活性剤がＣＴＡＢである（７２）〜（７８）のいずれか１項に記載の方法。
（８０） 塩が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも１つである（７２）〜（７８）のいずれか１項に記載の方法。
（８１） 混合液中における陽イオン界面活性剤の濃度が１〜３％である（７２）〜（７８）のいずれか１項に記載の方法。
（８２） 混合液中における塩の濃度が０．７〜２．１Ｍである（７２）〜（７８）のいずれか１項に記載の方法。
（８３） 混合液中における陽イオン界面活性剤の濃度が２〜３％であり、かつ、混合液中における塩の濃度が１．０Ｍである（７２）〜（７８）のいずれか１項に記載の方法。
（８４） ｐＨ７．０未満の条件で精製することを特徴とする（７２）〜（７８）のいずれか１項に記載の方法。
（８５） ＤＮＡの回収が、２−プロパノール、エタノール又はポリエチレングリコールの存在下でＤＮＡを沈殿させる工程を含む（４５）〜（８４）のいずれか１項に記載の方法。
（８６） ポリエチレングリコールの濃度が５．０〜７．５％である（８５）記載の方法。
（８７） ｐＨ７．０以上の条件でＤＮＡを沈殿させることを特徴とする（８５）記載の方法。
（８８） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）１％の界面活性剤、４００ｍＭのＥＤＴＡ及び７５０ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルを処理してＤＮＡを抽出し、
（ｂ）ＤＮＡ抽出液と２％のＣＴＡＢ及び１Ｍの塩とを混合してＤＮＡを精製し、
（ｄ）精製されたＤＮＡを、ポリエチレングリコールの存在下で沈殿させる
工程を含む前記方法。
（８９） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）１％の界面活性剤、３００ｍＭのＥＤＴＡ及び１００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液と、６００ｍＭのＥＤＴＡ及び２０５０ｍＭのリン酸緩衝液とを混合し、
（ｃ）工程（ｂ）により得られる抽出液を遠心し、
（ｄ）得られる上清と、２％のＣＴＡＢ及び１Ｍの塩とを混合してＤＮＡを精製し、
（ｅ）精製されたＤＮＡを、ポリエチレングリコールの存在下で沈殿させる
工程を含む前記方法。
（９０） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）１％の界面活性剤、３００ｍＭのＥＤＴＡ及び１００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液と、６００ｍＭのＥＤＴＡ及び２０５０ｍＭのリン酸緩衝液とを混合して加熱処理し、
（ｃ）加熱処理後の抽出液を遠心し、
（ｄ）得られる上清と、２％のＣＴＡＢ及び１Ｍの塩とを混合してＤＮＡを精製し、
（ｅ）精製されたＤＮＡを、ポリエチレングリコールの存在下で沈殿させる
工程を含む前記方法
（９１） 環境サンプルからＤＮＡを回収する方法であって、
（ａ）１％の界面活性剤、３００ｍＭのＥＤＴＡ及び１００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で環境サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、
（ｂ）ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液を遠心し、
（ｃ）得られる上清と、２％ＣＴＡＢ及び１Ｍの塩とを混合してＤＮＡを精製し、
（ｄ）精製されたＤＮＡを、ポリエチレングリコールの存在下で沈殿させる
工程を含む前記方法。
（９２） 塩が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも１つである（８８）〜（９１）のいずれか１項に記載の方法。
（９３） ポリエチレングリコールの濃度が５．０〜７．５％である（８８）〜（９１）のいずれか１項に記載の方法。
（９４） ｐＨ７．０以上の条件でＤＮＡを沈殿させることを特徴とする（８８）〜（９１）のいずれか１項に記載の方法。
（９５） ５％以下の界面活性剤、又は前記界面活性剤とｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ用ビーズとの組合せを含む、環境サンプルからのＤＮＡ抽出用キット。
（９６） アルカリ性緩衝液並びにＥＤＴＡ及び／又はリン酸緩衝液をさらに含む（９５）記載のキット。
（９７） アルカリ性緩衝液がＴｒｉｓ緩衝液である（９６）記載のキット。
（９８） ＥＤＴＡの濃度が５０ｍＭ〜１２００ｍＭの範囲から選ばれるいずれかのものである（９６）記載のキット。
（９９） リン酸緩衝液の濃度が５０ｍＭ〜３０００ｍＭの範囲から選ばれるいずれかのものである（９６）記載のキット。
（１００） ＤＮＡ抽出液のｐＨを７．０以上に調整することができる（９６）記載のキット。
（１０１） 酸性側のｐＫａを有するｐＨ緩衝液を含む塩溶液、陽イオン界面活性剤、又は当該塩溶液と陽イオン界面活性剤との混合物を含む、環境サンプルからのＤＮＡ精製用キット。
（１０２） 酸性側のｐＫａを有するｐＨ緩衝液が酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩酸緩衝液又は硫酸緩衝液である（１０１）記載のキット。
（１０３） 陽イオン界面活性剤がＣＴＡＢである（１０１）記載のキット。
（１０４） 塩が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも１つである（１０１）記載のキット。
（１０５） ＤＮＡ含有溶液のｐＨを７．０未満に調整することができる（１０１）記載のキット。
（１０６） アルカリ性緩衝液を含む、環境サンプルからのＤＮＡ回収用キット。
（１０７） アルカリ性の緩衝液がＴｒｉｓ緩衝液である（１０６）記載のキット。
（１０８） さらに２−プロパノール、エタノール又はポリエチレングリコールを含む、（１０６）記載のキット。
（１０９） ＤＮＡ含有溶液のｐＨを７．０以上に調整することができる（１０６）記載のキット。
（１１０） 上記（９５）〜（１００）のいずれか１項に記載のＤＮＡ抽出用キット、上記（１０１）〜（１０５）のいずれか１項に記載のＤＮＡ精製用キット、及び上記（１０６）〜（１０９）のいずれか１項に記載のＤＮＡ回収用キットからなる群から選ばれる少なくとも２組のキットを含む、環境サンプルからのＤＮＡ取得用キットセット。
図１は、土壌ＤＮＡの定量例を示す図である。
図２は、各種界面活性剤による土壌ＤＮＡの抽出量を示す図である。
図３は、弥生圃場堆肥区土壌からのＤＮＡ抽出にＳＤＳ濃度が与える影響を示す図である。
図４は、ＳＤＳ濃度が土壌ＤＮＡ抽出に与える影響を示す図である。
図５は、抽出液のｐＨが土壌ＤＮＡに与える影響を示す図である。各バーの上に記載の数字はｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ後の抽出液のｐＨを表す。
図６は、ＥＤＴＡ濃度が火山灰土壌からのＤＮＡ抽出に与える影響を示す図である。
図７は、ＥＤＴＡ濃度がＤＮＡ抽出量に与える影響を示す図である。
図８Ａは、抽出液のＥＤＴＡ濃度と金属元素の抽出量との関係を示す図である。
図８Ｂは、抽出液のＥＤＴＡ濃度と金属元素の抽出量との関係を示す図である。
図８Ｃは、抽出液のＥＤＴＡ濃度と金属元素の抽出量との関係を示す図である。
図９Ａは、抽出液のＥＤＴＡ濃度とＥＤＴＡ−金属元素複合体形成率との関係を示す図である。
図９Ｂは、抽出液のＥＤＴＡ濃度とＥＤＴＡ−金属元素複合体形成率との関係を示す図である。
図９Ｃは、抽出液のＥＤＴＡ濃度とＥＤＴＡ−金属元素複合体形成率との関係を示す図である。
図１０Ａは、土壌からＤＮＡを繰返し抽出したときのＤＮＡ収量を示す図である。
図１０Ｂは、土壌からＤＮＡを繰返し抽出したときのＤＮＡ収量を示す図である。
図１０Ｃは、土壌からＤＮＡを繰返し抽出したときのＤＮＡ収量を示す図である。
図１１は、再添加したＥＤＴＡ溶液の新たな土壌ＤＮＡの抽出量の計算結果を示す図である。
図１２は、新たに添加したＥＤＴＡにより抽出できたと考えられる土壌ＤＮＡ量を示す図である。
図１３Ａは、新たに添加したＥＤＴＡにより土壌から抽出された金属量（Ａｌ及びＦｅ）を示す図である。
図１３Ｂは、新たに添加したＥＤＴＡにより土壌から抽出された金属量（Ｃａ及びＭｇ）を示す図である。
図１４は、高濃度ＥＤＴＡ溶液をｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ後に添加した弥生圃場対照区土壌からの土壌ＤＮＡ抽出結果を示す図である。
図１５Ａは、抽出液のＥＤＴＡ濃度が土壌ＤＮＡ抽出量に及ぼす影響を示す図である。
図１５Ｂは、抽出液のＰＯ４ ３−濃度が土壌ＤＮＡ抽出量に及ぼす影響を示す図である。
図１６Ａは、火山灰土壌における抽出液中のＥＤＴＡ−リン酸濃度が土壌ＤＮＡ抽出に及ぼす影響を示す図である。
図１６Ｂは、非火山灰土壌における抽出液中のＥＤＴＡ−リン酸濃度が土壌ＤＮＡ抽出に及ぼす影響を示す図である。
図１７は、２ｓｔｅｐによるＤＮＡ抽出における抽出溶液のリン酸イオン濃度と土壌ＤＮＡの収量との関係を示す図である。
図１８Ａは、高濃度のＥＤＴＡ及びリン酸緩衝液を用いて２段階の操作で抽出した土壌ＤＮＡの収量を示す図である。
図１８Ｂは、ＥＤＴＡ、リン酸緩衝液を用いて改良２ｓｔｅｐ法で弥生圃場対照区土壌から抽出した土壌ＤＮＡの収量を示す図である。図中に示したＥＤＴＡ濃度およびＰＯ４ ３−濃度はｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ時の抽出液における濃度であり、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ後にそれぞれ調製した溶液添加後の終濃度はすべて４００ｍＭＥＤＴＡ／７５０ｍＭＰＯ４ ３−である。
図１９は、改良２ｓｔｅｐによるＤＮＡ抽出結果を示す電気泳動写真である。
図２０Ａは、各沈殿剤を使用したときのＤＮＡの回収結果を示す図である。
図２０Ｂは、土壌ＤＮＡの沈殿方法の違いによる腐植の除去効果を示す図である。
図２１は、ＰＥＧ濃度が土壌ＤＮＡの回収に与える影響を示す図である。
図２２Ａは、ＣＴＡＢによる簡易精製を行った場合のＤＮＡの回収量を示す図である。
図２２Ｂは、ＣＴＡＢ処理による腐植物質の除去効果を示す図である。
図２２Ｃは、ＣＴＡＢ処理による腐植物質の除去効果を示す図である。
図２３は、オリジナルの４条件による土壌ＤＮＡの収量の比較を示す図である。
図２４は、オリジナルの４条件による抽出ＤＮＡのサイズを示す電気泳動写真である。
図２５は、土壌ＤＮＡ収量における本発明の方法と既往の方法との比較を示す図である。
図２６Ａは、オリジナル１ｓｔｅｐ法により抽出した土壌ＤＮＡのＰＣＲ反応を用いた純度検定結果を示す電気泳動写真である。上２つのパネルは鋳型濃度１００ｎｇ／５０μｌ、中２つのパネルは鋳型濃度５０ｎｇ／５０μｌ、した２つのパネルは鋳型濃度１０ｎｇ／５０μｌである。
図２６Ｂは、オリジナル２ｓｔｅｐ加熱法により抽出した土壌ＤＮＡのＰＣＲ反応を用いた純度検定結果を示す電気泳動写真である。各パネルにおける鋳型濃度は、図２６Ａと同様である。
図２７Ａは、抽出したＤＮＡの評価結果を示す電気泳動写真である。レーン１〜５は弥生圃場対照区土壌、レーン６〜１０は千葉農試森林土壌、レーン１１〜１５は茨城農試森林土壌、レーン１６〜２０は田無農場牧草地土壌から抽出したＤＮＡの泳動図である。各土壌におけるレーンは、左から順にオリジナル１Ｓｔｅｐ法、２Ｓｔｅｐ法、２Ｓｔｅｐ加熱法、ＬＣＢ法及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）により抽出した土壌ＤＮＡのＰＣＲ産物を表す。
図２７Ｂは、抽出したＤＮＡの評価結果を示す電気泳動写真である。レーン１〜８は群馬畜試牧草地、レーン９〜１６は栃木森林土壌から抽出したＤＮＡの泳動図である。各土壌におけるレーンは、左から順にオリジナル１Ｓｔｅｐ法、２Ｓｔｅｐ法、２Ｓｔｅｐ加熱法、ＬＣＢ法、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）の方法、Ｃｕｌｌｅｎ＆Ｈｉｒｓｃｈ（１９９６）の方法、Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｎ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ ｋｉｔ、Ｂｉｏ １０１ Ｆａｓｔ ＤＮＡ ｓｐｉｎ ｋｉｔによって抽出した土壌ＤＮＡのＰＣＲ産物である。
図２７Ｃは、抽出したＤＮＡの評価結果を示す電気泳動写真である。レーン１〜８は東北大学森林土壌、レーン９〜１６は草地試験場永年採草地土壌から抽出したＤＮＡの泳動図である。各土壌におけるレーンは図２７Ａと同様である。
図２７Ｄは、抽出したＤＮＡの評価結果を示す電気泳動写真である。レーン１〜８は埼玉農試畑土壌、レーン９〜１６は大阪農試畑土壌から抽出したＤＮＡの泳動図である。各土壌におけるレーンは図２７Ａと同様である。
図２７Ｅは、抽出したＤＮＡの評価結果を示す電気泳動写真である。レーン１〜８は兵庫農試畑土壌、レーン９〜１６は奈良農試畑土壌から抽出したＤＮＡの泳動図である。各土壌におけるレーンは図２７Ａと同様である。
図２８は、ＣＴＡＢによるＤＮＡ精製時に塩溶液の酸性緩衝能によりｐＨを低下させることがＤＮＡ抽出液の純度に与える影響を示す図である。
図２９は、ＣＴＡＢによるＤＮＡ精製時に塩溶液の酸性緩衝能によりｐＨを低下させることが沈殿回収後のＤＮＡ溶液の純度に与える影響を示す図である。
図３０は、ＣＴＡＢによるＤＮＡ精製時に塩溶液の酸性緩衝能によりｐＨを低下させることがＤＮＡの回収量に与える影響影響を示す図である（ＰＥＧ溶液をＤＮＡの回収に使用）。
図３１は、ＣＴＡＢによる精製時に塩溶液の酸性緩衝能によりｐＨを低下させることがＤＮＡ抽出液の純度に与える影響を示す図である（塩溶液にＣＨ３ＣＯＯＮａおよびＮａＣｌの混合液を使用した場合）。
図３２は、ＣＴＡＢによる精製時に塩溶液の酸性緩衝能によるｐＨを低下させることがＰＥＧ溶液により回収したＤＮＡの純度に与える影響を示す図である（塩溶液にＣＨ３ＣＯＯＮａおよびＮａＣｌの混合液を使用した場合）。
図３３は、ＣＴＡＢによる精製時に塩溶液の酸性緩衝能によりｐＨを低下させることがＤＮＡの回収量に与える影響を示す図である（塩溶液にＣＨ３ＣＯＯＮａおよびＮａＣｌの混合液を使用、ＤＮＡの回収にＰＥＧ溶液を使用）。
図３４は、ＰＥＧ溶液のアルカリ緩衝能の有無が回収するＤＮＡの純度に与える影響を示す図である。
図３５は、ＰＥＧ溶液のアルカリ緩衝能の有無がＤＮＡの回収量に与える影響を示す図である。
図３６は、ＤＮＡを回収するときに使用するＰＥＧ溶液のアルカリ緩衝能が回収したＤＮＡの純度に与える影響を示す図である（ＥＤＴＡ ２００ｍＭ／Ｎａ２ＨＰＯ４ ３７５ｍＭの抽出液で得られた土壌ＤＮＡ抽出液を対象として）。
図３７は、ＣＴＡＢによる精製時の塩溶液組成とＤＮＡ回収時に使用するのＰＥＧ溶液のアルカリ緩衝能がＤＮＡの回収量に与える影響を示す図である（ＥＤＴＡ ２００ｍＭ／Ｎａ２ＨＰＯ４ ３７５ｍＭの抽出液で得られた土壌ＤＮＡ抽出液を対象として）。
図３８は、加熱抽出による高分子土壌ＤＮＡの抽出条件の検討結果を示す図である（弥生対照区土壌について）。
図３９は、加熱抽出による高分子土壌ＤＮＡの抽出条件の検討結果を示す図である。
図４０は、抽出液組成と物理処理が糞便からのＤＮＡ抽出量に与える影響を示す図である。
図４１は、糞便から抽出したＤＮＡの電気泳動写真である。
図４２は、糞便からのＤＮＡ抽出法の検討結果を示す図である。
図４３は、糞便から抽出したＤＮＡの純度を示す図である。
図４４は、抽出液組成と物理処理が堆肥からのＤＮＡ抽出量に与える影響を示す図である。
図４５は、堆肥及び活性汚泥から抽出したＤＮＡの電気泳動写真である。
図４６は、堆肥からのＤＮＡ抽出法の検討結果を示す図である。
図４７は、堆肥から抽出したＤＮＡの純度を示す図である。
図４８は、活性汚泥からのＤＮＡ抽出法の検討結果を示す図である。
図４９は、活性汚泥から抽出したＤＮＡの純度を示す図である。
図５０は、湖底堆積物から抽出したＤＮＡの電気泳動写真である。
図５１は、湖底堆積物からのＤＮＡ抽出法の検討結果を示す図である。
図５２は、湖底堆積物から抽出したＤＮＡの純度を示す図である。
図５３は、土壌ＤＮＡのＤＧＧＥ解析結果を示す図である。
図５４は、糞便ＤＮＡのＤＧＧＥ解析結果を示す図である。
図５５は、堆肥ＤＮＡ及び活性汚泥ＤＮＡのＤＧＧＥ解析結果を示す図である。
図５６は、湖底堆積物ＤＮＡのＤＧＧＥ解析結果を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明は、環境サンプルからＤＮＡを効率良く抽出、精製又は回収する方法であり、ＤＮＡを抽出するステップと、ＤＮＡ抽出液中からＤＮＡ以外の夾雑物質を除去する精製するステップが含まれる。
本発明においては、まず環境サンプルからのＤＮＡの抽出に適した条件の１つとして、使用する界面活性剤の種類及びその濃度を検討した。次に、ＤＮＡの抽出が困難とされる火山灰土壌であっても高収量のＤＮＡを得るためのＥＤＴＡ及びリン酸緩衝液およびその混合液の濃度条件を検討した。さらに、ＤＮＡを回収するにあたり、最適な沈殿条件、及び夾雑物を含まない最適な精製条件を検討し、ＤＮＡを土壌から効率よく高純度で回収する方法を見出した。
本発明においては、界面活性剤を含むＤＮＡ抽出液による処理をＤＮＡ抽出の基本操作として採用する。そして、抽出の際にｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ又は加熱処理を組合せることによって、効率良く抽出することを可能とする。例えば、環境サンプルと、微小粒子と、所定濃度の界面活性剤が含まれるＤＮＡ抽出液とを混合し、これらの混合物をｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理することによりＤＮＡを抽出する。あるいは、上記土壌サンプルと所定濃度の界面活性剤との混合物を加熱処理することによりＤＮＡを抽出する。このＤＮＡ抽出操作に、抽出液のｐＨ、ＥＤＴＡ又はリン酸緩衝液および両者の混合液の濃度条件、加熱条件、ＣＴＡＢなどの陽イオン界面活性剤の濃度条件、ＣＴＡＢ処理時に添加する塩の種類や濃度、ポリエチレングリコールの濃度条件、およびポリエチレングリコールによるＤＮＡ沈殿操作時のｐＨなどの条件を種々検討することで、土壌の種類や性質に応じた適切な抽出条件、回収条件及び精製条件を設定することが可能となる。
サンプルからＤＮＡを抽出するときに使用する抽出液全体のｐＨは７以上に調製し、その最適ｐＨは８．６である（詳細は後述する）。
それぞれの環境サンプルに応じて界面活性剤と混合する基本的抽出液組成は、ＥＤＴＡ溶液及びリン酸緩衝液を含むものである。
環境サンプルの代表例である土壌からＤＮＡを抽出しようとした場合、関東ローム層等の火山灰土壌からのＤＮＡ抽出においては土壌に含まれる非晶質のアルミニウムにより、ＤＮＡが吸着されて回収率が非常に悪くなる。この土壌による吸着はＥＤＴＡ、リン酸、又はこれらの両者を高濃度で含む溶液を使用することで解決することができる。また、通常の土壌及びその他の微生物を含む環境サンプル、すなわち堆肥や水系の堆積物、活性汚泥や糞便からのＤＮＡ抽出においても、ＥＤＴＡ、リン酸、又はこれらの両者を使用することが有効である。
この場合のＥＤＴＡ及びリン酸の濃度は、それぞれ５０ｍＭ〜６００ｍＭ、１００ｍＭ〜１５００ｍＭであり、ＥＤＴＡとリン酸との混合液ではＥＤＴＡが５０ｍＭ〜６００ｍＭ、リン酸が１００ｍＭ〜７５０ｍＭである。
但し、上記濃度は一例であって、抽出操作の際に行う抽出液添加後の物理的処理の違いにより、濃度を適宜変えることが可能である。
環境サンプルより得たＤＮＡの精製には、ＣＴＡＢを初めとする４級アンモニウム塩（陽イオン界面活性剤）を用いることができる。４級アンモニウム塩としては、例えば陽イオン界面活性剤であるＣＴＡＢ、ＤＴＡＢなどが挙げられる。
本発明において、ＣＴＡＢを用いてＤＮＡを精製するには塩の存在下で行うことが好ましい。この塩としては、例えば塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化カリウム等のカリウム塩が挙げられる。
本発明は、抽出液に陽イオン界面活性剤及び塩溶液を添加することにより、精製時のｐＨを抽出時のｐＨよりも下げることを特徴とする。
ここで、本発明において「添加」とは、一方の溶液に他方の溶液を添加することを意味するほか、一方の溶液と他方の溶液とを混合する意味も包含する。
抽出操作を行った後のＤＮＡを含む抽出溶液は、抽出液に含まれている緩衝液によりｐＨは７．０以上、好ましくは８．０以上に調整されているが、ＣＴＡＢ等の陽イオン界面活性剤とｐＨを低下させる緩衝能をもつ塩溶液とを抽出液に混合することにより、ｐＨを７．０未満に低下させる。従って、塩溶液には酢酸などの酸性側のｐＫａを持つｐＨ緩衝液を含有させることが好ましい。この場合の最適な塩溶液は、３．３３Ｍ酢酸ナトリウム／１．６７Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ５．２）の溶液である。この２種類のナトリウム塩を混合することにより、抽出液のｐＨは６．０以下に低下させることができる。なお、陽イオン界面活性剤及び塩溶液は、両者を混合した後に混合液を抽出液に添加することも可能である。
ＤＮＡを回収するには、ＣＴＡＢ等と塩溶液を添加し、攪拌後クロロホルムを添加してさらに攪拌し、遠心後の水相（上清）をＤＮＡ溶液として採取する。
上記採取された溶液に対し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の溶液を添加することにより、ＤＮＡのみを選択的に沈殿させる。ＰＥＧを含む溶液は、精製時に下げたｐＨを再びアルカリ性に上昇させる緩衝能を有するものである。精製時に酸性側に下げたｐＨを、回収時にアルカリ側にｐＨを上昇させることで、より選択的なＤＮＡの沈殿・回収が可能であり、腐植や糖などの夾雑物の共沈を防ぐことができる。アルカリ性の緩衝能を持つＰＥＧ溶液としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝系などによりｐＨが８．０以上のＰＥＧ溶液を作製し、使用することができる。最適な条件は、１２％ＰＥＧ／１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の溶液をＤＮＡ抽出液と混合して遠心を行う。この溶液の混合により、ＤＮＡを回収するときの溶液のｐＨは７．５以上、好ましくは８．０以上に上昇する。ＰＥＧ溶液とＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液とは、それぞれ別々に調製し、最終のｐＨが７．５以上となるように混合してもよい。
ここで、本明細書において使用する略号の意味は以下の通りである。
ＣＴＡＢ：セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）
ＤＴＡＢ：ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ｄｏｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）
ＳＤＳ：硫酸ドデシルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）
２．環境サンプル
本発明において、ＤＮＡ抽出の対象となる環境サンプルは、環境中に存在する固形又は液体成分であれば特に限定されるものではない。例えば土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥、糞便などが挙げられ、これらの環境サンプルを使用目的に応じて適宜選択することができる。
（１）土壌
本発明において、回収の対象となる土壌サンプルは特に限定されるものではなく、あらゆる土壌を使用することができる。わが国は火山灰土壌が比較的広い範囲で分布しており、火山灰土壌がＤＮＡ抽出の対象土壌となることが多いが、対象土壌は非火山灰土壌であってもよい。
火山灰土壌としては関東地方に主に分布する富士火山灰の堆積物である関東ローム層や、各地の火山噴出物および降灰した火山灰を母材とするアロフェン質黒ボク土および東北地方の一部に見られるような非アロフェン質黒ボク土などが挙げられ、非火山灰土壌としては日本各地の平野部の灰色低地土、低地水田土、火山灰の影響を受けていない褐色森林土、赤色土、黄色土などが挙げられる。
（２）堆肥
堆肥は作物の栽培および土壌の生産性の維持のためには欠く事のできない有機質肥料である。堆肥は通常否わらや麦わらなどの畑作物の植物残渣もしくは落ち葉や木材チップのような木質系の材料に無機肥料や家畜糞を窒素源として添加して、堆積し、微生物による分解作用（醗酵作用）により、その一部が分解されることで作られるものである。また、牛糞や馬糞、豚糞、鶏糞などの家畜糞を堆積、醗酵させることによっても作られる。これらの堆肥の特徴は醗酵前と比較すると堆肥化後のサンプルでは有機物の分解作用によって増殖した微生物菌体が多量に含まれることが挙げられる。これらの微生物は土壌に添加された後、肥料源として有用のみならず、作物の生育を促進する有用微生物としても重要なものである。また近年、農薬やＰＣＢなどの難分解性有機物の処理にこのような堆肥由来の微生物が利用されることも多い。
（３）水系堆積物
水系堆積物は湖、池、河川や海などのそこに沈殿した土壌や有機物、微生物などの堆積物を指す。これらのサンプル中には水中で増殖した植物および動物プランクトンやこれらの死骸が大量に堆積し、これらを分解する微生物も多く存在している。微生物によってこれらの死骸は分解され、そこに含まれる窒素などの養分は無機化され、再び水中に放出される。このようにして堆積物に含まれる微生物は栄養分を循環させる役割を果たしている。その微生物の数や種類を明らかにすることは水系での物質循環を明らかにする上で極めて重要であると考えられている。
（４）活性汚泥
活性汚泥法は汚水を処理する最も一般的な方法の一つである。汚水には一般的な都市生活廃水および家畜のし尿などが代表的なものとして挙げられる。これらの汚水に空気によるばっ気処理を施し、微生物により有機物を分解し、その分解産物および分解により増殖した微生物菌体を回収することで汚水を浄化するものである。この処理で増殖した微生物すなわち活性汚泥は処理する汚水の水質や処理条件によってその構成が異なり、汚水の浄化処理においてこれらの微生物の分析は極めて重要である。
（５）糞便
人や家畜、昆虫などの糞便は非常に多量の微生物が含まれている。人の糞便には腸内で増殖した大腸菌や乳酸菌などを初めとして極めて多くの微生物が含まれている。その中には有用な微生物が含まれていることが現在までに明らかにされている。また食中毒などの原因となる有害微生物も含まれることからこれら糞便に含まれる微生物の分析は極めて重要である。また反芻動物である牛などの草食動物は摂取した植物を腸内の微生物を利用して一部を分解しており、糞便の分析により、これらの微生物群集を明らかにすることは極めて重要である。
３．ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ又は加熱処理
ビーズ打破（ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ）とは、スクリューキャップチューブに土壌とＤＮＡ抽出液を添加し、微小粒子（ガラスビーズ、シリカジルコニアビーズ、アルミナビーズなど）を加えて物理的に細胞を破壊する方法であり、ｂｅａｄｓ組成等も含めＢ▲ｕ▼ｒｇｍａｎｎら（２００１）により詳しく検討されている。この方法では、細胞外多糖膜をもつためＳＤＳなどの界面活性剤の影響を受けにくいグラム陽性菌であっても機械的に破砕されるため、極めて高収率でＤＮＡが抽出できる。また、抽出も短時間で終わるため、腐植物質の混入が少ない土壌ＤＮＡ試料を得ることができる。
具体的には、スクリューキャップチューブに土壌、ビーズ及びＤＮＡ抽出液を添加して激しく攪拌する。ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ時には、最も強く物理的衝撃がＤＮＡに加わるため、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇの強度を適宜調節する。
本発明においては、ＤＮＡの抽出の際に加熱処理をすることができる。加熱条件は、４５℃〜７０℃で０．５〜２４時間であり、好ましくは６０℃で１時間である。
４．ＤＮＡ抽出液
（４−１）界面活性剤
細菌や真菌などからのＤＮＡ抽出には、まずＳＤＳやＣＴＡＢをはじめとする界面活性剤により細胞のタンパク質を変性させ細胞構造を破壊することが必要となる。またフェノールや塩化ベンジルなど強力なタンパク質の変性能力を持ち、細胞壁や細胞膜も破壊する有機溶媒も使用されることがある。
ＳＤＳは分子生物学においてよく使用される界面活性剤であり、微生物、動物、植物を問わずＤＮＡ抽出に広く使用されている（Ｍａｒｍｕｒ １９６１）。ＣＴＡＢを用いる手法は、当初は植物からＤＮＡ抽出する方法として開発されたが（Ｍｕｒｒａｙ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ １９８０）、微生物などからのＤＮＡの抽出にも一部で使用されている（Ｖｅｌｅｇｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．１９９９）。ＣＴＡＢには、界面活性剤としてタンパク質を変性させる作用の他に、低塩濃度においてＤＮＡと選択的に結合して沈殿させる特性もある（Ｍｕｒｒａｙ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ １９８０）。またＣＴＡＢは溶液中の多糖の除去（Ｓａｍｂｒｏｏｋ １９８９）や腐植物質の除去（Ｗｉｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．１９９６、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．１９９６）にも効果的であることが知られていている。
グアジニジンチオシアネートは強力なタンパク質変性剤であり、ＤＮＡの抽出だけではなくＲＮＡの抽出にもよく使用されている（ｅ．ｇ．Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．１９７９、Ｐｉｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８９、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ＆ Ｓａｃｃｈｉ １９８７、Ｌｏｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９８７、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．２０００）。この方法ではサルコシルを界面活性剤として添加している。ベンジルクロライド法（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．１９９３）は、塩化ベンジルを菌体破壊に使う簡易で迅速な方法として開発された。塩化ベンジルは細菌や糸状菌、植物が細胞壁の構成成分として合成するポリサッカライドすなわちセルロース、ヘミセルロースのＯＨ基と反応し、細胞を破壊する。これにより水溶性分子であるＤＮＡは塩化ベンジルの有機層から水層に抽出され、またこの方法はその後の遠心分離により塩化ベンジルからなる有機層と水層の二層界面で除タンパク質も同時に行える利点がある。この方法を応用したキットも販売されている（製品名Ｉｓｏｐｌａｎｔ、Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ、Ｊａｐａｎ）。
ＴｒｉｔｏｎＸ１００は非イオン系の界面活性剤であり、ＳＤＳやＣＴＡＢなどイオン系の界面活性剤よりも穏やかな界面活性作用を持っており、タンパク質変性作用は弱い。そのため、活性を維持したまま調製したい膜タンパク質の抽出や、ＰＣＲなどの酵素反応液中に酵素の活性保持、増強の目的で用いられることがある。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００は１％の濃度までならＰＣＲ反応を阻害しないので、コロニーＰＣＲや酵素反応と組み合わせた簡便なＤＮＡ解析に用いられている（Ａｇｅｒｓｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．１９９７）。
本発明においては、ＤＮＡを抽出することができる限り、界面活性剤の種類に限定されるものではない。例えばＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム等が好ましく、ＳＤＳがさらに好ましい。
使用する界面活性剤の濃度は、ＳＤＳの場合は５．０％以下であり、０．１〜２．０％が好ましく、０．５％〜２．０％がより好ましく、０．５〜１．０％がさらに好ましい。また、ＴｈｉｔｏｎＸ−１００の場合は５．０％以下であり、０．１〜２．０％が好ましく、０．５％〜２．０％がより好ましく、０．５〜１．０％がさらに好ましい。
（４−２）抽出液のｐＨ
ＤＮＡの抽出には通常ｐＨ８．０〜８．３程度の弱アルカリ性の緩衝液が使用されている。このｐＨ条件は、ＤＮＡの安定性ゆえ抽出液にも適用されていると考えられ、抽出後のＤＮＡを溶液として保存するために用いるＴＥ緩衝液と同じｐＨである。一方、日本の大部分の土壌がｐＨ５．５〜６．５程度の弱酸性であり、一部の火山灰土壌、非アロフェン質黒ボク土壌にはｐＨ４．５〜ｐＨ５．５という酸性土壌も存在している。そこで、土壌からＤＮＡを抽出する際には、抽出液自体のｐＨが抽出量に与える影響のみならず、土壌の酸度により抽出液のｐＨが影響を受け、抽出時のｐＨが変化してしまうことも考慮する必要がある。
本発明においては、抽出液全体のｐＨは、７以上であり、好ましくは８．０〜９．０、より好ましくは８．６付近とすることができる。
（４−３）ＥＤＴＡ濃度、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ濃度及び加熱処理
一般に生物体からのＤＮＡ抽出の際には、細胞から放出されるＤＮａｓｅによってＤＮＡが分解されることを防ぐためにＥＤＴＡが用いられ、その濃度は１〜１００ｍＭである。土壌からのＤＮＡ抽出においては、分子生物学分野でもよく使用されているＴｒｉｓ−ＥＤＴＡの組み合わせが同じく使われる。多くの土壌ＤＮＡ抽出法において、抽出液中のＥＤＴＡは主にＤＮａｓｅの不活性化という目的で使用されていると考えられ、その濃度は使用目的を果たすのに十分な量である１００ｍＭ以下となっている（ｅ．ｇ．Ｋｕｓｋｅ ｅｔ ａｌ．１９９８、Ａｒｌｅｎｅ Ｐｏｒｔｅｏｕｓ ｅｔ ａｌ．１９９４、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９９、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９、Ｗａｔｓｏｎ ＆ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ２０００、Ｂ▲ｕ▼ｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２００１）。
現在のところ代表的な土壌ＤＮＡ抽出法であるＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）の手法においても、１００ｍＭ ＥＤＴＡ（および１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０））が使用されている。ＥＤＴＡ濃度を高くすると、ＤＮＡの酵素分解が抑制されるのと同時に土壌粒子への吸着も減少するため、ＤＮＡの収量は増加するものの、その収量増加と同時に腐植物質の混入も多くなるため、ＥＤＴＡは低濃度の方が好ましいとの報告もある（Ｋｒｓｅｋ ＆ Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ １９９９）。すなわち、高濃度ＥＤＴＡの使用は、ＤＮＡの収量増加の利点よりも、腐植物質の混入という欠点ゆえに敬遠されてきており、しかもその場合の「高濃度」というレベルは１００ｍＭ程度のものである。
日本の代表的な土壌である火山灰土壌は、前述の通りＤＮＡが吸着されやすい土壌であると考えられる。日本の火山灰土壌のように非晶質アルミニウムに富んだ土壌は、海外ではニュージーランドなど限られた国や地方に点在しているのみであり、世界の広い範囲には分布していない。多くの海外の研究者にとって、アロフェンを多く含む土壌は研究対象とならず、それゆえ、従来の土壌ＤＮＡ抽出法のほとんどが、火山灰土壌を考慮せずに開発されてきたと思われる。よって、ＥＤＴＡ濃度の設定も、火山灰土壌以外の土壌で検討されたものである。しかしながら、多くの多価イオンを形成する金属イオンに対し強力なキレート剤であるＥＤＴＡは火山灰土壌においてＤＮＡ吸着の原因である活性アルミニウムと錯体を形成すると考えられ、火山灰土壌では従来検討されてきた範囲外の濃度のＥＤＴＡが効果を発揮する可能性が考えられた。また、火山灰土壌以外の土壌であっても、土壌へのＤＮＡ吸着が起きているならば、ＥＤＴＡ濃度を高めることにより多くのＤＮＡが抽出できる可能性も考えられた。
火山灰土壌の非晶質成分の分析には通常、クエン酸やシュウ酸、ピロリン酸など土壌中のＡｌやＦｅの形態により錯形成能が異なるキレーターが使用される。これらの反応性の異なるキレーターを使用することにより、土壌の非晶質成分を選択的に融解し、定量分析を行っている。一方、ＥＤＴＡはキレート剤の中でもほとんどの金属イオンに対して極めて優れたキレート安定定数を持つ化合物である。ＤＮＡの抽出や保存においてＥＤＴＡが使用されるのはＤＮａｓｅがその活性保持に必要としているＭｇイオンをキレートしてＤＮａｓｅを失活させるためである。
そこで、選択融解法におけるキレーターと同様に、土壌中からＤＮＡ吸着の原因となる非晶質ＡｌをＥＤＴＡを用いて除去できるのではないか、またＥＤＴＡがカルボキシル基により土壌に吸着することでＤＮＡの吸着を解除することができるのではないかと推測し、抽出液中のＥＤＴＡ濃度について検討した。ＥＤＴＡによりキレートされた金属イオンは溶液中に金属イオン−ＥＤＴＡ複合体として抽出されるため、この定量を通して、吸着の原因がどの金属元素であるかも推定することができると考えられた。
本発明において抽出液として使用されるＥＤＴＡの濃度は、例えば２０ｍＭ以上である。
火山灰土壌をｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理により土壌ＤＮＡ抽出しようとする場合のＥＤＴＡ濃度は、５０ｍＭ以上であり、好ましくは１００ｍＭ〜６００ｍＭ、好ましくは２００〜４００ｍＭ、さらに好ましくは３００ｍＭ〜４００ｍＭである。
本発明においては、上記濃度のＥＤＴＡを含む抽出液と土壌とを混合し、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後、さらに高濃度ＥＤＴＡ溶液を含有させて、濃度を例えば６００〜１１００ｍＭ、好ましくは６００〜８００ｍＭに高めた状態で加熱処理を併用することができる。加熱条件は、４５℃〜７０℃で０．５〜２４時間であり、好ましくは６０℃で１時間である。これにより、土壌からＤＮＡをより高収量で抽出することができる。
また、本発明においては、抽出液にＴｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液を含めることもできる。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの濃度は、例えば１００ｍＭである。なお、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、本発明全体を通して、ＤＮＡ抽出液に含めることができる。
（４−４）抽出回数
本発明においては、ＤＮＡの抽出回数は１回に限定されるものではない。ＥＤＴＡを含むＤＮＡ抽出液についてｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇを行った後に遠心し、その上清を採取してＤＮＡ抽出液とする。上清を採取した後のチューブには土壌が残存する。この土壌中には１回の抽出作業ではすべて抽出できずに土壌に吸着したまま残されたＤＮＡも含まれていると考えられる。
そこで本発明において、上記抽出液のｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ工程、遠心工程、上清の採取工程を複数回繰り返すことができる。繰り返す回数は、例えば１〜４回である（回数は全部で２〜５回となる）。
（４−５）リン酸緩衝液
リン酸緩衝液は生物学的な実験で使用される代表的な緩衝液の一つである。土壌からのＤＮＡ抽出においては、間接抽出法の多くがリン酸緩衝液を使用して土壌からの微生物の分離を行っており（ｅ．ｇ．Ｔｏｒｓｖｉｋ ｅｔ ａｌ．１９８０）、また直接抽出法でもリン酸緩衝液が使用されることは少なくない（ｅ．ｇ．Ｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．１９８７、Ｃｕｌｌｅｎ ＆ Ｈｉｒｓｅｈ １９９８）。直接抽出法、間接抽出法を問わず、ＤＮＡ抽出にリン酸緩衝液が使用される場合のリン酸濃度は１００〜１２０ｍＭに設定されている。しかし、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）が報告しているように、リン酸緩衝液はＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液よりも多くの腐植物質の溶出を引き起こし、その除去が極めて困難となるため、ＤＮＡ抽出に関してはリン酸緩衝液よりもＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液を使用したほうが良いとされている。しかし、ＥＤＴＡと土壌中のアロフェン態のＡｌとは錯体形成の反応速度が遅いため、加熱処理によりその反応を加速させない限りＥＤＴＡ緩衝液のみを用いても土壌ＤＮＡを十分に抽出することはできない。一方、リン酸イオンは火山灰土壌に添加すると極めて短時間で土壌のＡｌやＦｅに吸着され不動態化することが知られている。非晶質Ａｌすなわち活性Ａｌに富む火山灰土壌ではこのリン酸の不動態化が作物生産上大きな制限となっているため、「リン酸吸収係数」が重視されている。
これらのことから、リン酸イオンを土壌に添加することにより、ＤＮＡの吸着に関わるアロフェン態Ａｌをマスキングし、ＤＮＡの吸着を抑制できるのではないかと考えられる。
本発明において使用することができるリン酸緩衝液は特に限定されるものではなく、リン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液などのリン酸塩緩衝液などが挙げられる。
ＤＮＡ抽出液に使用されるリン酸緩衝液の濃度は、２５０〜２０００ｍＭである。
火山灰土壌の場合は、例えば２５０〜２０００ｍＭであり、非火山灰土壌の場合は例えば２５０〜１０００ｍＭである。
（４−６）高濃度ＥＤＴＡとリン酸緩衝液との併用
ＤＮＡの抽出液は、ＥＤＴＡ及びリン酸緩衝液のいずれを使用しても、ＤＮＡの最大収量が得られる条件（ＥＤＴＡ、リン酸、ＳＤＳの濃度など）が土壌によって異なる。また、沈殿精製操作の際に高濃度の緩衝液は溶液が混ざり合わないなど不都合が生じたため、ＥＤＴＡとリン酸緩衝液とを併用することを試みた。
本発明においては、ＥＤＴＡの濃度は１００〜８００ｍＭ、例えば２００〜８００ｍＭであり、リン酸緩衝液（例えばリン酸カリウム緩衝液）の濃度は２５０〜２０００ｍＭ、例えば２５０〜１２５０ｍＭの範囲で使用することができる。ＥＤＴＡとリン酸緩衝液とを併用することにより、それぞれを単独で使用するよりもＥＤＴＡ及びリン酸緩衝液の濃度を低く抑えることができる。
火山灰土壌について使用するときの組合せは、ＥＤＴＡが１００〜６００ｍＭであってリン酸緩衝液が２５０〜１５００ｍＭ（例えば２５０〜１２５０ｍＭ）であることが好ましく、非火山灰土壌について使用するときの組合せは、ＥＤＴＡが１００〜４００ｍＭであってリン酸緩衝液が２５０〜１２５０ｍＭであることが好ましい。火山灰土壌及び非火山灰土壌のいずれの場合も、ＥＤＴＡが４００ｍＭ、リン酸緩衝液が７５０ｍＭの組合せが最も好ましい。上記４００ｍＭ ＥＤＴＡと７５０ｍＭリン酸緩衝液との組合せにより、ほとんどすべての土壌に対してほぼ最大収量のＤＮＡを得ることができるため、この組合せはいわゆる「ユニバーサルな緩衝液組成」であるといえる。
但し、上記ユニバーサルな緩衝液組成は、土壌によっては土壌ＤＮＡの低分子化（２０〜７ｋｂｐ）が生じることがある。微生物群集構造解析をする上では、一般に比較的短いＤＮＡ領域（２００〜１５００ｂｐ）しか解析対象としないことなどから、多少低分子化されたＤＮＡであっても十分に目的は達成できる。しかし、クローニングなど断片化したＤＮＡでは不都合な操作や、群集構造解析であってもより正確に解析したい場合には、より高分子のＤＮＡが得られる抽出条件（ＥＤＴＡ及びリン酸緩衝液の濃度）を適宜設定する。
本発明においては、土壌サンプルを、ＳＤＳ又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＥＤＴＡ及びリン酸緩衝液を含む抽出液に混合し、これを加熱処理することもできる。ＳＤＳ又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度は５％以下であり、ＥＤＴＡの濃度は１００〜８００ｍＭ、例えば２００〜８００ｍＭであり、リン酸緩衝液（例えばリン酸カリウム緩衝液）の濃度は２５０〜２０００ｍＭ、例えば２５０〜１２５０ｍＭの範囲で使用することができる。加熱条件は、４５℃〜７０℃で０．５〜２４時間であり、好ましくは６０℃で１時間である。
（４−７）２ステップ法
本発明においては、土壌からＤＮＡを回収するに際し、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ（第１段階）では低濃度のＥＤＴＡ／リン酸緩衝液を使用し、抽出の段階（第２段階）では高濃度のＥＤＴＡ／リン酸緩衝液を使用することにより、さらに効率にＤＮＡを抽出することができる。このように、濃度を２段階に設定して抽出する操作を「２ステップ法」という。２ステップ法を採用することにより、ＤＮＡを効率よく抽出することができるとともに、ＤＮＡの低分子化を回避することができる。
第１段階では、５％以下のＳＤＳ（好ましくは１％ＳＤＳ）又は５％以下のＴｒｉｔｏｎＸ−１００とＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液との混合物（これを「抽出液Ｉ」という）を使用する。
上記ＤＮＡ抽出液Ｉの存在下で土壌サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理した後、数秒の簡易高速遠心を行って、土壌溶液をチューブ下部に集め、次に高濃度のＥＤＴＡ及びリン酸緩衝液を含む抽出液（「抽出液ＩＩ」という）を調製してよく攪拌する。抽出液ＩＩの組成は、上記抽出液Ｉに、例えば、
（ｉ）７５〜１２００ｍＭ、好ましくは６００〜１２００ｍＭのＥＤＴＡ、
（ｉｉ）２５０〜３０００ｍＭ、好ましくは７５０〜２２５０ｍＭのリン酸緩衝液、又は
（ｉｉｉ）上記ＥＤＴＡ（好ましくは１００〜６００ｍＭ）とリン酸緩衝液（好ましくは２５０〜１２５０ｍＭ）との混合物
を混合することにより調製することができる。抽出液ＩＩを作製するために抽出液Ｉと混合するＥＤＴＡ及びリン酸緩衝液については、ＥＤＴＡの濃度が４００〜８００ｍＭであり、リン酸緩衝液の濃度が７５０〜１５００ｍＭであることがさらに好ましく、ＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭであり、リン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭであることが最も好ましい。
その後は、上記抽出液ＩＩを遠心してＤＮＡを抽出させ、上清からＤＮＡを回収する。
本発明においては、上記２ステップ法にさらに改良を加えて、ＤＮＡの抽出効率を高めたうえで、ＤＮＡの低分子化を抑えることができる。この改良法を「２ステップ改良法」という。
この場合は、第１段階に使用する抽出液は、５％以下のＳＤＳ（好ましくは１％ＳＤＳ）又は５％以下のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４００ｍＭ以下のＥＤＴＡ及び２５０ｍＭ以下のリン酸緩衝液を含むものである（「抽出液ＩＩＩ」という）。抽出液ＩＩＩにおいて、ＥＤＴＡは３００ｍＭが好ましく、リン酸緩衝液は１００ｍＭが好ましい。そして、上記抽出液ＩＩＩの存在下で土壌サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理する。
次に、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液ＩＩＩに、４００〜１０００ｍＭ（好ましくは４００〜６００ｍＭ）のＥＤＴＡ、７５０〜２０５０ｍＭのリン酸緩衝液、又は前記ＥＤＴＡとリン酸緩衝液との混合物を混合して抽出液を調製する。このようにして調製された抽出液を「抽出液ＩＶ」という。
抽出液ＩＶを作製するために抽出液ＩＩＩに混合するＥＤＴＡ及びリン酸緩衝液については、ＥＤＴＡの濃度が４００ｍＭ、かつ、リン酸緩衝液の濃度が７５０ｍＭであることが好ましい。
その後は、抽出液ＩＶを遠心し、上清からＤＮＡを回収する。
本発明においては、上記２ステップ法及び２ステップ改良法を行う際、２ステップ法においては抽出液ＩＩを調製した後に、２ステップ改良法においては抽出液ＩＶを調製した後に、それらの抽出液の存在下で土壌サンプルを加熱（例えば６０℃で１時間）処理し、土壌ＤＮＡの土壌からの回収率を高めて土壌ＤＮＡを抽出することも可能である。 また、本発明においては、上記２ステップ法及び２ステップ改良法を行う前に、１００〜４００ｍＭ ＥＤＴＡ及び２５０〜１５００ｍＭリン酸緩衝液を含む抽出液（「抽出液Ｖ」という）の存在下で土壌サンプルを加熱（例えば６０℃で１時間）処理又はｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、処理後の抽出液Ｖを遠心し、上清を回収した後（「上清Ｉ」とする）に、抽出液Ｉ又は抽出液ＩＩＩを加えてさらにｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理し、処理後の溶液を遠心して上清を得（上清ＩＩとする）、上清Ｉ及び上清ＩＩから土壌ＤＮＡを回収することもできる。
また、１００〜８００ｍＭ ＥＤＴＡ及び２５０〜２０００ｍＭリン酸緩衝液を含む溶液の存在下で土壌サンプルを加熱（例えば６０℃で１時間）処理またはｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理を行い、処理後の溶液に、ＳＤＳ又は抽出液ＩＩＩを加えてさらに加熱処理を行い、その後遠心してこの上清から土壌ＤＮＡを回収することも可能である。
さらに、本発明においては、最初にＳＤＳが存在しない状態で加熱処理及びｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇを組み合わせることで、ＤＮＡを抽出することもできる（下記（ｉ）〜（ｉｖ））。
（ｉ）ＳＤＳ Ｆｒｅｅ加熱＋ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ法
まず、１００〜４００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜１５００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液（「抽出液Ｖ」という）の存在下で土壌サンプルを加熱処理する。加熱処理条件は前記と同様に、４５℃〜７０℃で０．５〜２４時間、好ましくは６０℃で１時間である。この場合、抽出液ＶはＥＤＴＡが４００ｍＭ、リン酸緩衝液が７５０ｍＭであることが好ましい。
次に、加熱処理後の抽出液Ｖを遠心して上清を採取する。上清を採取した後は、チューブ中に土壌サンプルが残存しているので、これを、５％以下のＳＤＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４００ｍＭ以下のＥＤＴＡ及び２５０ｍＭ以下のリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液ＩＩＩの存在下でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理する。その後、抽出液ＩＩＩを遠心して上清を採取し、上記２つの採取された上清からＤＮＡを回収する。
（ｉｉ）ＳＤＳ Ｆｒｅｅ ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ＋ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ法
１００〜４００ｍＭのＥＤＴＡ及び２５０〜１５００ｍＭのリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液Ｖの存在下で土壌サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理する。次に、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後の抽出液Ｖを遠心して上清を採取する。そして、残存した土壌サンプルを、５％以下のＳＤＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、４００ｍＭ以下のＥＤＴＡ及び２５０ｍＭ以下のリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液ＩＶの存在下でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理する。その後、抽出液ＩＶを遠心して上清を採取し、上記２つの採取された上清からＤＮＡを回収する。
（ｉｉｉ）ＳＤＳ Ｆｒｅｅ加熱＋加熱法
２００〜８００ｍＭ ＥＤＴＡ及び２５０〜２０００ｍＭリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で土壌サンプルを第一加熱処理する。これと５％以下のＳＤＳとを混合して土壌サンプルを第二加熱処理する。そして、第二加熱処理後の抽出液を遠心したのち、上清からＤＮＡを回収する。この場合、抽出液はＥＤＴＡが４００ｍＭ、リン酸緩衝液が７５０ｍＭであることが好ましい。
（ｉｖ）ＳＤＳ Ｆｒｅｅ ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ＋加熱法
１００〜４００ｍＭ ＥＤＴＡ及び２５０〜１５００ｍＭリン酸緩衝液を含むＤＮＡ抽出液の存在下で土壌サンプルをｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理する。これと５％以下のＳＤＳとを混合して土壌サンプルを加熱処理する。その後抽出液を遠心し、上清からＤＮＡを回収する。
（４−８）まとめ−土壌ＤＮＡの抽出に関して−
本発明においては、ＤＮＡ抽出に関して種々検討した結果、以下のことがいえる。
（ｉ）土壌からのＤＮＡ抽出において、抽出時の抽出液ｐＨは８．６付近で安定している必要がある。
（ｉｉ）火山灰土壌からのＤＮＡ抽出を困難にしていた最大の原因は、土壌によるＤＮＡの吸着である。
（ｉｉｉ）火山灰土壌からのＤＮＡ抽出には高濃度のＥＤＴＡ、リン酸を用い、非晶質ＡｌによるＤＮＡの吸着を解消すると効果的である。
（ｉｖ）土壌ＤＮＡの最大収量が得られる抽出液中のＥＤＴＡおよびリン酸の濃度は、土壌により異なる。
（ｖ）リン酸はＤＮＡの抽出効果が高い。但し、火山灰土壌に用いる場合は、極めて高濃度で使用する必要があるため、ＤＮＡの低分子化に注意する。
（ｖｉ）ＥＤＴＡとリン酸を共存させることにより、土壌ＤＮＡ抽出への補完効果が見られ、比較的低濃度での使用でもＤＮＡ抽出効果が高い。
（ｖｉｉ）４００ｍＭ ＥＤＴＡ／７５０ｍＭリン酸緩衝液／１％ＳＤＳ抽出液は、火山灰土壌、非火山灰土壌を問わず、ほとんどの土壌ＤＮＡを抽出できるユニバーサルな抽出液組成であるといえる。
（ｖｉｉｉ）ＤＮＡの低分子化を阻止するためにはｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ時の塩濃度に留意する必要があり、操作時の塩濃度を低くすることによりＤＮＡの低分子化は防ぐことができる。
（ｉｘ）低濃度緩衝液でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇを行い、その後高濃度ＥＤＴＡ−リン酸緩衝液でＤＮＡを剥離させることにより、高分子ＤＮＡも得ることが可能である。この場合も、４００ｍＭ ＥＤＴＡ／７５０ｍＭリン酸による土壌ＤＮＡの回収率が最もよい。
（ｘ）高濃度ＥＤＴＡ−リン酸緩衝液でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ又は加熱処理を行っても界面活性剤であるＳＤＳ及びＴｒｉｔｏｎＸ１００を含んでいなければ、土壌ＤＮＡの低分子化は抑えることができる。ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ又は加熱処理に界面活性剤を含む抽出液を添加して抽出することで高分子ＤＮＡを抽出することが可能である。
５．ＤＮＡの精製・回収
遺伝子の解析によく使用される技術としては、ＰＣＲ反応、クローニング、シークェンシング、ハイブリダイゼーション、遺伝子発現試験などがあげられる。中でもＰＣＲ反応は、多くの遺伝子解析にとって重要で欠くことができない要素技術であり、遺伝情報に基づく微生物群集構造解析にとっても必須の操作である。土壌からのＤＮＡ抽出の場合にも、注目されるのは抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ産物が得られるかどうかであり、その成否は土壌ＤＮＡの純度を判定する一つの指標として用いられることもある（Ｔｓａｉ ＆ Ｏｌｓｏｎ １９９２、Ｗａｔｓｏｎ ＆ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ２０００）。
土壌からのＤＮＡ抽出液には、微生物や植物などの細胞膜や細胞壁といった破砕物、界面活性剤などにより変性したタンパク、土壌自体に蓄積していた腐植物質を初めとする土壌有機物や重金属などが含まれており、その後の解析のためにはこれらの夾雑物をできるだけ取り除くのが望ましい。
微生物菌体由来の細胞構成成分の混入は、少量の場合はＰＣＲ反応の阻害は著しくないとされている。その理由は、これら菌体構成成分は、本来同じ菌体内で機能するＤＮＡポリメラーゼの働きを阻害するものではないからである。事実、Ｅ．ｃｏｈやその他の培養菌株を材料としたコロニーＰＣＲは頻繁に行われており、これらは菌体自体をＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲ反応の加熱により菌タンパクを変性させてＤＮＡを反応液中に放出させ、ＰＣＲ反応を行っているものである。菌体自体がＰＣＲ反応液中に存在しているにもかかわらず、ＰＣＲは阻害されていない。しかし、土壌からＤＮＡを抽出すると、このような細胞構成成分以外の様々な物質が多量に存在し、これらが抽出操作に伴い、ＤＮＡ試料に混入する。とりわけ腐植物質はナノグラム単位の微量な混入であってもＰＣＲ反応を強く阻害することが知られている（Ｔｓａｉ ＆ Ｏｌｓｏｎ １９９２、Ｂｏｏｎ ｅｔ ａｌ．２００２、Ｗａｔｓｏｎ ＆ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ２０００）。よってこの腐植物質をＤＮＡ溶液の中からできるだけ取り除くことが重要となる。
土壌ＤＮＡの精製操作に関しては、これまでにいくつもの研究がなされてきた。なかでもゲルろ過やアガロース電気泳動切り出し、ハイドロキシアパタイトカラム、カオトロピック効果を利用したガラスパウダーもしくはシリカメンブレン精製、磁性ビーズによる分離精製などがよく行われている。ゲルろ過によるＤＮＡの精製は、土壌ＤＮＡと腐植物質の分離に最もよく使用されているものである（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９、Ｈｏｗｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３）。カラムに充填した樹脂の間に試料を通じ、遠心するのみで精製作業が行えるスピンカラムも製品化されている。ゲルろ過による土壌ＤＮＡの精製の原理についてはＭｉｌｌｅｒ（２０００）によって詳しく検討されている。ゲルろ過に使用される樹脂製品にはＳｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌなどがあるが、その分子ふるい効果や特性は異なっており、腐植物質とＤＮＡの分離の目的ではＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂを最も高く評価する報告がある（Ｍｉｌｌｅｒ ２００１、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ １９９７）。
しかし、ゲルろ過による精製はカラムへの樹脂の充填、ＤＮＡ画分の分取が煩雑であること（充填されている樹脂量と溶出液量の条件がかなり厳密であるため）、またすべての腐植物質が取り除けるわけではなく、一部の腐植物質がＤＮＡ画分にも混入することが問題点としてあげられる。土壌に蓄積されている腐植物質は、その性質、形態、分子量がそれぞれすべて異なっており、数種類の土壌試料に含まれる腐植物質について得られた知見を元に精製を行おうとしても、土壌の種類が異なれば混入してくる腐植物質の特性も異なるためであると考えられる。また通常使用される２ｍｌ以下の容量のカラムでは、おのずと試料負荷量が小さくなり、ごく少量のＤＮＡ溶液しか精製できない。
アガロースゲル電気泳動後のＤＮＡ切り出し操作は、巨大分子であるＤＮＡとより低分子である腐植物質を分離してＤＮＡのみを回収しようというものである（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．１９９６、Ｋｕｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１、Ｋｕｒｉｅｎ ＆ Ｓｃｏｆｉｅｌｄ ２００２、Ｃｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７）が、アガロースゲルからの切り出し操作は極めて煩雑である。
これら以外に、ＤＮＡ抽出の際に腐植物質のコンタミネーションをできるだけ減らすため、緩衝液の組成などを検討した研究も多く、また、土壌ＤＮＡ抽出液からのおおまかな腐植物質除去のために、ＣＴＡＢやＰＶＰＰなど腐植物質の除去剤が使用されることも多い。
（５−１）精製
ＤＮＡの精製工程は、前述のｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理又は加熱処理後の抽出液とＣＴＡＢ及び塩とを混合してＤＮＡを精製する工程、あるいは前記ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理又は加熱処理後の抽出液を遠心し、遠心後の上清とＣＴＡＢ及び塩とを混合してＤＮＡを精製する工程を含むものである。ＤＮＡの精製とは、ＤＮＡの抽出液に含まれる、ＤＮＡ以外の夾雑物を除去することを意味する。また、本発明の精製方法は、上記抽出工程における抽出液又は抽出されたＤＮＡを精製の対象とするのみならず、上記抽出方法以外の方法で抽出されたＤＮＡ（又はＤＮＡを含む溶液）に対しても精製することが可能である。
ＣＴＡＢ及び塩を用いた精製は、ＣＴＡＢ及びいずれかの塩溶液を土壌ＤＮＡの抽出液と混合し（酸性側に緩衝能を持つ緩衝液で弱酸性側にし）、４５℃〜７０℃（例えば６０℃）でのインキュベート及びクロロホルムによる除タンパク操作を行うというものである。
ＣＴＡＢの濃度は１〜３％であり、２〜３％が好ましい。
一般に、ＤＮＡはアルカリ条件下のほうが土壌から抽出されやすいため、抽出液にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、リン酸緩衝液といった緩衝能の高いものが含まれており、抽出液はアルカリ性に維持される。従って、これらの緩衝能を打ち消した上でｐＨを弱酸性にする必要がある。そこで、塩は弱酸性側で緩衝能を有するものを使用することが好ましい。
「塩」とは、抽出液に１．０Ｍ以上の１価のカチオンを添加でき、かつｐＨを５．０〜６．５の弱酸性に調節できるような物質をいう。
このような塩として、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸アンモニウムがある。この場合、ＮａＣｌ、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸アンモニウムの濃度は０．７〜２．１Ｍである。そして、ＮａＣｌ、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウムについては１．０Ｍ以上が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸アンモニウムについては０．７Ｍ以上が好ましく、いずれの塩も１．０〜１．４Ｍであることがより好ましい。酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウムのｐＨは５．０〜６．０が好ましい。なお、１価のカチオンとはＮａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４ ＋などをいう。
但し、塩は上記物質に限定されるものではなく、抽出液に１．０Ｍ以上の１価カチオンを添加でき、ｐＨを５．０〜６．５に調製することが可能な塩はすべて本発明に含まれる。
本発明においては、抽出液へのＣＴＡＢ添加により、土壌ＤＮＡ溶液からＰＣＲが阻害されないレベルにまで腐植物質を除去することができる。そして、土壌ＤＮＡの沈殿に適した手法を検索し、上記開発した土壌ＤＮＡ抽出法と組み合わせて最適な精製条件を決定することができる。
本発明においては、ＣＴＡＢの濃度が２〜３％であり、かつ、塩の濃度が１．４Ｍであることがさらに好ましい。
（５−２）沈殿
ＤＮＡを溶液から分離回収する方法には、ＤＮＡを沈殿させる方法、カオトロピック効果によりシリカ表面に吸着させる方法、磁性ビーズなどで溶液から分離する方法などがある。この中で最もよく使われる方法はＤＮＡを沈殿させる方法であり、一定以上の濃度のエタノールや２−プロパノールの存在下でＤＮＡが沈殿することを利用している。エタノールは、７０％程度の濃度でＤＮＡが沈殿するため、抽出液の２〜２．５倍量のエタノールを添加する必要があり、マイクロチューブを用いたミニスケールでの抽出時には、エタノール沈殿に供試できる抽出液量が少なく効率が悪い。
それに対し２−プロパノールはエタノールよりもＤＮＡを沈殿させる作用が強く、抽出液の６／１０等量でＤＮＡの沈殿が得られるため、ミニスケールでのＤＮＡ抽出には最もよく使用されている。
本発明においては、ＤＮＡの回収は、上記の通り酸性側に緩衝能を持つ酢酸やリン酸緩衝液で弱酸性側にした後、土壌ＤＮＡの沈殿を行う。本発明において、沈殿は、（ｉ）上記抽出及び精製工程を経た後のサンプルを沈殿させる工程、並びに（ｉｉ）精製工程を経た後のサンプルを沈殿させる工程のいずれをも含むものである。
沈殿に使用される物質は、２−プロパノール、エタノール又はポリエチレングリコールが挙げられるが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましい。ＰＥＧの濃度は、１０〜１５％であり、１２％であることが好ましい（溶液中のＰＥＧ濃度：５〜７．５％）。その他、ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ）も使用される。ＰＥＧはシークエンス反応前に、ＰＣＲ産物からプライマーを取り除くのによく使用されている（Ｋｕｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．１９９０）。ＰＥＧ溶液は沈殿させる物質の選択性が高く、構造上ＤＮＡと非常によく似ているＲＮＡも沈殿しない。また同じＤＮＡであっても短鎖であるプライマーは沈殿せず、そのサイズにも選択性があることが示されている（Ｐａｉｔｈａｎｋｅｒ ＆ Ｐｒａｓａｄ １９９１、Ｌｉｓ １９８０、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ １９８９）。ＰＥＧは、他のアルコール類よりも夾雑物質を沈殿させることが少ないため、土壌やコンポストなど、夾雑物が混入しやすい試料からＤＮＡを抽出する研究によく使用されている（Ｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ １９８７、Ｐｏｒｔｅｏｕｓ ｅｔ ａｌ １９９７、Ｈｏｗｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２００３、ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ ｅｔ ａｌ ２００２）。
ところで、弱酸性条件下でＰＥＧ沈殿を行うと、完全に除去しきれなかった腐植物質又は夾雑物がＤＮＡとともに沈殿する可能性がある。
そこで本発明は、好ましくは以下の２つの手段のいずれかを採用することができる。
（ａ）ＣＴＡＢ精製後、クロロホルム等により除タンパクを行って回収した上清（いわゆる水層部分）とＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０以上）等とを混合し、ｐＨを再びアルカリ側（ｐＨ８．０〜８．６）に戻し、ＰＥＧを添加し、高速遠心してＤＮＡを回収する。
（ｂ）ＰＥＧ溶液の組成を改良する。すなわち、ＰＥＧ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを調製し（この溶液のｐＨは８．０〜８．６）、これによりＰＥＧによる沈殿を行う。但し、ＰＥＧと組み合わせる緩衝液は、ｐＨを上昇させることができる限り上記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに限定されるものではなく、リン酸緩衝液などその他の緩衝液も使用することができる。
（５−３）まとめ
（ｉ）ＣＴＡＢ精製（弱酸性側での精製）及びＰＥＧ沈殿（アルカリ側での沈殿）の組み合わせは、土壌ＤＮＡの精製に関してのみでも使用可能である。
（ｉｉ）ＣＴＡＢ精製の際にＮａＣｌ以外の緩衝能を持つ塩を用い、弱酸性側で精製処理を行うことも可能である。
（ｉｉｉ）抽出、精製、沈殿といった一連のプロトコールは、全てを実施しなくともそれぞれの工程をを独立で使用しても、土壌ＤＮＡを得ることができ、あるいは上記抽出方法以外の方法で抽出した土壌ＤＮＡの精製が可能である。
６．ＤＮＡの抽出、精製及び／又は回収用キット
本発明は、上記土壌ＤＮＡを抽出、精製、又は回収するためのキットを提供する。
環境サンプルからのＤＮＡ抽出用キットは、５％以下の界面活性剤、又は前記界面活性剤とｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ用ビーズとの組合せを含む。すなわち、本発明のＤＮＡ抽出用キットは、界面活性剤（ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００又はＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム）を基本構成とし、これにｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇに使用するビーズ、ＥＤＴＡ、リン酸緩衝液、アルカリ性緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等のＴｒｉｓ緩衝液）、ｐＨ調整剤等を含めることが可能である。本発明のＤＮＡ抽出用キットは、アルカリ性緩衝液によりｐＨを７．０以上に調整することが可能である。
本発明に使用する抽出液において、ＥＤＴＡの濃度は、５０ｍＭ〜１２００ｍＭの範囲から任意に選択することができる。また、リン酸緩衝液の濃度は、５０ｍＭ〜３０００ｍＭの範囲から任意に選択することができる。
また、ＤＮＡ抽出液は、使用する土壌に応じて適宜濃度設定ができるように、各濃度に段階的に区分けしておくことができる。例えば、ＳＤＳは０．１％から２．０％の範囲で数段階に調整されていてもよく、実験者が希望する濃度調整ができるように、高濃度のＳＤＳを１種類用意しておいて希釈液によって希釈できるようにしておくこともできる。ＥＤＴＡやリン酸緩衝液の場合も、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭのように段階的に濃度調整したものを含めておくことも、高濃度（例えば１Ｍ）のものを用意しておいて希釈液によって任意の濃度に希釈できるようにしておくこともできる。さらに、ユニバーサルな緩衝液組成として、４００ｍＭ ＥＤＴＡと７５０ｍＭリン酸緩衝液との組合せをキットに含めておくことも可能である。
さらに、本発明は、酸性側のｐＫａを有するｐＨ緩衝液を含む塩溶液、陽イオン界面活性剤、又は当該塩溶液と陽イオン界面活性剤との混合物を含む、環境サンプルからのＤＮＡ精製用キットを提供する。酸性側のｐＫａを有するｐＨ緩衝液としては、例えば酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩酸緩衝液又は硫酸緩衝液が挙げられる。このキットには、ＤＮＡ精製用の陽イオン界面活性剤（ＣＴＡＢ等）及び前記塩を含めておくことが可能である。上記酸性側のｐＫａを有するｐＨ緩衝液を塩と混合して使用することにより、精製時のｐＨを７．０未満に調整することが可能である。
さらに、本発明は、アルカリ性緩衝液（例えばＴｒｉｓ緩衝液）を含む、環境サンプルからのＤＮＡ回収用キットを提供する。このキットには、沈殿に使用するための２−プロパノール、エタノール又はＰＥＧなどを含めておくこともできる。上記緩衝液により、回収時のＤＮＡ溶液のｐＨは７．０以上に調整することが可能である。
さらに、本発明は、上記ＤＮＡ抽出用キット、ＤＮＡ精製用キット、ＤＮＡ回収用キットから適宜２組以上を選択し、本発明のＤＮＡ抽出と精製、ＤＮＡ抽出と回収、ＤＮＡ精製と回収、あるいはＤＮＡ抽出、精製及び回収を行うためのキットセットをも提供する。このようなＤＮＡ抽出、精製及び回収の２つ以上の組合せを、本発明においてはＤＮＡの取得という。従って、各キットの組合せを用いることにより、ＤＮＡ取得（抽出、精製、回収、又はこれらの組合せ）を行うことができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本発明において詳細な濃度範囲は実施例に記載するが、当該濃度範囲は例示であって、本発明の目的を逸脱しない限り何ら限定されるものではない。
界面活性剤の使用条件の検討
本実施例は、代表的な界面活性剤および塩化ベンジルを用いて、さらに細胞破壊の処理として加熱およびｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇによる２種類の処理によるＤＮＡ抽出実験を行い、土壌からのＤＮＡ抽出に最も適した界面活性剤とその使用条件の検討を行ったものである。
（１）材料と方法
抽出試験には、東京大学農学部構内弥生圃場に設置された土壌圏科学研究室農薬連用圃場の堆肥区の土壌、埼玉県農業試験場の水田転換畑土壌（かつて長野の水田土壌であった土壌を客土として移入したもの、以下鴻巣水田土壌と表記する）、および東北大学附属農場（川渡）の森林土壌の３種類を用いた。それぞれアロフェン質黒ボク土、灰色低地土、非アロフェン質黒ボク土であり、互いに理化学性が大きく異なる（表１）。
Figure 0004665124
各土壌の理化学性の測定は、ｐＨ（Ｈ２Ｏ）およびｐＨ（ＫＣｌ）はそれぞれ１：５水および１Ｎ ＫＣｌ抽出法により、全窒素および全炭素はＮ／Ｃアナライザーにより、酸性シュウ酸塩およびピロリン酸抽出Ａｌ、Ｆｅは土壌環境分析法（土壌環境分析法編集委員会編 １９９７）およびＢｌａｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）の方法により行った。本研究全体を通じて使用した土壌はすべて、サンプリング後すぐに実験に使用しない場合は４℃の低温室において湿潤状態で保存し、使用する際には２ｍｍのふるいを通し、最大容水量の７０％に水分含量を調製し、２週間程度室温でプレインキュベーションしたものを供試土壌とした。
これらの土壌０．５ｇに２％ＳＤＳ抽出液、２％ＣＴＡＢ／１．４Ｍ ＮａＣｌ抽出液、８Ｍグアニジンチオシアネート抽出液、２％ＳＤＳおよび塩化ベンジル抽出液、２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００抽出液の５種類の抽出液を１．２ｍｌずつ添加し、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理（強度５ｍ／ｓｅｃで３０秒間処理）もしくは６５℃１時間の加熱処理を行った。その後１２０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収して等量のクロロホルムを添加、よく攪拌し、再び遠心することにより、除タンパクを行った。７００μｌの水層を回収し、これに１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し６／１０量の２−ｐｒｏｐａｎｏｌを加え２００００×ｇで遠心し、ＤＮＡを沈殿させた。遠心後７０％エタノールによりＤＮＡ沈殿を洗浄し、乾燥後１００μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶かし、これを抽出ＤＮＡとした。
抽出した土壌ＤＮＡ溶液精製操作を施していないため、腐植物質が相当量混入していた。このままでは吸光度などによってＤＮＡ量を測定することができなかった。そこで腐植物質の影響がない状態でＤＮＡを定量するため、抽出ＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、低分子のため移動距離の長い腐植物質をＤＮＡから十分に分離したのち、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ＴＡＥ緩衝液による１００００倍希釈液）で染色し、ＤＮＡのバンド部分の輝度を測定した。ＤＮＡの輝度とＤＮＡ量の相関を示す検量線を作成するため、それぞれのゲルには、λＨｉｎｄ ＩＩＩ Ｄｉｇｅｓｔを標準試料として１０ｎｇ〜５０ｎｇまで１０ｎｇ間隔で５点、試料とともに泳動し検量線を作成した。なお、２０００ｂｐ以上のサイズのＤＮＡを定量対象とした。測定機器はフルオロ・イメージアナライザー Ｆｌａ−５０００（富士写真フイルム株式会社）を使用し、輝度を数値化するための画像処理にはＩｍａｇｅＧａｕｇｅ ４．０（富士写真フイルム株式会社）を用いた。アガロースゲルにおける定量例を図１に示す。
なお、各界面活性剤の、緩衝液組成、および物理的諸条件を表２に示す。
Figure 0004665124
また、本試験を含め後述する全ての実験でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理は、表３に示す条件にて行った。
Figure 0004665124
このｂｅａｄｓ組成はＢ▲ｕ▼ｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）の知見を参考に調製したものである。なお実験はすべて３連で行った。
（２）結果と考察
土壌ＤＮＡの抽出量についての結果を図２に示す。加熱処理およびｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理に関わらずＳＤＳとＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を使用した時が土壌ＤＮＡの抽出効率がよく、また界面活性剤が原因と思われるＤＮＡの低分子化はみられなかった。ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理とＳＤＳとの組み合わせは、その他の組み合わせより抽出量が多く、弥生圃場堆肥連用区土壌については、１ｇあたりの土壌から３０μｇ近いＤＮＡを抽出することが可能であった。
ＣＴＡＢおよびグアジニンチオシアネートでは、土壌試料から十分な量のＤＮＡを抽出することができなかったが、抽出液はほぼ無色に近く、土壌からの腐植物質の抽出を妨げる効果が非常に強いことが明らかとなった。
ベンジルクロライド法で抽出したものについては、かなりの量のＤＮＡが電気泳動によって確認されたが、抽出ＤＮＡの低分子化が著しかった。すなわち、加熱により抽出したものでは８０００ｂｐ以下に、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇしたものではその大部分が２０００ｂｐ以下のサイズになっており、塩化ベンジルはＤＮＡの断片化を容易に引き起こすことが判明した。なお、図２には２０００ｂｐ以上のサイズのＤＮＡのみについて定量した結果を示したため、ベンジルクロライド法の収量は極めて小さく表れている。
加熱処理とｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理を比較すると、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理は極めて短時間で抽出を行うことができ、またＤＮＡの収量も加熱処理と比較して多かった。また加熱処理は、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理よりも多くの腐植物質が抽出されてしまい、この腐植物質の除去が困難であると推測された。泳動ゲルから推定されるＤＮＡのサイズは、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理により得られたものは２０ｋｂｐ程度の大きさのものを主体に２０ｋｂｐ〜７ｋｂｐの範囲に若干低分子化していた。一方、加熱処理で得られたＤＮＡは２３ｋｂｐ以上のサイズで低分子化はほとんどみられなかった。
以上の結果より、今後の実験では、抽出効率が高いＳＤＳを界面活性剤として使用することとし、細胞破壊の過程としては操作が短時間でかつ収量も高かったｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理を採用することとした。
ＳＤＳの最適濃度の決定
実施例２では、実施例１の結果を踏まえ、土壌ＤＮＡの抽出液に用いるＳＤＳの最適濃度を検討した。
（１）材料と方法
実験１
弥生圃場堆肥区土壌を対象に、ＳＤＳ濃度に０％から２％までの段階を設け、土壌ＤＮＡ抽出に最適なＳＤＳ濃度の条件を検討した。ＳＤＳ濃度以外の実験条件は抽出液が１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）とし、それ以外は、（ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇの条件が）実施例１と同様である。実験はすべて３連で行った。
実験２
抽出液の組成を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ３００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）とし、それ以外は実施例１と同様の条件を用いて、ＳＤＳ濃度に０％から２％までの段階を設け、土壌ＤＮＡ抽出に最適なＳＤＳ濃度を検討した。ＥＤＴＡ濃度に関する詳細は後述する。実験には表４に示した６種類の土壌を供試土壌とした。
Figure 0004665124
これらのうち弥生圃場堆肥連用区土壌および栃木農試 森林土壌、東北大学森林土壌は火山灰土壌で、大阪農試 畑土壌および兵庫農試 畑土壌、埼玉農試畑土壌は非火山灰土壌（沖積土壌）である。また実験は３連で行った。
（２）結果と考察
実験１の結果を図３に、実験２の結果を図４に示す。１００ｍＭ ＥＤＴＡおよび３００ｍＭ ＥＤＴＡの場合もＳＤＳ濃度が０％から０．５ずつ増加するのにしたがって土壌ＤＮＡの抽出量は増加し、０．５％より高濃度のＳＤＳ濃度においても０．５％の場合と比較して抽出量に有意な差は認められなかった。よって本試験条件下で最大量の土壌ＤＮＡを抽出するためには、０．５％のＳＤＳ濃度が必要であることが示された。但し、ＳＤＳ濃度の増加に伴って腐植物質の抽出量も増加もみられ（抽出液の着色程度の目視観察に基づく推定）、さらに、抽出液が泡立ち、試料の扱いが困難になるといった問題も生じるため、ＳＤＳ濃度０．５〜１％にとどめておくのが良い。
抽出液のｐＨの検討
本実施例では、抽出液の適切なｐＨおよび緩衝能を検討した。
（１）材料と方法
使用した土壌は弥生圃場堆肥連用区土壌および埼玉農試畑土壌の２点である。理化学性は表５に示した。
Figure 0004665124
抽出液はＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝系の抽出液を用いた。抽出液のｐＨを９．０、８．０、７．０、６．０の４段階に設定した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ ＥＤＴＡ／１％ＳＤＳから成る抽出液１．２ｍｌを土壌０．５ｇに添加し、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理によりＤＮＡを抽出し、除タンパク後ＤＮＡの沈殿回収および定量を行った。
（２）結果と考察
結果を図５に示す。いずれの土壌からのＤＮＡ抽出についても、試験したｐＨの範囲内ではアルカリ性の強い抽出液ほど高収量であった。ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理直後の粗抽出液のｐＨを測るといずれの土壌も土壌の酸度によりｐＨが低下していることが明らかになった。抽出時のｐＨの低下はＤＮＡの化学的安定性を損なうだけではなく、土壌ＤＮＡの収量が低下するためアルカリ性に維持される必要があることがわかった。このような理由で低濃度の緩衝系では土壌の酸度を考慮した緩衝能を持つ抽出液を使用する必要があると考えられた。
しかし、ｐＨ８．３の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液および０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液を混合して抽出液を調整するとｐＨは８．６に上昇し安定していること、また、後述の実施例（実施例８）では高濃度のＥＤＴＡとリン酸緩衝液を使用することになったので、これらがあわせもつ緩衝能により抽出後の溶液のｐＨはほとんど抽出前の抽出液と変わらないことが確認できている。従って高濃度のＥＤＴＡ、リン酸緩衝液を使用する抽出液においては、抽出前後の溶液のｐＨは８．６でほぼ一定であり、抽出時のｐＨ変化は考慮しなくとも良いと考えた。
土壌によるＤＮＡ吸着の解消
本実施例では抽出液のＥＤＴＡ濃度がＤＮＡ収量および金属イオン抽出量に与える影響について検討した。
（１）材料と方法
土壌ＤＮＡ抽出の基本的な条件は実施例１と同様とし、抽出液のＥＤＴＡ濃度のみを０、１０、２０、３０、５０、１００、２００、３００、４００ｍＭの９段階に設定し、供試土壌として弥生圃場堆肥連用区土壌、栃木農試森林土壌、東北大学森林土壌、埼玉農試畑土壌、大阪農試畑土壌、兵庫農試畑土壌の６種類の土壌を用いた。その理化学性を表６に示す。
Figure 0004665124
土壌ＤＮＡの抽出量およびＤＮＡ粗抽出液（ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ後遠心した上清）中に溶存していたＡｌ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｍｇの濃度を分析した。これらの金属元素は土壌中において主要なものであり、土壌によるＤＮＡ吸着の原因となり得る元素であると考えられた。土壌ＤＮＡの抽出量は実施例１と同様の方法で定量し、金属元素は適宜希釈後ＩＣＰ発光分析（Ｓｅｉｋｏ ＳＰＳ−１２００）により定量した。実験は３連で行った。
（２）結果と考察
ＥＤＴＡ濃度が土壌抽出ＤＮＡに与える影響について、図６にアガロースゲル電気泳動後染色したＤＮＡの写真の一例を、図７に土壌ＤＮＡ抽出量を定量した結果を示す。また、粗抽出ＤＮＡ液中の金属元素の定量結果を図８Ａ〜Ｃに示す。ＥＤＴＡによりキレートされ抽出されたと考えられる金属元素はＥＤＴＡ−金属元素複合体になっていると考えられる。ＥＤＴＡの総量に対するＥＤＴＡ−金属元素複合体形成率、すなわち実際のＥＤＴＡが使われた割合を、４種類の元素それぞれの複合体形成率および４種類の元素をあわせたＥＤＴＡ金属元素複合体形成率について求めた。これを図９Ａ〜Ｃに示す。
（２−１）火山灰土壌について
火山灰土壌においては、３種類の土壌すべてにおいて抽出液中のＥＤＴＡ濃度の上昇に伴いＤＮＡの抽出量も増加した。特に栃木農試森林土壌においては、ＥＤＴＡ濃度が１００ｍＭ以上でないとＤＮＡが全く抽出されず、さらに３００ｍＭ以上とすることで高分子のＤＮＡがより多く得られた。前述のように、ＤＮＡが土壌に吸着する主な原因であると推定されるリン酸基は、ＤＮＡの構成単位であるヌクレオチドごとに存在しており、長いＤＮＡ分子のリン酸基の一部が土壌粒子に吸着されてしまうことで、ＤＮＡが溶液中に放出されなくなると考えられる。このように考えると、高分子のＤＮＡほどリン酸基を多く持つことになるので、土壌粒子に強固に吸着する能性が高くなることが推測される。アガロースゲルの電気泳動結果より、弥生圃場堆肥連用土壌や栃木農試森林土壌においてＥＤＴＡ濃度が低いと低分子のＤＮＡしか抽出できておらず、高濃度のＥＤＴＡにより初めて高分子のＤＮＡが抽出され始めている。火山灰土壌から高分子ＤＮＡを抽出するためには高濃度のＥＤＴＡ溶液を使用する必要があることが明らかとなった。
高濃度のＥＤＴＡは土壌から大量の金属元素を溶出した。弥生圃場堆肥連用区土壌からは比較的低濃度のＥＤＴＡによってもＤＮＡが抽出されている。弥生圃場堆肥連用区土壌から抽出された金属元素はほとんどがＣａであり、Ａｌは少ない。弥生圃場は火山灰土壌でありながら長期の堆肥連用によりＣａが土壌に集積し、土壌中に含まれる金属元素組成が大きな影響を受けたことが窺い知れる。栃木農試の森林土壌や東北大学森林土壌のように大量の非晶質アルミニウムを含有している土壌では、十分量のＥＤＴＡによりＤＮＡを吸着する土壌の非晶質Ａｌが除去されなければ、土壌ＤＮＡは多くは抽出されない。
栃木農試森林土壌および東北大学森林土壌については、Ａｌ以外の金属、すなわちＦｅ、Ｃａ、Ｍｇは、ＥＤＴＡ濃度が５０ｍＭ以下の濃度において既に最大抽出量が得られており、５０ｍＭ以上にＥＤＴＡ濃度を設定してもそれらの抽出量の増加はほとんど見られなかった。しかし、ＡｌはＥＤＴＡ濃度の影響を顕著に受け、ＥＤＴＡ濃度が１００ｍＭに達するまでは高い錯体形成率で、ＥＤＴＡ濃度に対応してＡｌが土壌から溶出している。また１００ｍＭ以上の濃度でも緩やかにＡｌの溶出量は増加している。東北大学森林土壌においてはＥＤＴＡ濃度が５０ｍＭで、栃木農試森林土壌においてはＥＤＴＡが１００ｍＭの濃度で土壌ＤＮＡが抽出されはじめ、それ以上では、ＥＤＴＡ濃度に比例しＤＮＡ抽出量が増加している。土壌によるＤＮＡの吸着は土壌の非晶質Ａｌが原因であり、ＥＤＴＡによりＤＮＡを吸着するＡｌ量が除去されて初めて抽出できることが窺いしれる。これらのことから、従来の手法で火山灰土壌からＤＮＡが抽出できなかった一因は、ＥＤＴＡ可溶の非晶質ＡｌによるＤＮＡの吸着であると考えられた。
（２−２）非火山灰土壌について
非火山灰土壌においては、ＥＤＴＡ濃度が５０ｍＭ以下でも土壌ＤＮＡが抽出された。３種類の土壌いずれについてもＥＤＴＡ濃度が１００〜２００ｍＭ程度で収量が最大となっており、それ以上の濃度では逆にＤＮＡ収量が低下した。非火山灰土壌からの金属イオンの抽出量を見るとその大部分がＣａである。これらの土壌において、ＥＤＴＡで抽出されると考えられるＣａが全量抽出できていない５０ｍＭ以下の低濃度のＥＤＴＡであっても、すなわちＣａが土壌から十分に除去できていない状態でもＤＮＡの収量が十分得られていることから（図７、図８Ａ参照）、土壌中に含まれているＣａはＤＮＡを抽出に影響を及ぼす程度の吸着をしないことが示される。また埼玉農試は火山灰土壌が多少混入しており、大阪農試畑土壌、兵庫農試畑土壌と比較するとＡｌの溶出量は多いが、火山灰土壌と比較すると、非火山灰土壌からのＡｌの溶出量はＥＤＴＡ濃度を高くしてもＡｌの溶出量にはほとんど差が見られなかった。
（２−３）ＥＤＴＡ−金属元素複合体形成率について
図８Ｂより、火山灰土壌、非火山灰土壌ともに１０〜２０ｍＭ程度の低濃度の状態では、ＥＤＴＡは、そのほとんどが今回分析した４種類の金属元素と錯体を形成していることが明らかとなった。濃度が上昇するにつれ、金属元素の種類によらず錯体の形成率は減少し、ＥＤＴＡ濃度が３００〜４００ｍＭと高濃度になると、土壌の種類によらずＥＤＴＡ−金属元素複合体形成率は約２０％でほぼ一定になっていた。これはＥＤＴＡの金属元素とのキレート反応の平衡がＥＤＴＡの濃度および土壌の金属元素組成によらず、高濃度では一定の錯体形成率に達しているためと考えられた。つまり１０〜２０ｍＭ程度の低濃度のＥＤＴＡは１００％の割合で金属元素とキレートし、３００〜４００ｍＭと高濃度な状態ではＥＤＴＡはその約２０％が金属元素をキレートすると考えられる。このことより高濃度ＥＤＴＡを抽出の最初の段階から使用しなくとも、低濃度のＥＤＴＡ溶液で抽出を繰り返す、もしくは土壌に対し抽出液の比を大きくすることにより、土壌ＤＮＡを抽出できる可能性が考えられた。
（２−４）高濃度ＥＤＴＡに関する留意点について
ＥＤＴＡ使用時に留意すべき点として、ＥＤＴＡが４００ｍＭ以上になるとＤＮＡの低分子化が引き起こされたことがあげられる。ｐＨが８．３程度の溶液では、ＥＤＴＡ１分子あたりカウンターイオンとしておよそ３分子のナトリウムイオンが存在している。４００ｍＭのＥＤＴＡ溶液はイオン強度にして１．２Ｍ ＮａＣｌ溶液に相当する高濃度の塩溶液である。よってこの大量に含まれるナトリウムイオンのためにＤＮＡが電気的に中和されてしまい、この影響でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理の際、せん断されやすくなっているのではないかと考えられた。またＥＤＴＡ濃度が３００ｍＭ以上の場合、高濃度の塩により常温ではＳＤＳが白い結晶として析出するため、使用時は４０℃程度に溶液を加熱して溶解させる必要があった。沖積土壌においてはＥＤＴＡ濃度が２００ｍＭ以上の高濃度になると火山灰土壌の場合とは逆にＤＮＡの抽出量が低下した。これは高濃度ＥＤＴＡ溶液の高塩濃度により、界面活性剤であるＳＤＳがミセル化、もしくは析出してしまったために土壌微生物の溶菌率が下がってしまったことに起因するものであると考えられた。
以上のことからｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理を行う際、ＥＤＴＡの最大使用濃度は３００ｍＭとし、この濃度を越えるとＤＮＡは低分子化することを前提に実験をする必要があると考えられた。
抽出回数が土壌ＤＮＡ抽出量に与える影響
ＥＤＴＡはほとんどの金属イオンに対して優れたキレート安定定数を持つ化合物である（株式会社同仁化学研究所カタログ２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。これは極めて低濃度であっても、大部分のＥＤＴＡが対象金属イオンと錯体を形成することを意味する。今回検討したｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理を利用するＤＮＡ抽出においては、土壌０．５ｇに対し抽出液量は１．０ｍｌである。抽出を繰り返したり土壌に対する抽出液量の比が大きくすることで、低濃度のＥＤＴＡ溶液であっても、今回対象としている土壌の非晶質Ａｌを除去できる可能性がある。本実施例ではＥＤＴＡの絶対量が重要なのか、もしくは濃度が重要なのかを明らかにするため、ＥＤＴＡ濃度を数段階設定し、同じ土壌から数回ＤＮＡの抽出を繰り返し行った場合のＤＮＡの合計収量を検討した。
（１）材料と方法
供試土壌は弥生圃場堆肥連用区土壌、栃木農試森林土壌、東北大学森林土壌の３種類の土壌を用いた。基本的な抽出液組成は前項と同じでＴｒｉｓ−ＨＣｌ １００ｍＭ、ＳＤＳ１％を用い、ＥＤＴＡ濃度を０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭと５段階に設定した抽出液を用いた。ｂｅａｄｓ１ｇを含むスクリューキャップ付チューブに土壌０．５ｇを分注し、１．０ｍｌの抽出液を添加後ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理を強度５ｍ／ｓｅｃで３０秒間行った。その後１２０００×ｇで５分間遠心後、上清５００μｌを回収した。上清を回収した残りの土壌に再び１回目の抽出と同じ濃度のＥＤＴＡ抽出液を５００μｌ添加し、攪拌のためにｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理を強度４ｍ／ｓｅｅで５秒間行い、再び遠心し、上清を回収した。この作業を５回繰り返した。回収した上清５００μｌのうち２０μｌを希釈後ＩＣＰ発光分析による金属イオンの定量に供し、残りの４８０μｌにはクロロホルムを用いて除タンパク処理し、最終的に４００μｌを回収した。これに終濃度０．３Ｍになるように５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を添加し、６／１０量の２−ｐｒｏｐａｎｏｌを用いてＤＮＡを回収した。ＤＮＡの定量は２−２−１と同様にして行った。実験は３連で行った。
繰り返し抽出の段階ごとに再添加した抽出液により、新たに得られたと考えられる土壌ＤＮＡ量、溶出金属元素量は、上記の操作にしたがって以下の計算式で記述される。ただし、ｎ回目のＤＮＡまたは金属元素の抽出量をＸｎ（土壌１ｇあたりのＤＮＡまたは金属元素の収量に換算した値、単位はμｇ／ｇ ｓｏｉｌ）とする。
２回目の抽出により新たに得られた量＝Ｘ２−Ｘ１×１／２
３回目の抽出により新たに得られた量＝Ｘ３−Ｘ２×１／２−Ｘ１×１／４
４回目の抽出により新たに得られた量＝Ｘ４−Ｘ３×１／２−Ｘ２×１／４−Ｘ１×１／８
５回目の抽出により新たに得られた量＝Ｘ５−Ｘ４×１／２−Ｘ３×１／４−Ｘ２×１／８−Ｘ１×１／１６
なお実験はすべて３連で行った。
（２）結果と考察
異なる濃度のＥＤＴＡ抽出液を用いた繰り返し抽出によって得られた土壌ＤＮＡの段階ごとの収量（１ｇあたりの土壌からの収量に換算した）および土壌から５回抽出した土壌ＤＮＡの合計収量を図１０Ａ〜Ｃに示す。繰り返し抽出の際に、追加して添加したＥＤＴＡにより抽出されたと考えられる土壌ＤＮＡ量（前述の計算に従った値；計算例を図１１にあげる）を図１２に示す。また追加して添加したＥＤＴＡのキレート形成により抽出されたと考えられる金属元素量について図１３Ａ〜Ｂに示す。
５回抽出し得られた土壌ＤＮＡ量は、３種類すべての土壌において３００ｍＭ ＥＤＴＡを含む抽出液によるものが最も多かった（図１０Ａ〜Ｃ）。最もＤＮＡ収量の良かった３００ｍＭのＥＤＴＡを含む抽出液による繰り返し抽出では、２回目以降の土壌ＤＮＡの抽出量はほぼ変わらなかった（図１２）。３００ｍＭのＥＤＴＡを用いた抽出では、土壌ＤＮＡは１回目の抽出でほぼ全量抽出されたと思われ、２回目以降にＥＤＴＡ溶液を新たに添加して抽出しても、１回目の抽出時に回収しきれなかった溶液（遠心後の土壌およびビーズの間隙に含まれていた部分）を少しずつ回収して抽出量が増えているだけであり、土壌に吸着されたＤＮＡを剥離して回収しているものではないと思われた。
栃木農試森林土壌からは１００ｍＭ以下のＥＤＴＡを含む抽出液で繰り返し抽出すると２回目以降に１回目に得られた土壌ＤＮＡ量の２倍近い量の土壌ＤＮＡが得られた。これについては２回目に添加されたＥＤＴＡが土壌からＡｌを除去することにより吸着されていたＤＮＡが回収できたものと考えられる。また東北大学森林土壌においても１００ｍＭ以下の濃度の抽出液で、２回目に１回目の抽出量の約３分の１程度が新たに得られており、これも２回目に添加したＥＤＴＡによりＡｌが除去されＤＮＡが回収できたものであると考えられた。
土壌抽出に用いたＥＤＴＡの絶対量が同じ場合で比較すると、例えばＥＤＴＡの絶対量が土壌０．５ｇに対し３００μｍｏｌとした場合、すなわち３００ｍＭ ＥＤＴＡ抽出液による１回目の抽出量と２００ｍＭのＥＤＴＡの１回目と２回目の抽出合計量の比較では、弥生圃場堆肥連用区土壌および東北大学森林土壌においてはほぼ同じ量の土壌ＤＮＡが得られている。これはＥＤＴＡの絶対量が２００ｎｍｏｌ、１００ｎｍｏｌの場合でも同様であった。しかし、栃木農試森林土壌においてはこの計算はあてはまらず、ＥＤＴＡが絶対量で同じであっても抽出ＤＮＡ量には大きな差が生じた。すなわち同じＥＤＴＡ量であっても１回目に高濃度で抽出した方が抽出量は多く、繰り返し抽出しても高濃度で１度に抽出したＤＮＡ量に及ばなかった。
これらの結果より弥生圃場堆肥連用区土壌および東北大学森林土壌はＤＮＡを吸着する非晶質Ａｌの作用が比較的弱く、５０ｍＭ程度の比較的低濃度のＥＤＴＡ溶液で土壌ＤＮＡの一定の量が抽出され、それ以上のＥＤＴＡにより土壌へ吸着されていたＤＮＡを回収していて、ＥＤＴＡ量に対応した土壌ＤＮＡをほぼ安定して回収できることが明らかとなった。しかし、栃木農試森林土壌においては非晶質Ａｌの作用が強く、ＤＮＡの抽出には２００ｍＭ以上のＥＤＴＡが必要であり、一度土壌に吸着されたＤＮＡを再び解離させ回収するのは困難であると考えられた。
（３）金属元素の抽出量
弥生圃場堆肥区土壌からは、他の２種類の火山灰土壌と異なり、吸着の原因となるＡｌがほとんど抽出されなかった。弥生圃場堆肥連用区土壌は長年の堆肥連用によりＣａが大量に土壌に集積し、堆肥を連用していない対照区と比較すると土壌中のＡｌ量が少なく、土壌がＣａの影響を強く受けていると考えられた。またこの土壌のもう一つの特徴は非晶質のＳｉが多いことがあげられ、非晶質Ａｌの大部分がこのＳｉとアルミノシリケート（またはケイ素比が高いアロフェン）を形成している可能性が考えられた。この土壌ではＡｌは大部分が負電荷をもつＳｉと複合体を形成しているため、土壌ＤＮＡの吸着作用が小さいものと考えられた。
東北大学森林土壌からはＡｌが多量に抽出された。この土壌は、非アロフェン質黒ボク土壌という火山灰土壌の中でも特殊な土壌であり、ピロリン酸抽出Ａｌ（すなわち腐植−Ａｌ複合体の形態をとるもの）が多く、アロフェン含量が低いことがあげられる。腐植−Ａｌ複合体になっているＡｌが、土壌中の非晶質Ａｌ全体の約半分の量に達しており、腐植物質と錯体を形成しているＡｌが多い。この東北大学森林土壌は非晶質アルミ成分が非常に多いのにもかかわらず、５０ｍＭという比較的低濃度のＥＤＴＡを含む抽出液でもＤＮＡが抽出することが可能であった。この土壌からはＥＤＴＡにより高効率で土壌からＡｌが除去されていることが示唆される。よってＤＮＡ抽出時のＥＤＴＡは、ピロリン酸抽出の際のピロリン酸とほぼ同じ作用を土壌にもたらしていると考えられる。
栃木森林土壌もピロリン酸抽出Ａｌが多い土壌であるが、アロフェンも多く含んでいる。前述したように、この土壌では繰り返し抽出を行ってもＤＮＡ収量は増加せず、２回目以降に新しく添加したＥＤＴＡがほとんどＤＮＡの吸着解消には作用していない可能性が考えられる。しかし、東北大学森林土壌の場合と同じく、Ａｌは２回目以降に添加された土壌より新たにＥＤＴＡにより除去されている。ＥＤＴＡでさらに土壌からＡｌを除去してもＤＮＡ収量が上がらないという栃木農試森林土壌で見られた現象により、土壌によりＤＮＡを吸着する非晶質Ａｌの主要な形態が複数存在していること、土壌によってはＥＤＴＡが除去する非晶質Ａｌの形態がその土壌においてＤＮＡを吸着する形態のＡｌとは異なる可能性があることが推測される。
また３種類の土壌ともにＣａとＭｇについてはＥＤＴＡ濃度によらず１回目の抽出でほぼ全量が溶液中に抽出されており、２回目以降に新しく添加されたＥＤＴＡにより新たに抽出されたＣａ、Ｍｇはほとんどなかった。これより、Ｃａ、Ｍｇは低濃度のＥＤＴＡであっても容易に土壌から除去することが可能で、土壌ＤＮＡの吸着にはあまり関与していないことが確認された。
以上のことから、ＥＤＴＡを３００ｍＭという高濃度での使用することが、火山灰土壌からの土壌ＤＮＡの抽出には効果的であり、土壌の種類によっては１回目の抽出に高濃度のＥＤＴＡを使用するか否かで、ＤＮＡ合計収量が左右されることが明らかになった。これは、いったん吸着したＤＮＡを放出しにくい土壌が存在することを意味する。
また、繰り返し抽出により吸着の原因となるＡｌが除去されるにしたがってＤＮＡが徐々に抽出され続ける土壌（東北大学森林土壌）と、Ａｌが除去されてもＤＮＡ抽出量が増えない土壌（栃木農試森林土壌）が存在する。東北大学森林土壌は非アロフェン質黒ボク土で、非晶質Ａｌの大部分が腐植−Ａｌ複合体であり、アロフェン質黒ボク度と比較するとアロフェン含量は少ない。それゆえ土壌ＤＮＡを吸着するＡｌの中には、腐植−Ａｌ複合体のＡｌの他に、アロフェン態のＡｌが存在しており、ＥＤＴＡが主にＤＮＡの吸着を解消するのは、主に腐植−Ａｌ複合体のＡｌであることが推測された。
高濃度ＥＤＴＡでもＤＮＡが抽出されない土壌からのＤＮＡ抽出
これまでの結果から、従来の抽出法で火山灰土壌からのＤＮＡ抽出が困難であった最大の原因は、土壌によるＤＮＡの吸着であったことが強く示唆された。
そこで、ＤＮＡの吸着を解消するＥＤＴＡの最適濃度をさらに検討するため、ＤＮＡの吸着力が強いと考えられる土壌を対象とし、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ後に高濃度ＥＤＴＡを再添加し、高濃度ＥＤＴＡと加熱処理の併用により、土壌に吸着されたＤＮＡを回収する方法および条件を検討した。
（１）材料と方法
試験には弥生圃場対照区土壌を用いた。検討した点は次の３点である。はじめの抽出液のＥＤＴＡ濃度（ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ時の抽出液）、ＤＮＡ回収液のＥＤＴＡ濃度（再添加するＥＤＴＡ溶液）、回収液添加後の処理（攪拌もしくは加熱処理）である。処理内容と抽出液及び回収液との組み合わせを表７に示す。
Figure 0004665124
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１％ＳＤＳ（ｐＨ８．３）および異なる濃度のＥＤＴＡから成る抽出液１．２ｍｌでｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇを行い、微生物細胞を破壊し、その後いったん遠心して上清６００μｌを回収した後に、さらに濃度の高いＥＤＴＡを含む回収液６００μｌを添加し攪拌のみを行う、もしくは攪拌後６０℃で１時間加熱処理を加えた。その後遠心し、先ほど回収した上清とあわせて除タンパク処理後ＤＮＡを回収、定量した。
（２）結果と考察
結果を図１４に示す。回収液添加後の操作によってＤＮＡ収量に顕著な差が生じた。攪拌のみの処理と比較すると、加熱処理をしたものではより多くの土壌ＤＮＡを抽出することが可能となった。これはＥＤＴＡと土壌との反応、すなわちＤＮＡを吸着している非晶質ＡｌをＥＤＴＡがキレートして奪い取り、ＤＮＡを解離させる反応が温度により加速されることを示唆している。またＥＤＴＡ濃度も高いほどＤＮＡ抽出効果が高いという結果が得られた。今回の実験では、使用したＥＤＴＡの最高濃度において土壌ＤＮＡが最も多く得られているので、さらに多くのＤＮＡが土壌中に吸着されている可能性もあり、土壌中のＤＮＡの総量を知ることはできなかった。しかし、ＥＤＴＡの溶解度は通常の条件では最高１．５Ｍ程度であるので、土壌に添加し、吸着されたＤＮＡを回収する場合、スモールスケールの抽出では最終濃度で１Ｍ以上の濃度で土壌を処理することは極めて難しいと考えられ、ＥＤＴＡ濃度をあげるよりもむしろ反応時間を長くするほうが土壌ＤＮＡの抽出効率を上げることにとっては有効であるように思われる。というのもＥＤＴＡはＡｌと１：１錯体を形成する。１０００ｍＭのＥＤＴＡ溶液１ｍｌは、１００％反応すると仮定して計算すると、１ｍｍｏｌすなわち２７ｍｇのＡｌをキレートすることができる。一方、極めて非晶質成分の多い火山灰土壌１ｇ（乾土）で非晶質のＡｌはおおよそ１００ｍｇである。このことを考慮すると、０．５ｇの土壌（湿潤土）には最高で４０ｍｇ程度の非晶質Ａｌが含まれることになり、１Ｍ ＥＤＴＡ溶液１ｍｌを回収液として使用すると、ほとんど全ての非晶質Ａｌを溶解させられるＥＤＴＡを使用していることになるからである。
先にも述べたように、３００〜４００ｍＭの濃度でＥＤＴＡを使用しても、加熱をしない状態ではその１５〜２０％程度しか土壌中の金属元素と錯体を形成していない。また抽出回数を増やして土壌の非晶質Ａｌの除去量を定量した実験により、ＥＤＴＡは火山灰土壌のおもに腐植−Ａｌ複合体のＡｌを除去していることが推測できている。高濃度のＥＤＴＡ溶液を添加し加熱処理を加えることにより腐植−Ａｌ複合体のＡｌに加えアロフェンを初めとするその他の形態の非晶質Ａｌとも錯体形成反応が進み、土壌からのＡｌの除去率が高くなり土壌ＤＮＡが抽出できたと推測された。
しかし、反応時間を長くすると、短時間で抽出可能なｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理の利点を生かすことができない。また、最初の抽出処理で遠心と上清回収を行った後に、再び回収用緩衝液を加えてインキュベーションを行う作業は煩雑であること、さらに、溶液はＳＤＳを含むためしばしば泡立ち、手作業を繰り返すことによって、手や実験機具に付着した試料が他の試料に混入する危険性が高まる。さらに、高濃度のＥＤＴＡ添加および加熱処理は大量の腐植物質の溶出をも引き起こした。
腐植物質はＤＮＡの土壌への吸着と同じ原理により、土壌中で非晶質Ａｌと錯体を形成して安定化していると考えられる。腐植をはじめとする土壌有機物を保持していた非晶質ＡｌをＥＤＴＡが加熱処理中に徐々に取り除くため、団粒や土壌粒子内部に保持されていた腐植物質までが次第に抽出液中に溶出され、ＤＮＡ試料への腐植の混入も多くなるという問題が考えられる。
以上のことより、腐植が少なくアロフェン態のＡｌが多い火山灰土壌についてはＥＤＴＡの錯形成反応を利用してＡｌを除去する方法は非効率的であると考えられ、アロフェン態のＡｌによって吸着された土壌ＤＮＡを抽出するためには、その他の方法を検討する必要があると考えられた（実施例７）。
土壌ＤＮＡ抽出液へのリン酸緩衝液の使用
抽出液に様々な濃度でリン酸を加え、土壌ＤＮＡの抽出量を測定した。
（１）材料と方法
供試土壌には火山灰土壌として、高濃度のＥＤＴＡを使用してもＤＮＡ抽出が困難であった弥生圃場対照区土壌、田無農場未耕地土壌、栃木農試森林土壌の３種類のアロフェン質黒ボク土を、また非火山灰土壌として、埼玉農試畑土壌、草地試験場永年採草地土壌、兵庫農試畑土壌の３種類の沖積土壌を用いた（表８）。
Figure 0004665124
ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇの条件は実施例１と同様に設定した。抽出液組成は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１％ＳＤＳ（ｐＨ８．３）を基本として、これにＫ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．３）を０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００ｍＭになるよう添加した抽出緩衝液を調製し、土壌０．５ｇに対してそれぞれ１．２ｍｌずつ添加し、土壌ＤＮＡを抽出した。粗抽出液は除タンパク後、等量の１２％ＰＥＧ／１Ｍ ＮａＣｌ溶液を添加し、４℃にて２００００×ｇで２０分間遠心することによりＤＮＡを回収し、アガロース電気泳動により２０００ｂｐ以上のＤＮＡを定量した（これ以降の実験にはＤＮＡの回収法に等量の１２％ＰＥＧ／１Ｍ ＮａＣｌ溶液を使用した）。またリン酸との比較のため、ＥＤＴＡについても５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００ｍＭに設定した抽出液を作成し、同様にＤＮＡを抽出し定量を行った。全ての実験は３連で行った。
（２）結果と考察
（２−１）抽出液のＥＤＴＡ濃度が土壌ＤＮＡ抽出量に及ぼす影響
火山灰土壌においては、前節で述べた通り、十分に高濃度なＥＤＴＡを用いなければ土壌ＤＮＡが十分に抽出できないことが再び示された（図１５Ａ）。特に栃木農試森林土壌と田無農場未耕地土壌においては、ＥＤＴＡ濃度が最大濃度の時にＤＮＡが最大収量となっており、８００ｍＭという高濃度なＥＤＴＡ抽出液を用いても土壌中に未抽出のＤＮＡが吸着されている可能性が考えられた。
非火山灰土壌においては、埼玉農試畑土壌と兵庫農試畑土壌ではＥＤＴＡ濃度が高まるにつれてＤＮＡ収量の低下が観察された。ＥＤＴＡ濃度の検討実験（実施例４参照）においても同様な現象が見られたが、前述の通りＳＤＳの析出が原因であると考えられた。
なお、火山灰土壌であっても、弥生圃場対照区土壌からの抽出ＤＮＡ量は、ＥＤＴＡ濃度が５００ｍＭの時に最大となり、それ以上のＥＤＴＡ濃度になると収量は低下した。火山灰土壌でも高濃度ＥＤＴＡによるＳＤＳの析出および土壌微生物の溶菌率の低下は起こっていると考えられるが、吸着されたＤＮＡの回収率の上昇が著しいため、溶菌率低下によるＤＮＡ収量の減少が現れにくくなっているだけであり、ＳＤＳによる土壌微生物の溶菌率が高まれば、より多くの土壌ＤＮＡが得られると考えられる。
草地試験場の永年採草地土壌は、他の非火山灰土壌とは違い、火山灰土壌型の抽出傾向を示した（図１５Ａ）。草地試験場は那須火山帯に位置しており、元来この地域の大部分の土壌はアロフェン質黒ボク土である。しかし、採集地である永年採草地は、河川の浸食により火山灰層が失われ、火山灰に覆われていた元の地層部分が地表に表れ、現在の表土の母材となっている。そのため、火山帯に位置していながら非火山灰土壌の性状を示している。ところが、酸性シュウ酸塩抽出によるＡｌやＦｅの量からも推定されるように、実際には非晶質Ａｌが土壌中に残存しており、その非晶質Ａｌが土壌ＤＮＡを吸着したと考えられた。このように、土壌中に存在する非晶質Ａｌは、火山灰土壌の混入というたとえ少量であってもＤＮＡを強く吸着し、ＤＮＡ抽出を阻害する可能性が示唆された。
（２−２）リン酸の濃度が土壌ＤＮＡ抽出に及ぼす影響
火山灰土壌からのＤＮＡ抽出量については、リン酸緩衝液を用いることにより、弥生圃場対照区土壌では１ｇ土壌から３５μｇのＤＮＡを抽出することができ、ＥＤＴＡ緩衝液を用いても収量の低かった田無農場未耕地では１ｇ土壌から１５μｇものＤＮＡを抽出することができた（図１５Ｂ）。また土壌ＤＮＡの最大収量が得られたリン酸濃度は、弥生圃場対照区土壌では１５００ｍＭ、栃木農試森林土壌では７５０ｍＭ、田無農場未耕地土壌では１５００ｍＭであった。それ以上の濃度に設定した場合でも、抽出量はほぼ同じか多少減少する程度であったことから、これらの濃度のリン酸緩衝液で、土壌に吸着したほとんど全ての土壌ＤＮＡが回収できていることが示唆された。また、非火山灰土壌からのＤＮＡ抽出も良好であり、火山灰土壌が一部混入している草地試験場の土壌からも高い収量で土壌ＤＮＡが抽出された。
ＥＤＴＡとリン酸を同じモル濃度で比較すると、栃木農試森林土壌ならびに草地試験場永年草地土壌を除き、ＥＤＴＡの方が土壌ＤＮＡの抽出効果は高かったが、リン酸塩の溶解度は高く水に溶けやすく、ＥＤＴＡの溶解度が最大１．５Ｍ（ｐＨ８．３）であるのに対しリン酸カリウムの溶解度は３Ｍ程度と高いため、ＥＤＴＡよりもはるかに高い濃度で使用することが可能である。リン酸イオンを高濃度で使用すると、弥生圃場対照区土壌や田無農場未耕地土壌からは、ＥＤＴＡを用いて得られたＤＮＡの最大収量の２倍以上のＤＮＡを抽出することができた。
以上のように、リン酸緩衝液は、ＤＮＡ収量においては優れていると言える。但し、以下の事項を考慮する必要がある。
すなわち、火山灰土壌から土壌ＤＮＡを抽出するための緩衝液は、ＥＤＴＡ、リン酸のいずれを使用しても、ＤＮＡの最大収量が得られる条件（ＥＤＴＡ、リン酸、ＳＤＳの濃度など）が土壌によって異なる。これは極めて重要なことを示している。土壌ＤＮＡの抽出の際、土壌ＤＮＡの回収率を上げようと高濃度ＥＤＴＡ、リン酸緩衝液を使用すればＳＤＳによる細胞破壊効率が下がってしまう、細胞破壊効率を上げようと低濃度緩衝液を使用すれば土壌へのＤＮＡ吸着が多くなってしまう。今回の結果は、両者のバランスが土壌によって異なることを示している。従って、すべての土壌で最大収量のＤＮＡ抽出を可能とする普遍的な抽出条件を確立するには、さらに検討する必要があると思われた。
分析対象とするすべての土壌試料から最大収量の土壌ＤＮＡを抽出しようとすれば、すべての土壌について理化学性を試験する必要が生じ、その結果に応じてそれぞれの土壌に最適な抽出緩衝液を個別に作成する必要があるといえる。
高濃度ＥＤＴＡ−リン酸混合液による土壌ＤＮＡの抽出
本実施例では、土壌ＤＮＡ抽出におよぼすＥＤＴＡとリン酸カリウム緩衝液の相乗効果を期待して、両者の併用を試みた。
（１）材料と方法
実験には、実施例７に示す６種類の土壌を用いた。抽出液は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１％ＳＤＳにＥＤＴＡとリン酸を、表９の１番〜１６番に示す組み合わせの濃度で使用した。抽出条件、ＤＮＡの定量条件は実施例６と同様である。
Figure 0004665124
（２）結果と考察
土壌ＤＮＡ抽出量の結果を図１６Ａ〜Ｂに示す。ＥＤＴＡとリン酸をそれぞれ単独で使用するより、混合液では低い濃度であっても、高いＤＮＡ抽出効果が得られ、土壌ＤＮＡ抽出に関してＥＤＴＡとリン酸の補完効果が認められた。また、非火山灰土壌ではこれまで、ＥＤＴＡ濃度の増加に伴ってＤＮＡ収量の低下が認められていたが、ＥＤＴＡとリン酸緩衝液を組み合わせると、ＥＤＴＡを高濃度にしても収量の低下が比較的低く抑えられた。
これまでの結果から、高濃度のＥＤＴＡでも抽出が難しかったアロフェン態のＡｌに富む弥生圃場対照区土壌や田無農場未耕地土壌からも、リン酸緩衝液を用いることにより高収量でＤＮＡを抽出できることが明らかとなった。他の２種類の火山灰土壌と比較して、アロフェン態Ａｌが少ない栃木農試森林土壌に関しては、ＥＤＴＡでもリン酸でもほぼ同じ抽出量が得られている。そしてＥＤＴＡ−リン酸緩衝液の混合液を使用することにより、ＥＤＴＡ単独およびリン酸単独で得られる土壌ＤＮＡの合計量にほぼ近い量の土壌ＤＮＡが得られた。これまでの結果も考慮すると、ＥＤＴＡは主に腐植−Ａｌ複合体のＡｌを除去し、リン酸はアロフェン態Ａｌのマスキングを行う効果があるものと考えられる。
ＥＤＴＡ−リン酸緩衝液併用の利点は、１つには同じＤＮＡ収量を得たい場合それぞれ単独で抽出する際の濃度よりも、いずれもの濃度を低く抑えられることである。２つめはＤＮＡの最大収量が得られる濃度は、やはり土壌によって若干異なるが、４００ｍＭのＥＤＴＡに７５０ｍＭのリン酸カリウムを組み合わせると、ほとんどの土壌からＤＮＡの最大収量を得られることが明らかとなった（図１６Ａ〜Ｂ）。これは、土壌の種類を問わない、ユニバーサルなＤＮＡ抽出液の組成を突き止めたことを意味する。またこの濃度では、その後のＤＮＡの精製操作および沈殿操作時に塩濃度をさげるための希釈操作が不要であったことからも、今後は上記の組成を土壌ＤＮＡ抽出用緩衝液に適用することとした。
このユニバーサルな緩衝液組成は、供試した土壌のほぼすべてから最大収量のＤＮＡを得ることができる。しかしながら、土壌によっては土壌ＤＮＡの低分子化（２０〜７ｋｂｐ）が起きることが判明した。多数の試料を対象にすることが多い土壌微生物群集構造解析では実験操作の簡便さが要求され、また一般に比較的短いＤＮＡ領域（２００〜１５００ｂｐ）しか解析対象としないことなどから、多少ＤＮＡが低分子化されても十分に目的は達成できると考えられた。よって、微生物群集構造解析をする上では、本実施例の条件により土壌ＤＮＡを抽出して問題はないと考えられた。但し、クローニングなど断片化したＤＮＡでは不都合な操作や、群集構造解析であってもより正確に解析したい場合には（高度に低分子化したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅を行うとキメラ配列が発生しやすくなる）、より高分子のＤＮＡが得られる抽出手法が必要であると考えられた。
「２ステップ法」の検討
実施例８で示したように、高濃度のＥＤＴＡ−リン酸による抽出は高収量でＤＮＡを抽出できるが、ＤＮＡの低分子化の可能性がある。そこで、最も強く物理的衝撃がＤＮＡに加わるｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ時に低濃度のＥＤＴＡ−リン酸溶液を用い、次に土壌に吸着されたＤＮＡを高濃度ＥＤＴＡ−リン酸溶液で抽出することにより、ＤＮＡを効率良く抽出しつつ低分子化を回避できるかどうか検討した。
（１）材料と方法
供試土壌として表１０に示すものを用いた。
Figure 0004665124
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１％ＳＤＳ（ｐＨ８．３）４００μｌを土壌０．５ｇの入ったスクリューキャップチューブに加え、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ後、数秒の高速遠心で土壌溶液をチューブ下部に集め、キャップをあけて高濃度ＥＤＴＡ溶液、リン酸溶液もしくはＥＤＴＡ−リン酸混合緩衝液を８００μｌ添加した。その後ｖｏｒｔｅｘにより土壌と溶液をよく攪拌して直ちに遠心、上清を回収して除タンパクし、ＤＮＡを沈殿回収した。ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ後にチューブに添加した溶液の組成、および添加後の抽出液の終濃度を表１１に示す。
Figure 0004665124
（２）結果と考察
結果を図１７に示す。ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ時にＥＤＴＡやリン酸を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用い、その後に高濃度のＥＤＴＡおよびリン酸、ＥＤＴＡ−リン酸緩衝液を用いても、弥生圃場対照区土壌および田無未耕地土壌からは、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ時に高濃度緩衝液を用いて抽出した時（実施例６参照）とほぼ同程度の量のＤＮＡを得ることができた。しかし、栃木農試森林土壌からは、最も高い収量が得られた濃度で比較すると約半分のＤＮＡ抽出量しか得られなかった。初めから高濃度のＥＤＴＡ、リン酸緩衝液を含む抽出液で抽出した場合と同じく、３種類全ての土壌においてＥＤＴＡ４００ｍＭ、リン酸７５０ｍＭの濃度の抽出液がもっともＤＮＡの回収量が多かった。これによりＥＤＴＡ４００ｍＭ、リン酸７５０ｍＭの混合溶液は、溶菌した微生物から放出されたＤＮＡが土壌に吸着するのを防ぐとともに、土壌に吸着したＤＮＡを回収する効果も、検討した組み合わせの範囲においては最も高いと考えられた。
ＤＮＡの低分子化は多少減少したものの、一部の試料ではＤＮＡの低分子化が依然として認められた。これは、遠心操作によりペレット化した土壌を再懸濁するため高濃度緩衝液を添加後に激しくｖｏｒｔｅｘ撹拌する必要があったこと、および、はじめに４００μｌという少量の溶液中でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇしたため、より大きな物理的破壊力が加わったことが原因と考えられる。少ない液量でｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇを行うとＢ▲ｕ▼ｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）の報告にあるようにＤＮＡは低分子にせん断されやすくなる。また土壌の種類によっては、ＤＮＡが不可逆的に土壌に吸着し、その剥離が困難な土壌も存在すると考えられた。
そこで追加検討条件として、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ時の抽出液にＤＮＡの低分子化を引き起こさない上限の濃度の緩衝液の使用について検討した。すなわち、ＤＮＡ抽出液の終濃度は４００ｍＭ ＥＤＴＡ−７５０ｍＭリン酸で固定し、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇを表１２に示す濃度の８００μｌの抽出液により、フラッシュ遠心後にキャップをあけ表１２に示す濃度の４００μｌの回収液を追加し、攪拌してＤＮＡを土壌より剥離させ、回収する改良法を検討した。
Figure 0004665124
改良法による結果を図１８ＡおよびＢ（ＤＮＡ抽出量）および図１９（アガロース電気泳動写真）に示す。この３種類の土壌に関してはｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ時にＤＮＡの低分子化を引き起こさない限界の濃度はＥＤＴＡが４００ｍＭ、リン酸が２５０ｍＭ程度であると考えられた。両者の混合系では４００ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭリン酸の混合液が低分子化を引き起こさない限界濃度であると考えられた。
ここまでの結果から、２ステップ法として、ＤＮＡの低分子化を抑制しつつ収量が最も高い抽出液、すなわち３００ｍＭ ＥＤＴＡと１００ｍＭリン酸を含む緩衝液をｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理時の抽出液として用い（第１ステップ）、その後高濃度のＥＤＴＡ−リン酸緩衝液を添加して攪拌し、土壌に吸着したＤＮＡを回収する（第２ステップ）方法を効率的な土壌ＤＮＡ抽出法として提案する。
土壌ＤＮＡの沈殿方法の選択
本実施例では、２−プロパノール、エタノール、ＰＥＧの３種類を用いたＤＮＡの沈殿方法について、ＤＮＡの回収率およびＤＮＡとともに沈殿する腐植物質の量を測定した。
（１）材料と方法
栃木農試森林土壌、東北大学森林土壌、埼玉農試畑土壌を供試した。それらの理化学性を表１３に示す。
Figure 0004665124
栃木農試森林土壌および東北大学森林土壌は、全炭素量が９％におよび、腐植物質の集積量が多い土壌である。３０種類の土壌より土壌ＤＮＡを抽出した際、他の黒ボク土の抽出液が茶色に着色していた程度であったのに対し、これらの土壌の抽出液は黒色に着色していたことからも、腐植物質の混入量の多さが推測された。
土壌ＤＮＡの抽出には１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／３００ｍＭ ＥＤＴＡ／１％ＳＤＳの抽出液を用い、土壌０．５ｇに抽出液１ｍｌを添加後、ｂｅａｄ−ｂｅａｔｅｉｎｇ処理を行い、遠心後に等量のクロロホルムによる除タンパク処理を行った。この抽出液５００μｌに１／１０量の５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加し、２−プロパノールは７／１０等量、エタノールは２等量、２０％ＰＥＧは６／１０等量を加え、４℃にて２００００×ｇで２０分間遠心し、沈殿を得た。沈殿はＴＥ緩衝液５００μｌに溶解させ、土壌ＤＮＡの回収量を定量した。また腐植物質の一つの特徴として、４００ｎｍ以上の可視光吸収を有することがあげられる。腐植の分析法（山本１９９７）では波長４００ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度を土壌の腐植量として定義していることから、土壌ＤＮＡ溶液への腐植物質の混入量を推定するため、これら２波長における吸光度を測定した。測定はＵＶ／ＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｖ−５５０（日本分光）を使用した。
（２）結果と考察
土壌ＤＮＡの回収量を図２０Ａに、土壌ＤＮＡ溶液の４００ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度を図２０Ｂに示した。
２−プロパノールおよびＰＥＧによる土壌ＤＮＡの回収率が高かった。エタノールでは土壌ＤＮＡの回収量が少なく、ＤＮＡの大部分が沈殿していないと考えられた。またＰＥＧによる沈殿法では、土壌ＤＮＡに混入している大部分のＲＮＡを除去できていた。土壌ＤＮＡ溶液の４００ｎｍおよび６００ｎｍにおける吸光度から、ＰＥＧによる沈殿操作により得られたＤＮＡは、最も腐植物質の混入が少ないことが示された。ＰＥＧを用いた沈殿操作は２−プロパノールを用いた場合と比較して腐植物質の混入が半分以下であり、回収したＤＮＡの純度が高いことがわかった。またアガロース電気泳動の結果から２−Ｐｒｏｐａｎｏｌでは回収されていたｒＲＮＡがＰＥＧによる沈殿操作では除去されていたことがわかった。このように、ＰＥＧにはＤＮＡの回収率が高い、腐植物質の混入が少ない、ＲＮＡを除去できるといった優れた点があるので、この方法を土壌ＤＮＡの沈殿法として採用することにした。しかし、この方法で得られた土壌ＤＮＡを鋳型として１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のほぼ全長を対象にＰＣＲ反応を行ったところ、全く増幅がなく、混入している腐植物質の更なる除去が必要であると考えられた。
ＰＥＧによる沈殿操作の条件検討
本実施例では、ＰＥＧの濃度によるＤＮＡの回収量を検討した。
（１）材料と方法
弥生圃場対照区土壌および栃木農試森林土壌より４００ｍＭ ＥＤＴＡ／７５０ｍＭリン酸／１％ＳＤＳを用いて、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理により土壌ＤＮＡを抽出した。除タンパク処理後、等量の１０、１１、１２、１３、１４、および１５％ＰＥＧ溶液を用いて土壌ＤＮＡの沈殿回収を行い、回収量とＰＥＧ濃度の関係を検討した。ＤＮＡ沈殿時の溶液中のＰＥＧ濃度はそれぞれ５、５．５、６、６．５、７、７．５％である。
（２）結果と考察
結果を図２１に示す。検討濃度範囲では加えるＰＥＧ濃度が１２％の場合にＤＮＡ回収量が最も多かった。腐植物質の混入量には大差がなかったため、ＤＮＡの回収量のみを考慮して、今後のＤＮＡ沈殿回収方法としては、抽出液に対し等量の１２％ＰＥＧ溶液を添加して行うこととした。
土壌ＤＮＡの精製方法についての検討
前述の通り（実施例１参照）、ＤＮＡ抽出に最適な界面活性剤の検討を行った際、ＣＴＡＢでは土壌ＤＮＡを抽出することができなかったが、ＣＴＡＢによる抽出後の溶液は非常に透明で腐植物質の除去に極めて大きな効果があることが示された。またＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ｐｏｒｔｅｏｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）、Ｗｉｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）の報告では、腐植物質の除去にはＣＴＡＢが効果的であるとされている。そこでＣＴＡＢを利用した土壌ＤＮＡの簡易精製と、前項のＰＥＧによる沈殿を組み合わせることにより、ＰＣＲ可能な土壌ＤＮＡを調製することを試みた。
（１）材料と方法
供試土壌としては実施例１０と同じく栃木農試森林土壌、東北大学森林土壌、埼玉農試畑土壌の３種類の土壌を用いた。土壌ＤＮＡの抽出には１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／３００ｍＭ ＥＤＴＡ／１％ＳＤＳの抽出液を用い、土壌０．５ｇに抽出液１ｍｌを添加後、ｂｅａｄ−ｂｅａｔｅｉｎｇ処理を行い、遠心して粗抽出液を得た。この粗抽出液３００μｌに対し、１０％ＣＴＡＢ溶液および５Ｍ ＮａＣｌを用いて、終濃度でＣＴＡＢの濃度が０％、１％、２％、３％の４段階と、ＮａＣｌの濃度が０．７Ｍ、１．４Ｍ、２．１Ｍの３段階のいずれかの組み合わせとなるように添加した。溶液をよく混合し６０℃で１０分間加熱処理を行った後、抽出液をよく混合し、等量のクロロホルムを添加して除タンパク操作を行い、水層を回収し２０％のＰＥＧを６／１０等量加え、土壌ＤＮＡを回収し、ＴＥ緩衝液に溶解させた。
この場合ＣＴＡＢと結合した腐植物質はクロロホルムによる除タンパク時に変性層に集まり、除去される。
土壌ＤＮＡの回収量を定量し、また腐植物質の混入について２−４−２と同様に４００ｎｍにおける吸光度を測定した。
（２）結果と考察
土壌ＤＮＡの回収量を図２２Ａに示す。また、精製操作後の土壌ＤＮＡの４００ｎｍにおける吸光度を図２２Ｂ〜Ｃに示す。
ＣＴＡＢによる精製は、土壌ＤＮＡの損失がほとんどないことが示された。なかでも１．４Ｍ以上のＮａＣｌ存在下で処理を行ったものが最も土壌ＤＮＡの回収量が多かった。またＣＴＡＢの使用により、どの土壌試料についても腐植物質が除去され、特にＣＴＡＢを２％以上使用したときに腐植物質の大部分が除去されていた。通常精製に使用されるＣＴＡＢ濃度は１％であるが、１％では腐植物質の除去率が悪く、２％以上の使用が効果的であった。ＣＴＡＢは陽イオン界面活性剤であり、陰イオン界面活性剤であるＳＤＳとは親水基同士で速やかに結合し、疎水基が外側に向いたミセルもしくは塩を形成し沈殿する。よってＣＴＡＢを１％で使用すると、その大部分が溶液中に残存しているＳＤＳとの反応で消費されてしまい腐植物質の除去に働けるＣＴＡＢが減少し、その結果として吸光度が高くなっていると考えられた。２％以上のＣＴＡＢの使用は残存するＳＤＳがすべてＣＴＡＢにより除去された後、余剰のＣＴＡＢが十分量存在し、腐植物質の除去を行えるために腐植物質が除去され、吸光度が低くなっていると考えられた。
Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）は、既に抽出液にＣＴＡＢを添加することを考案しているが、ＣＴＡＢ １％に対し２％のＳＤＳを使用している。これではＳＤＳによりＣＴＡＢが機能を失ってしまっており、十分な腐植除去ができていないと推測される。
以上のことより、１％ＳＤＳを含む抽出液で土壌ＤＮＡを抽出する場合は、２％以上のＣＴＡＢ、１．４Ｍ以上のＮａＣｌを添加し、６０℃で１０分間のインキュベーションを行い、クロロホルムによる除タンパク後、ＰＥＧにより土壌ＤＮＡを沈殿回収することにより、ほとんどの腐植物質が除去された土壌ＤＮＡを得ることができることが明らかとなった。
土壌ＤＮＡの沈殿法について求められるのは、
（ｉ）ＤＮＡの回収率が高いこと、
（ｉｉ）ＤＮＡのみを選択的に沈殿させ、腐植物質を初めとする夾雑物を沈殿させないこと
である。
また、ＤＮＡの精製法に求められるのは、
（ｉ）夾雑物を取り除き、ＤＮＡの純度を上げること、
（ｉｉ）精製時にＤＮＡが失われないこと、
（ｉｉｉ）簡便でかつコストがかからないこと、
（ｉｖ）特殊な技術、装置を必要としないこと
である。
ＣＴＡＢによる簡易精製およびＰＥＧによるＤＮＡの回収の組み合わせは、上記の条件を全て満たしていると考えられ、この精製、沈殿法と抽出法を組み合わせることにより、本発明におけるオリジナルの抽出法として使用することができる。
本発明の方法と既往の手法による土壌ＤＮＡ収量の比較
本発明の方法、ならびに既往の方法を用いて様々な土壌からＤＮＡを抽出し、土壌ＤＮＡの収量の比較を行った。
（１）材料と方法
現在までの実験において様々な理化学性を示す１２種類の土壌を供試土壌とした。その理化学性を表１４に示す。
Figure 0004665124
本発明において開発した手法として、抽出操作条件が異なる以下の４種類の手法を比較検討した。
１． ０．５ｇの土壌から、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／４００ｍＭ ＥＤＴＡ／７５０ｍＭリン酸カリウム／１％ＳＤＳ（ｐＨ８．６）からなる抽出液１２００μｌによりＤＮＡを抽出し、２％ＣＴＡＢ／１Ｍ ＮａＣｌによる簡易精製を経て、１２％ＰＥＧにより土壌ＤＮＡを沈殿回収する方法。この方法を、以下「オリジナル１Ｓｔｅｐ法」と記す。
２． ０．５ｇの土壌に、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／３００ｍＭ ＥＤＴＡ／１００ｍＭリン酸カリウム／１％ＳＤＳ（ｐＨ８．６）からなる抽出液８００μｌを添加してｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理を行い、フラッシュ遠心後４００μｌの６００ｍＭ ＥＤＴＡ，２０５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を加え、攪拌後に遠心して上清を回収し、２％ＣＴＡＢ／１Ｍ ＮａＣｌによる簡易精製を経て、等量の１２％ＰＥＧにより土壌ＤＮＡを沈殿回収する方法。この方法を、以下「オリジナル２Ｓｔｅｐ法」と記す。
３． ０．５ｇの土壌にｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理まで２と同様の操作を加えた後、４００μｌの６００ｍＭ ＥＤＴＡ／２０５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を添加し、６０℃で１時間加熱処理を行ってから、遠心、簡易精製、ＤＮＡの沈殿回収を２と同様の操作を行った方法。この方法を、以下「オリジナル２Ｓｔｅｐ加熱法」と記す。
４． ０．５ｇの土壌に、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／３００ｍＭ ＥＤＴＡ／１００ｍＭリン酸カリウム／１％ＳＤＳからなる抽出液１２００μｌにてｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理を行い、遠心して上清を回収し、２％ＣＴＡＢ／１Ｍ ＭａＣｌによる簡易精製を経て、等量の１２％ＰＥＧにより土壌ＤＮＡを沈殿回収する方法。この方法を、以下「オリジナルＬｏｗＣｏｎｃＢｕｆｆｅｒ（ＬＣＢ）法」と記す。
既往の方法として、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）の方法およびＣｕｌｌｅｎ ＆ Ｈｉｒｓｃｈ（１９９８）の２種類の方法、さらにＢｉｏ １０１ Ｆａｓｔ ＤＮＡ ｓｐｉｎ ｋｉｔ（Ｑｂｉｏ、ＵＳＡ）、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎＴＭ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ ｋｉｔ（ＭｏＢｉｏ、ＵＳＡ）の２種類のキットを用いる方法により土壌ＤＮＡを抽出した。土壌ＤＮＡ抽出はそれぞれのプロトコールに基づいて行ったが、Ｃｕｌｌｅｎ ＆ Ｈｉｒｓｃｈ（１９９８）の方法およびＵｌｔｒａＣｌｅａｎ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ ｋｉｔ（ＭｏＢｉｏ ＵＳＡ）については、ｂｅａｄｓによる破砕に特別な装置が必要とされたため、この部分については両者ともＦａｓｔ Ｐｒｅｐ ＦＰ１０１（Ｑｂｉｏ、ＵＳＡ）を代用し、強度５ｍ／ｓｅｅ、３０ｓｅｃの処理で代替し、抽出を行った。
また、本実施例では土壌からのＤＮＡ抽出効率の評価を目的としたが、アガロース電気泳動後の切りだしによりＤＮＡを精製するＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）の方法、およびゲルろ過によりＤＮＡを精製するＣｕｌｌｅｎ ＆ Ｈｉｒｓｃｈ（１９９８）の方法では、研究者の技術や操作方法、用いる装置などにより、抽出量にかなりの誤差が生じると考えられたため、精製前のＤＮＡ溶液による収量の比較を行った。
土壌ＤＮＡの抽出の際、土壌と抽出液の懸濁液を遠心して土壌（あるいはｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理を利用する方法では土壌とｂｅａｄｓの混合物）を沈殿させ、抽出液を回収することになるが、この際、土壌やｂｅａｄｓの間隙に回収しきれない抽出液が残る。精製操作などの違いにより、この抽出液の回収量がそれぞれの方法で異なる。土壌からの抽出効率を計算する際、遠心により回収した上清と、土壌やｂｅａｄｓの間隙に含まれる溶液中には等しい濃度でＤＮＡが含まれているものと仮定し、土壌ＤＮＡの抽出量を、添加した抽出液全量に相当する量に換算して算出した。
（計算例）
土壌０．５ｇに抽出液１２００μｌを添加し、ｂｅａｄｓ−ｂｅａｔｉｎｇ処理後、そこから７５０μｌを回収し、その後の精製操作でその溶液が１２５０μｌになり、最終的にそのうち１０００μｌの溶液からＤＮＡを沈殿回収した場合、
土壌１ｇ当たりのＤＮＡ抽出量＝沈殿回収されたＤＮＡ量×１２５０／１０００×１２００／７５０×２
（２）結果と考察
本発明において開発した方法の一例である上記４種類のオリジナル法によって、１２種類の土壌からＤＮＡを抽出した。
結果を図２３に示す。また４種類の方法による抽出ＤＮＡのサイズについて図２４に示す。オリジナル１Ｓｔｅｐ法、２Ｓｔｅｐ加熱法、および既往の代表的な方法による土壌ＤＮＡの抽出量について図２５に示す。
（２−１）４種類のオリジナル法の土壌ＤＮＡ収量比較
火山灰土壌である弥生圃場対照区土壌、栃木農試森林土壌、東北大学森林土壌、およびすべての非火山灰土壌から、オリジナル１Ｓｔｅｐ法およびオリジナル２Ｓｔｅｐ加熱法により、ほぼ同じ量の土壌ＤＮＡを抽出することができた。しかし、千葉農試森林土壌、茨城農試畑土壌、田無農牧草地土壌、群馬畜試牧草地土壌については、オリジナルＬＣＢ法では土壌ＤＮＡがほとんど抽出できていない。またオリジナル２Ｓｔｅｐ法でも、土壌ＤＮＡの抽出量は、オリジナル１Ｓｔｅｐ法のそれと比較して１／３から１／５以下となっている。これらの土壌では、土壌に吸着したＤＮＡを溶出させる作用が強いオリジナル２Ｓｔｅｐ加熱法でも十分な量の土壌ＤＮＡを回収することができなかった。この４種類の土壌は、いずれもアロフェン態Ａｌが５０ｍｇ／ｇ ｓｏｉｌと火山灰土壌の中でも特に多い土壌であり、ＤＮＡの土壌への吸着が強く、いったん土壌に吸着されてしまうと、ＤＮＡを再抽出し回収することは困難と思われた。非火山灰土壌からは、加熱を伴わない２Ｓｔｅｐ法でも、極めて高収量で土壌ＤＮＡを回収することが可能であり、土壌によるＤＮＡ吸着の解消が容易になされた。
またオリジナル１Ｓｔｅｐ法により得られた土壌ＤＮＡが、２０〜７ｋｂｐに低分子化していたのに対し、オリジナル２Ｓｔｅｐ法およびオリジナル２Ｓｔｅｐ加熱法、オリジナルＬＣＢ法により得られた土壌ＤＮＡは、２０ｋｂｐ以上の高分子に保たれ、低分子化は抑えられていた。
最終的なＤＮＡ溶液への腐植物質の混入はオリジナル２Ｓｔｅｐ法およびオリジナルＬＣＢ法ではほとんどみられず、溶液はほぼ無色であった。しかし、オリジナル１Ｓｔｅｐ法およびオリジナル２Ｓｔｅｐ加熱法については、栃木農試森林土壌および東北大学森林土壌から抽出したＤＮＡ溶液は茶色に着色しており腐植物質を完全に除去することだできていなかった。この２種類の土壌は腐植の集積量が多く、抽出時に多量の腐植物質が抽出されてしまっていた。しかし、後述するが鋳型ＤＮＡ量を少なくするとＰＣＲ反応が成功する範囲の腐植物質の混入であった。
（２−２）既往の方法との収量比較
いずれの土壌においても、本発明のオリジナル１Ｓｔｅｐ法および２Ｓｔｅｐ加熱法は、既往の手法よりも多くの土壌ＤＮＡを抽出することが可能であった。特にアロフェン質黒ボク土および草地試験場永年採草地土壌からは、既往の方法ではＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）の方法でしか土壌ＤＮＡが得られず、またその場合でもＤＮＡの収量は低いものであった。
非火山灰土壌および東北大学森林土壌からは、Ｕｌｔｒａ ＣｌｅａｎＴＭ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ ｋｉｔを除く既往の方法でも土壌ＤＮＡが得られた。既往の方法では、Ｂｉｏ１０１ Ｆａｓｔ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔによる抽出量が多く、Ｃｕｌｌｅｎ ＆ Ｈｉｒｓｃｈ（１９９８）方法でも土壌ＤＮＡは抽出された。しかし、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）の方法による抽出量は、非火山灰土壌においても少なく、この収量の差は、加熱処理およびｂｅａｄ−ｂｅａｔｉｎｇ処理の有無によって生じたと考えられた。しかし、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）の方法では、２３ｋｂｐ以上の高分子土壌ＤＮＡが得られていた。
この比較検討の結果より、本発明のオリジナルの方法は、さまざまな土壌から高収量で土壌ＤＮＡを抽出することが可能であり、またアロフェン態Ａｌに富む土壌からは、オリジナルの方法を用いないと土壌ＤＮＡが十分に、あるいは全く得られないことが明らかになった。
ＤＮＡ純度の比較
土壌ＤＮＡの純度は、ＰＣＲ反応にどれぐらいの濃度のＤＮＡを鋳型として使用できるかを指標として検討を行った。濃度が高いほど夾雑物も多くなるため、純度の高いＤＮＡ試料でなければ、高濃度で使用したときにＰＣＲ反応が阻害されるからである。
（１）材料と方法
ＤＮＡの抽出効率の差により、最終的なＤＮＡ溶液量を一定にしても土壌ＤＮＡ含量は全く異なる。そこで、定量した土壌ＤＮＡ濃度をもとに、土壌ＤＮＡを１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇの３段階で鋳型として用い、ＰＣＲ反応の成否を試験することにより、土壌ＤＮＡの純度を検定した。
検討した土壌ＤＮＡはオリジナル１Ｓｔｅｐ法およびオリジナル２Ｓｔｅｐ加熱法により得られたものである。この２種類の方法は、ｂｅａｄ−ｂｅａｔｉｎｇ後の粗抽出液が腐植物質の混入により茶色もしくは黒色に着色しており、他の２種類の方法よりも腐植物質の混入量は多いと考えられ、精製による腐植物質の除去効率を検討するのに適していると考えられたからである。
ＰＣＲは３連で行い、その反応条件および使用したプライマーについては以下の通りである。
ＰＣＲ反応の条件
プライマーセット ２７Ｆ−１４９４Ｒ
Figure 0004665124
上記プライマーセットにより、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のほぼ全長を増幅することができる。
反応液組成は以下の通りである。
反応液：５０μｌ
プライマー：０．５ｍＭ
Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｓｉｇｍａ）：２．５ｕｎｉｔ
ＢＳＡを終濃度４００ｎｇ／μｌで含む。
反応条件は、まず９４℃で２．５分反応させた後、次に９４℃３０秒の変性、５０℃３０秒のアニーリング及び７２℃２分の伸長反応を１サイクルとしてこれを３０サイクル行い、最後に、７２℃で１０分反応させた。
（２）結果と考察
ＰＣＲによる土壌ＤＮＡの純度検定の結果について図２６Ａ〜Ｂに示す。
腐植物質の集積量および混入量が多い２種類の土壌以外、すなわち栃木農試森林土壌および東北大学森林土壌以外では、オリジナル１Ｓｔｅｐ法により得られた土壌ＤＮＡは、５０μｌのＰＣＲ反応液中に５０ｎｇを使用しても、ＰＣＲ反応が成功した。オリジナル２Ｓｔｅｐ加熱法により得られた土壌ＤＮＡでも同様の結果が得られた。オリジナル１Ｓｔｅｐ法により得られた栃木農試森林土壌および東北大学森林土壌は、１０ｎｇ土壌ＤＮＡを鋳型にするとＰＣＲが成功した。
これに対し、２Ｓｔｅｐ加熱法により得られた栃木農試森林土壌のＤＮＡでは、いずれのＤＮＡ量の場合でもＰＣＲ反応が成功しなかった。東北大学森林土壌よりオリジナル２Ｓｔｅｐ加熱法により得られた土壌ＤＮＡは、さらに希釈して鋳型としての使用量を１ｎｇ程度にしないと、ＰＣＲは成功しなかった。このことから、腐植の集積量が多い土壌から、高濃度ＥＤＴＡ−リン酸混合液を使用し、さらに加熱処理を施して抽出されたＤＮＡは、ＣＴＡＢ精製およびＰＥＧ沈殿を行っても十分に腐植物質を除去しきれないと考えられた。
しかし、この２種類の土壌を除く大部分の土壌については、５０μｌのＰＣＲ反応に５０ｎｇの土壌ＤＮＡを鋳型として使用してもＰＣＲが成功したことから、オリジナル法によって高純度な土壌ＤＮＡが得られたと考えられる。オリジナル法で得られる土壌ＤＮＡはＰＣＲ反応の鋳型として多量に用いることができるため、ＰＣＲ反応サイクル数を少なく設定することが可能であり、また、土壌中のマイナーな微生物群も効率よく検出できることが示された。
土壌ＤＮＡ組成の比較
本実施例では、本発明の各種手法により得られた土壌ＤＮＡの組成について、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法により比較検討した。
（１）材料と方法
抽出された土壌ＤＮＡ１μｌを鋳型として、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３領域をＰＣＲにより増幅し、これをＤＧＧＥにより解析した。ＰＣＲ反応の条件および使用したプライマー、ＤＧＧＥの条件を以下に示す。
（１−１）ＰＣＲ
プライマーセット ３４１ＦＧＣ−５３４Ｒ
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ３領域を増幅
Figure 0004665124
反応条件は、まず９４℃で２．５分反応させた後、次に９４℃３０秒の変性、５５℃３０秒のアニーリング及び７２℃１分の伸長反応を１サイクルとしてこれを２４又は３０サイクル行い、最後に、７２℃で１０分反応させた。反応液組成は以下の通りである。
ＢＳＡを終濃度４００ｎｇ／μｌで含む。
Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｓｉｇｍａ）２．５ｕｎｉｔ
反応液 ５０μｌ
（１−２）ＤＧＧＥ
ゲル濃度 ８％
変性剤濃度勾配 ３５％〜６５％
Ｂｕｆｆｅｒ温度 ６０℃
電圧 １００Ｖ
泳動時間 １０時間
オリジナルの４種類の方法およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）の方法により得られた土壌ＤＮＡ溶液はおおよそ５〜５０ｎｇ／μｌである。この１０〜２０μｇを鋳型として、２４サイクルのＰＣＲ反応を行った。またその他の既往の方法では、火山灰土壌から十分量の土壌ＤＮＡが得られなかったが、条件を揃えるため、それぞれ１μｌずつを鋳型として３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。既往の方法で非火山灰土壌から得られた土壌ＤＮＡについては、同じく１μｌを鋳型として２４サイクルのＰＣＲ反応を行った。
（２）結果と考察
各方法で得られた土壌ＤＮＡのＤＧＧＥ解析結果を図２７Ａ〜Ｅに示す。
弥生圃場対照区土壌、千葉農試森林土壌、茨城農試畑土壌、田無農場牧草地土壌、群馬畜試牧草地土壌、栃木農試森林土壌の６種類の土壌については、オリジナルによる方法では十分な増幅産物が得られたが、既往の方法で抽出した土壌ＤＮＡを鋳型として行ったＰＣＲ反応では、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）方法以外では全く増幅産物を得ることができなかった。非火山灰土壌においてはオリジナル法および既往の方法でも十分な増幅産物が得られた。これらのＰＣＲ反応により得られた増幅産物をＤＧＧＥにより分析し、その土壌ＤＮＡの由来生物組成について検討した結果、一部抽出の過程において土壌以外から混入したと思われるＤＧＧＥバンドがまれに生じることもあったが、全ての抽出法により同様のＤＧＧＥプロファイルが得られた。すなわち、少なくとも本実験で対象にした１６Ｓ ｒＲＮＡを持つ細菌については、ＤＮＡが抽出される細菌群および各細菌群間におけるＤＮＡ抽出率の比がいずれの抽出法でも同等であることが示された。
以上をまとめると次のことが示された。
１．オリジナル１Ｓｔｅｐ法、オリジナル２Ｓｔｅｐ加熱法は、既往の方法よりも高収量で土壌ＤＮＡを抽出することができた。
２．オリジナル１Ｓｔｅｐ法、オリジナル２Ｓｔｅｐ加熱法は、既往の方法では抽出が困難であったアロフェン質Ａｌに富む火山灰土壌からも土壌ＤＮＡを抽出することができた。
３．オリジナル１Ｓｔｅｐ法、オリジナル２Ｓｔｅｐ加熱法は、ほとんどの土壌より得られた土壌ＤＮＡの５０ｎｇをも鋳型としてＰＣＲに供試でき、高純度な土壌ＤＮＡが得られていることが示された。
ＰＣＲ−ＤＧＧＥの結果より、各方法により得られた土壌ＤＮＡに含まれる細菌由来のＤＮＡ組成は、ほぼ同じであることが推測された。
ＣＴＡＢによる精製時にｐＨを低下させることによる精製率の向上（ＣＨ３ＣＯＯＮａを単独で使用した場合）
土壌からアルカリ条件下で抽出される腐植物質の大部分は腐植酸である。腐植酸は土壌化学的にはアルカリで土壌から抽出され、ｐＨ２の酸性条件により電荷を失い、沈殿する物であるとの定義がなされている。
土壌からＤＮＡを抽出する際に混入する夾雑物質もほとんどがこの腐植酸であると考えられる。
通常、ＣＴＡＢによるＤＮＡ溶液の精製はＮａＣｌ存在下で行われているが、本実施例ではこのＮａＣｌを酸性側にｐＨを調製したＣＨ３ＣＯＯＮａに変更し、ＣＴＡＢによる精製時にｐＨを低下させることにより腐植除去効率の向上を試みた。
（１）材料と方法
東北大学森林土壌１０ｇに対し、次の３種類の抽出液を用いて土壌からのＤＮＡ抽出液を得た。
Figure 0004665124
上記抽出液を土壌に対し２４ｍｌ添加し、６５℃において３０分加熱処理を加え、土壌からＤＮＡの加熱抽出を行った。土壌を抽出液で長時間加熱抽出を行うとＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ処理の場合よりも多くの腐植物質がＤＮＡと共に抽出される。差をより明確にするためこの実験では土壌ＤＮＡを加熱抽出により抽出し、得られた土壌ＤＮＡ溶液を、腐植物質が多量に混入した汚染サンプルとして精製実験を行った。
その後６０００×ｇ １０分間の遠心により上清を得た。この上清はＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ処理による抽出操作よりもはるかに多くの腐植物質が混入していることが確認できた。
この溶液を土壌ＤＮＡ抽出液とし、以下の精製実験に供試した。
３種類の土壌ＤＮＡ抽出液７５０μｌに１０％ＣＴＡＢ溶液２５０μｌおよび５Ｍ ＮａＣｌ溶液もしくはｐＨを５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．５に調製した５Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ溶液を２５０μｌ添加した。すなわち土壌ＤＮＡ抽出液にこれらの溶液を添加することにより、２％ＣＴＡＢ／１Ｍ ＮａＣｌもしくは１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨが７条件）に調製し、クロロホルムをこれらの溶液に等量添加し、ｖｏｒｔｅｘ後１２０００×ｇ ２５℃で１０分間遠心を行い、水相を精製処理後のＤＮＡ抽出液として回収した。このＣＴＡＢによる精製時の塩に酸性緩衝能を付加することにより、ｐＨを低下させＤＮＡ溶液の純度がどのような影響を与えるかを明らかにするため、この上清を適時希釈して４００ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果を図２８に示す。
また、この上清７５０μｌに対し等量の１２％ＰＥＧ溶液を添加し、２００００×ｇ４℃ ２０分間の遠心により土壌ＤＮＡを沈殿させた。上清を除去、７０％エタノールで洗浄、乾燥後、このＤＮＡの沈殿を２００μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させてＤＮＡ溶液とした。
このＤＮＡ溶液を適時希釈して４００ｎｍにおける吸光度を測定した結果を図２９に示す。また最終的に得られたＤＮＡ溶液のＤＮＡの濃度を測定し、土壌ＤＮＡの回収率を１％ＳＤＳ／２００ｍＭ ＥＤＴＡ／３７５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６）によるＤＮＡ抽出液について定量した結果を図３０に示す。
（２）結果と考察
図２８より、ＣＴＡＢによる精製時に塩溶液に酸性緩衝能を持ったＣＨ３ＣＯＯＮａ溶液を使用することで通常のＮａＣｌ溶液を使用した場合と比較して、ＤＮＡ抽出液からクロロホルム添加後の遠心時に３０％〜６０％の腐植物質が除去できていることが示された。またこの場合のＣＨ３ＣＯＯＮａ溶液のｐＨによっては差が生じなかった。
図２９より、最終的に１２％ＰＥＧ溶液により回収したＤＮＡの純度において３種類のいずれの抽出液で得た土壌ＤＮＡ抽出液の精製に対しても、酸性緩衝能を持ったＣＨ３ＣＯＯＮａの使用によりＮａＣｌの場合よりも純度の高い土壌ＤＮＡを得ることが可能であることが示された。
また１％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ ＥＤＴＡ／１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６）で抽出したＤＮＡ抽出液については酸性緩衝能を持ったＣＨ３ＣＯＯＮａの効果は高くｐＨが５．２の場合に最も純度が高かった。しかし、その他２種類の抽出液ではｐＨによる効果はあまりみられなかった。
しかし、図３０からもわかるようにＣＨ３ＣＯＯＮａのｐＨはＤＮＡの回収率に大きな影響を与えており、ＣＨ３ＣＯＯＮａを使用した場合はｐＨが高いものほどＤＮＡの回収率が悪くなっていることが明らかになった。
以上の結果より、酸性緩衝能を持ったＣＨ３ＣＯＯＮａの使用はＣＴＡＢによる精製時の腐植除去に極めて効果的であり、そのｐＨはＤＮＡの回収率がよいｐＨ５．２の使用がよいと考えられた。
ＣＴＡＢによる精製時にｐＨを低下させることによる精製率の向上（ＮａＣｌとＣＨ３ＣＯＯＮａの混合液を使用した場合）
本実施例では、ＣＴＡＢによる精製時の塩溶液としてＮａＣｌとＣＨ３ＣＯＯＮａの混合液を使用することを試みた。
（１）材料と方法
実験操作は実施例１６の（１）と同様であり、ＣＴＡＢ精製時に添加する塩にＮａＣｌとＣＨ３ＣＯＯＮａの混合液を使用した。ＤＮＡ抽出液７５０μｌに１０％ＣＴＡＢ溶液２５０μｌと以下の塩の混合液を２５０μｌ添加した。
Figure 0004665124
添加後の塩の組成はそれぞれＣＨ３ＣＯＯＮａ／ＮａＣｌで０．５Ｍ／０．５Ｍ，０．３３Ｍ／０．６７Ｍ，０．２５Ｍ／０．７５Ｍ，０．６７Ｍ／０．３３Ｍ，０．７５Ｍ／０．２５Ｍ，１Ｍ／０．２５Ｍ，１Ｍ／０．５Ｍ，０．７５Ｍ／０．５Ｍ，０．７５Ｍ／０．７５Ｍとなる。
これらの溶液を添加してクロロホルムを等量添加、ｖｏｒｔｅｘ、遠心後の水相を採取し、適宜希釈後４００ｎｍにおける吸光度を測った結果を図３１に示す。また最終的に１２％ＰＥＧ溶液により回収して、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解させたＤＮＡ溶液の４００ｎｍにおける吸光度を図３２に示した。
また土壌ＤＮＡの回収量を図３３に示した。
（２）結果と考察
図３１より塩溶液にＮａＣｌおよびＣＨ３ＣＯＯＮａの混合液を使用した場合でも、添加後の塩の組成がＣＨ３ＣＯＯＮａ／ＮａＣｌで０．６７Ｍ／０．３３Ｍ，０．７５Ｍ／０．２５Ｍ，１Ｍ／０．２５Ｍ，１Ｍ／０．５Ｍ，０．７５Ｍ／０．５Ｍ，０．７５Ｍ／０．７５Ｍの場合は、１Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａとほぼ同様もしくはそれ以上の腐植除去率を得られることが明らかとなった。また図３２に示されるように、ＰＥＧ溶液により回収した土壌ＤＮＡの純度も、同様に従来用いられているＮａＣｌをＣＴＡＢによる精製時に使用したものよりも、高い純度が得られていた。図３３に示されるように、ＣＨ３ＣＯＯＮａとＮａＣｌの混合液を使用すると従来用いられているＮａＣｌ単独の場合よりもＤＮＡの回収率が高くなっていた。検討した条件においてはＣＴＡＢによる精製時の塩組成がＣＨ３ＣＯＯＮａ／ＮａＣｌで０．２５Ｍ／０．７５Ｍ，０．６７Ｍ／０．３３Ｍの場合の効果がＤＮＡの純度、回収率の両方において最も高いと考えられた。
アルカリ緩衝能を持つＰＥＧ溶液のＤＮＡの沈殿回収への使用
土壌からのＤＮＡ抽出にともなう夾雑物はほとんどが腐植酸であると考えられるが、腐植酸は先に述べたように酸性で沈殿し、アルカリ性では再びイオン化して水溶液に溶解する性質を持つ。
ＣＴＡＢによる精製時に酸性緩衝能をもった塩溶液を添加することにより、腐植物質の除去率を高めることができた。しかし、その後のＰＥＧによるＤＮＡの沈殿回収の際には除去しきれなかった腐植物質がＤＮＡとともに沈殿してしまっており、この除去が必要である。
そこでＣＴＡＢによる精製時に低下させたｐＨを、ＰＥＧによるＤＮＡの沈殿回収時に再び上昇させることにより、腐植物質を再びイオン化させ、腐植物質がより沈殿しにくい条件に調製して、ＤＮＡのみを選択的に沈殿させることが可能であるか否かを検討した。ｐＨを上昇させるためには、アルカリ性の緩衝能を持った溶液が必要である。ＰＥＧ溶液は水溶液であるので、ＰＥＧとアルカリ緩衝能を持つ試薬を溶解し、一つの溶液として作成して使用することを試みた。
アルカリ緩衝能を持つ試薬としてはＴｒｉｓ（トリスヒドロキシアミノメタン）やＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅなどが挙げられるが、今回の実験では最もよく使用されているＴｒｉｓを使用した。
（１）材料と方法
実施例１６と同様に土壌ＤＮＡを抽出し、ＣＴＡＢによる精製処理をおこなった。この精製処理の時にはＮａＣｌに加えて、酸性緩衝能を持ったＣＨ３ＣＯＯＮａおよびＮａＣｌとＣＨ３ＣＯＯＮａの混合液を塩溶液として実施例１７と同様の条件で使用した。
ＣＴＡＢにより精製し、クロロホルムを等量添加、ｖｏｒｔｅｘ、遠心後の水相を採取し、この溶液７５０μｌに対し１２％ＰＥＧ溶液もしくはアルカリ緩衝能を持ったＰＥＧ溶液として１２％ＰＥＧ／３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を等量添加し、２００００×ｇ４℃ ２０分間遠心を行い得られた土壌ＤＮＡの沈殿を７０％ エタノールで洗浄および乾燥後、２００μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させ、土壌ＤＮＡ溶液とした。
こうして得られた土壌ＤＮＡ溶液を適宜希釈して、４００ｎｍにおける吸光度を測定した結果を図３４に示す。またこれらのアルカリ緩衝能を持つＰＥＧ溶液の使用が土壌ＤＮＡの回収率に与える影響を図３５に示す。
またアルカリ緩衝能を持つＰＥＧ溶液のより詳細な条件検討として、１％ＳＤＳ／２００ｍＭ ＥＤＴＡ／３７５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６）で抽出した土壌ＤＮＡ抽出液について上記の実験と同様の操作を行い、ＰＥＧ溶液として１２％ＰＥＧ，１２％ＰＥＧ／３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６），１２％ＰＥＧ／２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６），１２％ＰＥＧ／１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を使用した場合に得られる土壌ＤＮＡ溶液の純度についての結果を図３６に示す。また回収率について図３７に示す。
（２）結果と考察
図３４よりアルカリ緩衝能をもった１２％ＰＥＧ／３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）の土壌ＤＮＡの沈殿回収への使用によりＣＴＡＢによる精製時のいずれの条件においても従来用いられている方法に比較して、ＤＮＡの純度が高くなっていることが明らかとなった。
図３５よりアルカリ緩衝能を持ったＰＥＧ溶液は精製後のＤＮＡ抽出液からのＤＮＡ回収に使用した場合、通常のＰＥＧ溶液と回収率は全く変わらないことが明らかとなった。
以上のことからアルカリ緩衝能を持ったＰＥＧ溶液は通常のＰＥＧ溶液とＤＮＡを沈殿回収させる能力は全く同様であるが、腐植物質をほとんど沈殿させないことを明らかにすることができた。
ＣＴＡＢ処理時に酸性緩衝能を持つ塩溶液を使用することによるｐＨを低下させる操作と組み合わせることで、純度が最も高いＤＮＡを得ることができた。
またアルカリ緩衝能を持ったＰＥＧ溶液については、図３６より、アルカリ緩衝能を持たないＰＥＧ溶液と比較して、純度の高いＤＮＡが得られた。ＣＴＡＢによる精製時の塩条件として採用した０．６７Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ／０．３３Ｍ ＮａＣｌでＣＴＡＢによる精製処理を行った土壌ＤＮＡ抽出液に対しては、１２％ＰＥＧ／３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６），１２％ＰＥＧ／２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６），１２％ＰＥＧ／１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）のいずれの条件であっても純度の高いＤＮＡが得られた。
図３７より、ＣＴＡＢによる精製時の塩条件として採用した０．６７Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ／０．３３Ｍ ＮａＣｌでＣＴＡＢによる精製処理を行った土壌ＤＮＡ抽出液に対しては、１２％ＰＥＧ／３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６），１２％ＰＥＧ／２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６），１２％ＰＥＧ／１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）のいずれであってもＤＮＡの回収率はほぼ変わらないことが明らかとなった。
抽出法の追加条件
高分子のＤＮＡは、ＤＮＡの損傷が少なく、クローニングやより長い塩基配列を解析の対象にする研究に必要である。高分子ＤＮＡを得るためには物理的なせん断を避けるためＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法ではなく、加熱処理という緩やかな条件で土壌を処理することが望ましい。
土壌に抽出液を添加し、長時間加熱処理を行って抽出した土壌ＤＮＡ抽出液には腐植物質が大量に混入するため腐植物質の除去が困難であったが、前述の新たに改良したＤＮＡの精製法によりほぼ完全な腐植物質の除去を達成でき、加熱処理法による土壌ＤＮＡ抽出を行うことが可能となった。
そこで本実施例では、加熱抽出によりＤＮＡ抽出を行うための条件を検討した。
（１）材料と方法
土壌として東京大学農学部 弥生圃場対照区土壌、東京大学附属農場 田無牧草地土壌、栃木農試 森林土壌、埼玉農試 畑土壌、兵庫農試 畑土壌を対象に加熱処理による土壌ＤＮＡ抽出実験を行った。抽出液としては弥生圃場対照区土壌からの抽出には以下の組成の抽出液を使用した。
Figure 0004665124
その他の土壌については、以下の組成の抽出液を使用した。
Figure 0004665124
Figure 0004665124
土壌０．５ｇに対し、抽出液１．２ｍｌを添加し、適宜攪拌しながら６５℃において１時間加熱処理を行った。その後１２０００×ｇ２５℃ ５分間の遠心により上清を得た。この上清７５０μｌに対し１０％ＣＴＡＢ溶液２５０μｌおよび３．３３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ／１．６７Ｍ ＮａＣｌ溶液を２５０μｌ添加し、ｖｏｒｔｅｘ後等量のクロロホルムを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後１２０００×ｇ ２５℃ ２０分間の遠心を行った。水相を回収し等量の１２％ＰＥＧ／１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を添加し、ｖｏｒｔｅｘ後、２００００×ｇ４℃ ２０分間遠心を行い、土壌ＤＮＡの沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄および乾燥後、２００μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させ、土壌ＤＮＡ溶液とした。
弥生圃場対照区土壌を用いて様々な組成の抽出液を用いて抽出したＤＮＡ抽出量について図３８に示す。絞り込んだ条件について弥生圃場対照区土壌、田無牧草地土壌、栃木農試 森林土壌、埼玉農試 畑土壌、兵庫農試 畑土壌から抽出したＤＮＡ抽出量についての結果を図３９に示す。
（２）結果と考察
図３８より、以下の抽出液において、抽出量が高いことが明らかとなった。
Figure 0004665124
また図３９より１％ＳＤＳ／２００ｍＭ ＥＤＴＡ／２５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６）の組成がどの土壌においても高い収量が得られることが明らかとなった。
土壌以外の環境サンプルからのＤＮＡ
土壌以外の微生物を含む環境サンプルとしては、人や家畜の糞便、堆肥、活性汚泥、湖底など水系の堆積物などが挙げられる。
本実施例では、土壌をサンプルとして開発したＤＮＡ抽出法によりその他の環境サンプルからもＤＮＡが抽出できるかを検討した。
（１）糞便からのＤＮＡ抽出
成人男子２名より、３日間サンプリングを行った糞便サンプルからＤＮＡ抽出を行った。
サンプルは６種類Ｒ−１、Ｒ−２、Ｒ−３、Ｎ−１、Ｎ−２、Ｎ−３である。
まずサンプルＲ−１を用いて抽出液の組成を検討した。抽出液は以下の組成のものを用い、ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇおよび加熱抽出による抽出法の両方を検討した。
Figure 0004665124
糞便サンプル０．５ｇに抽出液１．２ｍｌを添加し、ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇによる方法は４ｍ／ｓｅｃで３０秒間のＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ処理を行い、その後１２０００×ｇ２５℃ ５分間の遠心により上清を得た。この上清７５０μｌに対し１０％ＣＴＡＢ溶液２５０μｌおよび３．３３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ／１．６７Ｍ ＮａＣｌ溶液を２５０μｌ添加し、ｖｏｒｔｅｘ後等量のクロロホルムを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後１２０００×ｇ ２５℃ ２０分間の遠心を行った。水相を回収し等量の１２％ＰＥＧ／１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を添加し、ｖｏｒｔｅｘ後、２００００×ｇ４℃ ２０分間遠心を行い、ＤＮＡの沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄および乾燥後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させ、糞便ＤＮＡ溶液とした。
加熱処理法による抽出は６５℃において１時間インキュベート処理を行い、その後１２０００×ｇ２５℃ ５分間の遠心により上清を得た。この上清７５０μｌに対し１０％ＣＴＡＢ溶液２５０μｌおよび３．３３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ／１．６７Ｍ ＮａＣｌ溶液を２５０μｌ添加し、ｖｏｒｔｅｘ後等量のクロロホルムを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後１２０００×ｇ ２５℃ ２０分間の遠心を行った。水相を回収し等量の１２％ＰＥＧ／１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を添加し、ｖｏｒｔｅｘ後、２００００×ｇ４℃ ２０分間遠心を行い、ＤＮＡの沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄および乾燥後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させ、糞便ＤＮＡ溶液とした。
それぞれの方法で得られたＤＮＡの抽出量について図４０に示す。
またＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法ともに１％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）を用いて上記の同様の操作でその他のサンプルからも抽出を行った。
得られた糞便ＤＮＡについての電気泳動の結果を図４１に示す。
また従来法と純度、収量の点で比較を行った。従来法は１％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）の抽出液で６５℃における１時間インキュベート処理で加熱抽出を行い、その後１２０００×ｇ ２５℃ ５分間の遠心により上清を得た。この上清に対し、等量のクロロホルムを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後１２０００×ｇ ２５℃ ２０分間の遠心を行った。水相を回収し０．６倍量の２−プロパノールを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後、２００００×ｇ ４℃ ２０分間遠心を行い、ＤＮＡの沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄および乾燥後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させ、糞便ＤＮＡ溶液とした。
ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法、従来法により得られた糞便ＤＮＡの収量についての結果を図４２、純度についての結果を図４３に示す。
（２）結果と考察
図４０より、ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法ともに１％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）による抽出量が最も多かった。
図４２より、収量の面では従来法よりも今回開発したＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法によるＤＮＡの抽出量は低いことが明らかとなった。しかし、今回開発したＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法は精製操作を一連の操作として行っており、その操作の過程での一部ＤＮＡの損失がある。また今回開発した方法ではＰＥＧ溶液によりＤＮＡを回収しているためＲＮＡは沈殿しないのに対し、従来法ではＤＮＡの沈殿に２−プロパノールを使用しているため、ＲＮＡも沈殿させてしまう。従って、見かけ上は、このＲＮＡがＤＮＡの定量結果に影響を及ぼし収量に差が生じたものと考えられる。
図４３より、従来法に比較して、今回開発したＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法で抽出した糞便ＤＮＡの純度ははるかに高いことが明らかとなった。
これにより、今回開発したＤＮＡの精製、沈殿方法は糞便サンプルから得たＤＮＡ抽出液から選択的にＤＮＡのみを取り出すことに極めて有効であることが示された。
堆肥および活性汚泥からのＤＮＡ抽出
本実施例では、堆肥および活性汚泥サンプルからＤＮＡ抽出を行った。
サンプルは堆肥が５種類 落ち葉堆肥、牛糞バラ堆肥、醗酵牛糞堆肥、鶏糞堆肥、腐葉土、活性汚泥サンプルが３種類 Ｋａｎａｇａｗａ，Ｏｃｈｉａｉ１，Ｏｃｈｉａｉ２である。
まず落ち葉堆肥を用いて抽出液の組成を検討した。抽出液は以下の通りである。
Figure 0004665124
上記抽出液を用い、ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇによる抽出法と加熱抽出による抽出法の両方を検討した。
堆肥サンプル０．５ｇに抽出液１．２ｍｌを添加し、ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇによる方法は４ｍ／ｓｅｃで３０秒間のＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ処理を行い、その後１２０００×ｇ２５℃ ５分間の遠心により上清を得た。この上清７５０μｌに対し１０％ＣＴＡＢ溶液２５０μｌおよび３．３３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ／１．６７Ｍ ＮａＣｌ溶液を２５０μｌ添加し、ｖｏｒｔｅｘ後等量のクロロホルムを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後１２０００×ｇ ２５℃ ２０分間の遠心を行った。水相を回収し等量の１２％ＰＥＧ／１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を添加し、ｖｏｒｔｅｘ後、２００００×ｇ ４℃ ２０分間遠心を行い、ＤＮＡの沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄および乾燥後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させ、堆肥ＤＮＡ溶液とした。
加熱処理法による抽出は６５℃において１時間インキュベート処理を行い、その後１２０００×ｇ ２５℃ ５分間の遠心により上清を得た。この上清７５０μｌに対し１０％ＣＴＡＢ溶液２５０μｌおよび３．３３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ／１．６７Ｍ ＮａＣｌ溶液を２５０μｌ添加し、ｖｏｒｔｅｘ後等量のクロロホルムを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後１２０００×ｇ ２５℃ ２０分間の遠心を行った。水相を回収し等量の１２％ＰＥＧ／１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を添加し、ｖｏｒｔｅｘ後、２００００×ｇ ４℃ ２０分間遠心を行い、ＤＮＡの沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄および乾燥後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させ、堆肥ＤＮＡ溶液とした。
それぞれの方法で得られたＤＮＡの抽出量について図４４に示す。
またＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法ともに１％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）を用いて上記の同様の操作でその他のサンプルからも抽出を行った。
この際活性汚泥サンプルは懸濁状態であったので５００μｌをサンプルとし、ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ処理、加熱抽出時に１％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）となるように、５００μｌの２％ＳＤＳ／２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）を添加し、ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ処理、加熱処理を行ってＤＮＡを抽出した。以後の操作は堆肥サンプルと同様におこなった。
得られた堆肥ＤＮＡ、活性汚泥ＤＮＡについての電気泳動の結果を図４５に示す。
また従来法と純度、収量の点で比較を行った。
従来法は１％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）の抽出液で６５℃における１時間インキュベート処理で加熱抽出操作を行い、その後１２０００×ｇ ２５℃ ５分間の遠心により上清を得た。（活性汚泥サンプルについては上記のように２％ＳＤＳ／２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）を等量添加して、抽出操作を行った。）この上清に対し、等量のクロロホルムを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後１２０００×ｇ ２５℃ ２０分間の遠心を行った。水相を回収し０．６倍量の２−プロパノールを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後、２００００×ｇ ４℃ ２０分間遠心を行い、ＤＮＡの沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄および乾燥後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させ、堆肥ＤＮＡ溶液、活性汚泥ＤＮＡ溶液とした。
ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法、従来法により得られた堆肥ＤＮＡの収量についての結果を図４６、純度についての結果を図４７に示す。また活性汚泥サンプルの重量についての結果を図４８、純度についての結果を図４９に示す。
（２）結果と考察
図４４より、ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法では１％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ ＥＤＴＡ／１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６），１％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）による抽出量が多かった。加熱抽出法ではそれほど大きな差はなかったが、１％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ ＥＤＴＡ／１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．６）の抽出量が最も多かった。
図４６より、収量において従来法よりも今回開発したＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法による堆肥からのＤＮＡの抽出量は高いことが明らかとなった。特にＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法による抽出量は多く、従来法との比較では３倍から６倍近い収量が得られた。
図４８より、活性汚泥からのＤＮＡ抽出量は従来の方法とほとんど変わらないことが示された。
図４７より、従来法に比較して、今回開発したＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法で堆肥から抽出したＤＮＡの純度ははるかに高いことが明らかとなった。
図４９より、活性汚泥から抽出したＤＮＡの純度についても今回開発したＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法により、はるかに純度の高いＤＮＡが得られることが明らかとなった。
以上のことから、今回開発したＤＮＡの精製、沈殿方法は堆肥サンプル、活性汚泥サンプルから高収量でＤＮＡを抽出することが可能であり、選択的にＤＮＡのみを抽出できることが示された。
湖底堆積物からのＤＮＡ抽出
本実施例では、湖底堆積物サンプルからＤＮＡ抽出を行った。
サンプルは６種類 上野公園 不忍池の３ヶ所，東京大学構内 三四郎池，東大農学部圃場 池 ２ヶ所より採取したものを使用した。
湖底堆積物サンプルは懸濁状態であったので５００μｌをサンプルとし、ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ処理、加熱抽出時に１％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）となるように、５００μｌの２％ＳＤＳ／２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）を添加し、ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ処理、加熱処理を行ってＤＮＡを抽出した。
ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇによる方法は４ｍ／ｓｅｃで３０秒間のＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ処理を行い、その後１２０００×ｇ２５℃ ５分間の遠心により上清を得た。この上清７５０μｌに対し１０％ＣＴＡＢ溶液２５０μｌおよび３．３３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ／１．６７Ｍ ＮａＣｌ溶液を２５０μｌ添加し、ｖｏｒｔｅｘ後等量のクロロホルムを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後１２０００×ｇ ２５℃ ２０分間の遠心を行った。水相を回収し等量の１２％ＰＥＧ／１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を添加し、ｖｏｒｔｅｘ後、２００００×ｇ４℃ ２０分間遠心を行い、ＤＮＡの沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄および乾燥後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させ、湖底堆積物ＤＮＡ溶液とした。
加熱処理法による抽出は６５℃において１時間インキュベート処理を行い、その後１２０００×ｇ ２５℃ ５分間の遠心により上清を得た。この上清７５０μｌに対し１０％ＣＴＡＢ溶液２５０μｌおよび３．３３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ／１．６７Ｍ ＮａＣｌ溶液を２５０μｌ添加し、ｖｏｒｔｅｘ後等量のクロロホルムを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後１２０００×ｇ ２５℃ ２０分間の遠心を行った。水相を回収し等量の１２％ＰＥＧ／１．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）を添加し、ｖｏｒｔｅｘ後、２００００×ｇ ４℃ ２０分間遠心を行い、ＤＮＡの沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄および乾燥後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させ、湖底堆積物ＤＮＡ溶液とした。
得られた湖底堆積物ＤＮＡについての電気泳動の結果を図５０に示す。
また従来法と純度、収量の点で比較を行った。
従来法は上記と同じくサンプル５００μｌに２％ＳＤＳ／２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．６）を等量添加して、６５℃ １時間の加熱操作により抽出操作を行った。この上清に対し、等量のクロロホルムを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後１２０００×ｇ ２５℃ ２０分間の遠心を行った。水相を回収し０．６倍量の２−プロパノールを添加し、ｖｏｒｔｅｘ後、２００００×ｇ ４℃ ２０分間遠心を行い、ＤＮＡの沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄および乾燥後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に溶解させ、湖底堆積物ＤＮＡ溶液とした。
ＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法、従来法により得られた湖底堆積物ＤＮＡの収量についての結果を図５１、純度についての結果を図５２に示す。
（２）結果と考察
図５１より、収量において従来法よりも今回開発したＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法による湖底堆積物からのＤＮＡの抽出量は高いことが明らかとなった。特にＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法による抽出量は多く、従来法との比較では３倍から７倍近い収量が得られた。
図５２より、従来法に比較して、今回開発したＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法で堆肥から抽出したＤＮＡの純度ははるかに高いことが明らかとなった。
これにより今回開発したＤＮＡ抽出法は従来法よりも高収量で湖底堆積物からＤＮＡを抽出可能であり、精製、沈殿方法は湖底堆積物サンプルから得たＤＮＡ抽出液から選択的にＤＮＡのみを取り出すことに極めて有効であることが示された。
以上のように今回開発したＤＮＡの抽出精製法は土壌以外の環境サンプルからもＤＮＡを高収量で抽出することが可能であり、得られたＤＮＡは従来法と比較して極めて純度の高いものが得られ、環境サンプル全般からのＤＮＡ抽出に適していると考えられた。
ＤＧＧＥ解析
本実施例では、今回開発した最終的な抽出精製方法を用いて、土壌、糞便、堆肥、活性汚泥、湖底堆積物からＢｅａｄｓＢｅａｔｉｎｇ法、加熱抽出法により抽出したＤＮＡサンプルについてＤＧＧＥ解析を行った。
ＤＮＡ溶液１μｌをを鋳型として、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３領域をＰＣＲにより増幅し、これをＤＧＧＥにより解析した。ＰＣＲ反応の条件および使用したプライマー、ＤＧＧＥの条件を以下に示す。
（１−１）ＰＣＲ
プライマーセット ３４１ＦＧＣ−５３４Ｒ
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ３領域を増幅
Figure 0004665124
反応条件は、まず９４℃で２．５分反応させた後、次に９４℃３０秒の変性、５５℃３０秒のアニーリング及び７２℃１分の伸長反応を１サイクルとしてこれを２５サイクル行い、最後に、７２℃で１０分反応させた。反応液組成は以下の通りである。
ＢＳＡを終濃度４００ｎｇ／μｌで含む。
Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｓｉｇｍａ）２．５ｕｎｉｔ
反応液 ５０μｌ
（１−２）ＤＧＧＥ
ゲル濃度 ８％
変性剤濃度勾配 ３５％〜６５％
Ｂｕｆｆｅｒ温度 ６０℃
電圧 １００Ｖ
泳動時間 １０時間
土壌ＤＮＡのＤＧＧＥ解析結果について図５３に示す。
糞便ＤＮＡのＤＧＧＥ解析結果について図５４に示す。
堆肥ＤＮＡ、活性汚泥ＤＮＡのＤＧＧＥ解析結果について図５５に示す。
湖底堆積物ＤＮＡのＤＧＧＥ解析結果について図５６に示す。
Figure 0004665124
Figure 0004665124
Figure 0004665124
Figure 0004665124
Figure 0004665124
Figure 0004665124
Figure 0004665124
Figure 0004665124
Figure 0004665124
本発明により、土壌からＤＮＡを高収率で、しかも高純度で回収し得る方法が提供される。本発明の方法により得られたＤＮＡにはほとんど夾雑物が混入しておらず、抽出および精製時のＤＮＡの損失を最小限に抑えることができている。また、本発明の実施に際し、特殊な技術を必要とせず、簡便でコストがかからない。従って、本発明の方法は土壌微生物の群集構造解析および学問分野として土壌微生物生態学、コンビナトリアル生物学（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）又はコンビナトリアル遺伝学（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）など環境ＤＮＡよりの新規遺伝子探索への利用が可能である点で極めて有用である。
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ

Claims (23)

  1. 環境サンプルからDNAを回収する方法であって、以下の工程：
    (a) ５％以下の界面活性剤と、250〜1500mMのリン酸緩衝液及び／又は200〜600mM EDTAとを含むDNA抽出液の存在下で環境サンプルを処理して該環境サンプルからDNAを抽出し、
    (b) 前記抽出されたDNAを、酸性側のpKaを有するpH緩衝液を含む塩溶液及びCTABの存在下、pH7.0未満の条件で精製し、並びに
    (c) 前記精製されたDNAを、ポリエチレングリコールの存在下、pH7.0以上の条件で沈殿させる
    工程を含む前記方法。
  2. 界面活性剤がSDS、Triton X-100及びN-ラウロイルサルコシンナトリウムからなる群から選ばれるいずれかのものである請求項１記載の方法。
  3. DNA抽出液のpHが７以上である請求項１記載の方法。
  4. 環境サンプルが、土壌、堆肥、水系堆積物、活性汚泥及び糞便からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１記載の方法。
  5. 環境サンプルの処理が、環境サンプルをbeads-beating処理及び／又は加熱処理するものである請求項１記載の方法。
  6. 塩が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも1つである請求項１記載の方法。
  7. CTABの濃度が1〜3％である請求項１記載の方法。
  8. 塩の濃度が0.7〜2.1Mである請求項１記載の方法。
  9. CTABの濃度が2〜3％であり、かつ、塩の濃度が1.0Mである請求項１記載の方法。
  10. ポリエチレングリコールの濃度が5〜7.5％である請求項１記載の方法。
  11. 環境サンプルからDNAを回収する方法であって、以下の工程：
    (a) 1％の界面活性剤、400mMのEDTA及び750mMのリン酸緩衝液を含むDNA抽出液の存在下で環境サンプルを処理してDNAを抽出し、
    (b) 前記抽出されたDNAと、2%のCTABと、酸性側のpKaを有するpH緩衝液を含む１Mの塩溶液とを混合し、pH7.0未満の条件でDNAを精製し、
    (c) 前記精製されたDNAを、ポリエチレングリコールの存在下、pH7.0以上の条件で沈殿させる
    工程を含む前記方法。
  12. 環境サンプルからDNAを回収する方法であって、以下の工程：
    (a) 1％の界面活性剤、300mMのEDTA及び250mMのリン酸緩衝液を含むDNA抽出液の存在下で環境サンプルをbeads-beating処理し、
    (b) 前記beads-beating処理後の抽出液を遠心し、
    (c) 得られる上清と、酸性側のpKaを有するpH緩衝液を含む１Mの塩溶液と、2%CTABとを混合し、pH7.0未満の条件でDNAを精製し、
    (d) 前記精製されたDNAを、ポリエチレングリコールの存在下、pH7.0以上の条件で沈殿させる
    工程を含む前記方法。
  13. 塩が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも１つである請求項11又は12に記載の方法。
  14. ポリエチレングリコールの濃度が5.0〜7.5％である請求項11又は12に記載の方法。
  15. (a) ５％以下の界面活性剤、アルカリ性緩衝液、並びに200〜1200mMのEDTA及び／又は250〜3000mMのリン酸緩衝液を含む、環境サンプルからのDNA抽出用試薬、
    (b) 酸性側のpKaを有するpH緩衝液を含む塩溶液、CTAB、又は当該塩溶液とCTABとの混合物を含む、前記抽出されたDNAの精製用試薬、並びに
    (c) アルカリ性緩衝液及びポリエチレングリコールを含む、前記精製されたDNAの回収用試薬
    を含む、環境サンプルからのDNA取得キット。
  16. さらにbeads-beating用ビーズを含む請求項15記載のキット。
  17. アルカリ性緩衝液がTris緩衝液である請求項15記載のキット。
  18. DNA抽出液のpHを7.0以上に調整することができる請求項15記載のキット。
  19. 酸性側のpKaを有するpH緩衝液が、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩酸緩衝液又は硫酸緩衝液である請求項15記載のキット。
  20. 塩が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム及びリン酸アンモニウムからなる群から選択される少なくとも1つである請求項15記載のキット。
  21. DNA精製用試薬のpHを7.0未満に調整することができる請求項15記載のキット。
  22. アルカリ性の緩衝液がTris緩衝液である請求項15記載のキット。
  23. DNA回収用試薬のpHを7.0以上に調整することができる請求項15記載のキット。
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