CN114107286A - 一种通用型土壤基因组dna提取试剂盒及其使用方法 - Google Patents
一种通用型土壤基因组dna提取试剂盒及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114107286A CN114107286A CN202111482405.XA CN202111482405A CN114107286A CN 114107286 A CN114107286 A CN 114107286A CN 202111482405 A CN202111482405 A CN 202111482405A CN 114107286 A CN114107286 A CN 114107286A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- supernatant
- soil
- centrifuging
- adsorption column
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000002689 soil Substances 0.000 title claims abstract description 69
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 193
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 84
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 55
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 29
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 27
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 24
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 17
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 claims description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 11
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims description 11
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 10
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 10
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 10
- 241000219991 Lythraceae Species 0.000 claims description 9
- 235000014360 Punica granatum Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 239000004576 sand Substances 0.000 claims description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 8
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 7
- PNGBYKXZVCIZRN-UHFFFAOYSA-M sodium;hexadecane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O PNGBYKXZVCIZRN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 4
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 3
- 238000007605 air drying Methods 0.000 claims description 2
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 239000003864 humus Substances 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008676 import Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 3-nitrobicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic acid Chemical compound C1C2C=CC1C(C(=O)O)C2(C(O)=O)[N+]([O-])=O QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000004021 humic acid Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000008239 natural water Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- -1 silt Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒及其使用方法，它涉及分子生物学领域，本发明要解决国内现有土壤基因组DNA提取试剂盒操作步骤繁冗、总DNA提取量低、提取质量差的问题；克服国外土壤基因组DNA提取试剂盒成本高、提取的DNA片段碎片化，不完整，适用土壤类型较少的问题。试剂盒分两种，一种包含溶液Q0、溶液Q1、溶液Q2、溶液Q3、溶液Q4、溶液Q5和溶液Q6；另一种包含溶液W1、溶液W2、溶液W3、溶液W4和溶液W5；本发明的试剂盒克服现有试剂盒操作步骤繁冗、总DNA提取量低、提取质量差、过度依赖酚氯仿此类有毒有害物质问题，操作过程简单快速，成分规避了有毒有害物质，获取的DNA纯度高，完整性好。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒及其使用方法。
背景技术
利用分子生物学手段阐释土壤、淤泥、自然水体等复杂环境的菌群结构及其演替过程，已经成为促进当今环境科学与工程深度研究和发展的新领域。分子生物学技术操作离不开基因组DNA的提取和制备，传统的人工DNA提取技术耗时长、操作繁琐、成本高且DNA总产率低，降低了环境样本的实际生物量，限制了后续的生物相分析结果。基于传统的人工DNA提取技术的缺点，德国、美国等欧美国家设计研发了通用型土壤基因组DNA提取试剂盒。目前市面上流通的通用型土壤基因组DNA提取试剂盒均为进口，具有广谱性强，可针对土壤、活性污泥、流域等环境样本的DNA提取，耗时短、操作简便且DNA总产率高的优点，然而仍存在(1)价格高昂，极大地增加了实验分析成本，(2)进口周期长，影响环境样本的时效性，极大地限制了实验结果的准确性、便捷性。
发明内容
本发明的目的是解决国内现有土壤基因组DNA提取试剂盒操作步骤繁冗、总DNA提取量低、提取质量差的问题；克服国外土壤基因组DNA提取试剂盒成本高、提取的DNA片段碎片化，不完整，适用土壤类型较少的问题，而提供一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒及其使用方法。
本发明的一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒，它包括研磨管、吸附柱、溶液Q0、溶液Q1、溶液Q2、溶液Q3、溶液Q4、溶液Q5和溶液Q6；
所述的吸附柱规格为2mL；
所述的研磨管内装1g石榴砂，直径为1-1.5mm；
所述的溶液Q0包括1.5-2.5M Tris-HCl、3-6M NaCl、10-20mM EDTA、20-50mM盐酸胍、250-300mM蛋白酶K和0.5-1M乙酸钾，pH＝7.5；
所述的溶液Q1包括1M Tris-NaOH和质量百分含量为2-5％十六烷基磺酸钠，pH＝8.0；
所述的溶液Q2包括100-200mM乙酸钾缓冲液和质量百分含量为1-3％聚乙烯吡咯烷酮水溶液，pH＝4.0；
所述的溶液Q3包括100-200mM乙酸钾缓冲液和质量百分含量为15-30％的硫酸镁溶液，pH＝3.0；
所述的溶液Q4包括0.5-1M异硫氰酸胍、5-7M乙酸钾和体积百分含量为30-50％异丙醇，pH＝5.0；
所述的溶液Q5包括50-100mM Tris-HCl、0.1-0.5mM EDTA和体积百分含量为60-75％乙醇，pH＝5.0；
所述的溶液Q6包括10-50mM Tris-HCl，pH＝5.0。
进一步地，所述的溶液Q0、Q1、Q2、Q3、Q4、Q5和Q6均用乙酸或氢氧化钠调节pH。
使用一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒的方法。
进一步地，所述的使用方法包括以下步骤：
(1)将土壤样品加入到研磨管中，混匀；
(2)加入试剂盒中的Q1溶液50-100μL，颠倒混匀；
(3)涡旋连续振荡5-15min；
(4)室温下，在12000r/min-15000r/min转速下振荡后的样品离心1-5min；
(5)转移上清液至一个干净的收集管中；
(6)加入100-500μL溶液Q2到上清液中，颠倒混匀，4℃孵育5-10min；其中，溶液Q2与上清液体积比为1：5；
(7)室温下，在12000r/min-15000r/min转速下离心1-5min，转移上清到新的收集管中；
(8)加入100-500μL溶液Q3到上清中，上下颠倒混匀，4℃孵育5-10min，室温下，在12000r/min-15000r/min转速下离心1-5min，转移上清到新的收集管中，加入Q4溶液1000-2000μL到上清中，上下颠倒混匀，加载500-1000μL上清到吸附柱中，室温下，在12000r/min-15000r/min转速下离心1-5min，弃去滤液，继续加载上清到吸附柱中，重复至过滤完所有上清；
(9)加500-1000μL溶液Q5到离心柱中，在12000r/min-15000r/min转速下离心1-5min，弃去滤液；重复操作一次，吸附柱放回到收集管中，在12000r/min-15000r/min转速下离心3-5min，转移离心柱到超净台上，晾干；
(10)离心柱转入到新的收集管中，加入50-200μL溶液Q6，在12000r/min-15000r/min转速下离心1-5min，弃去离心柱，收集管中的总DNA。
进一步地，所述的样品为花坛土、花盆土、农田土、山林土、河道淤泥或厌氧污泥。
本发明的一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒，它包括研磨管、吸附柱、溶液W1、溶液W2、溶液W3、溶液W4和溶液W5；
所述的吸附柱规格为2mL；
所述的研磨管内装1g石榴砂和0.8mL溶液，石榴砂的直径1-1.5mm；
0.8mL溶液包括2-5Mol的Tris，15-30mMol的EDTA、0.5-2Mol的盐酸胍、0.1-1mg/ml的蛋白酶K和1-5Mol的KCl，pH＝7-8；
所述的溶液W1包括100mMol的Tris、100mMol的NaCl和质量百分含量为5％的十六烷基磺酸钠，pH＝8.0；
所述的溶液W2包括100mMol的KCl缓冲液和15％的Al(OH)3溶液，pH＝3.0；
所述的溶液W3包括3Mol的盐酸胍、5Mol的KCl和体积百分含量为80％的乙醇，pH＝6.0；
所述的溶液W4包括50mMol的Tris、0.1mMol的EDTA和体积百分含量为75％的乙醇，pH＝5.0；
所述的溶液W5包括10mMol的Tris，pH＝8.0。
进一步地，所述的溶液W1、W2、W3、W4和W5均用乙酸或氢氧化钠调节pH。
进一步地，它是按照以下步骤进行的：
使用前先向溶液W4中加入无水乙醇，其中，溶液W4与无水乙醇的体积比为3:20；
(1)将土壤样品加入到研磨管中，加入溶液W1，颠倒混匀，其中，土壤样品与溶液W1的质量体积比为0.25g：60μl；
(2)将研磨管置于涡旋仪适配器上，涡旋振荡10min；
(3)在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；
(4)向上清液中加入溶液W2，颠倒混匀，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；其中，上清液与溶液W2的体积比为1：5；
(5)向步骤(4)的上清液中加入溶液W3，颠倒混匀，得上清液与溶液W3的混合液；取35～40％体积的上清液与溶液W3的混合液至吸附柱中，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；其中，上清液与溶液W3的体积比为1：5；
(6)再取步骤(5)的35～40％体积的上清液与溶液W3的混合液，重复步骤(5)的上吸附柱，离心收集上清液操作，直至步骤(5)中的上清液与溶液W3的混合液取完为止，合并收集上清液；其中，最后取上清液与溶液W3的混合液不足35～40％体积时，按照剩余实际体积的上清液与溶液W3的混合液上吸附柱；混合后上清液与溶液W3的混合液总体积大约2.1ml，每次上柱700μl，分三次上柱，完成全部混合液体的分离与纯化，分三次上柱可以让溶液里面的核酸充分的吸附到硅胶模上面，除去其它杂质；
(7)向步骤(6)过完的上清液与溶液W3的混合液的吸附柱中加入溶液W4，其中，上清液与溶液W4的体积比为1：1，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；
(8)重复步骤(7)操作一次；
(9)将步骤(8)的吸附柱放回到收集管中，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心3min，弃去收集管，转移吸附柱到超净台上，晾干；
(10)将步骤(9)晾干后的吸附柱转入新的收集管中，加入100μl溶液W5，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，弃去吸附柱，收集管中的样品冷冻保存于-80℃冰箱。
本发明包含以下有益效果：
本发明的通用型土壤基因组DNA提取试剂盒，克服了国内已有技术的操作步骤繁冗、总DNA提取量低、提取质量差等问题的，兼具进口试剂盒优势的同时，亦打破了国外技术的价格垄断，有效降低进口试剂盒所导致的高昂的实验成本。同时解决了进口试剂盒适用土壤类型少、DNA提取碎片化的缺点，具有操作简单和总DNA提取质量高的优点，有效提高了环境样品生物相分析实验的准确性、时效性和便捷性，为进一步促进中国环境科学与工程领域的发展提供了积极有效的影响。本试剂盒DNA提取时间为40min，进口试剂盒(Qiagen土壤DNA提取试剂盒)的DNA提取时间是90min。
本发明的试剂盒做出如下改进：
1、Q0的NaCl浓度增加至3-6M，促进核酸溶于高盐溶液，从而减少核酸的损失，提高DNA提取的准确性。
2、Q4的异硫氰酸胍浓度可以把核酸完整的保护并产出，提高DNA的纯度。
3、pH＝7.5条件下，Q0的乙酸钠与蛋白质可以快速结合，离心沉淀后，蛋白质随沉淀去除，保证核酸的快速提取。
W1是裂解微生物；W2是去除多糖，蛋白，保护核酸不被降解；W3是去除腐殖酸，保护核酸不被降解；W4是高盐保护核酸，促使核酸与硅胶模吸附；W5是核酸保护液，成功洗脱出核酸。
本试剂盒提取的操作流程简单、工序节省，总DNA杂质少、完整性好，可用于电泳、PQR、酶切、文库构建等分子生物学下游实验，在保证基因组提取效果的同时，完美替代价格昂贵的进口产品。
具有如下特点：
(1)本试剂盒适用于包括花坛土、花盆土、农田土、山林土、河道淤泥、厌氧污泥及其他复杂环境样本在内的基因组DNA的提取，应用范围广泛，解决进口试剂盒针对较复杂样本存在提取难的问题。国外试剂盒(Qiagen土壤DNA提取试剂盒)无法达到。
(2)根据紫外吸收法结果显示，通过本发明获得的DNA纯度高，抑制剂含量低，不存在无机盐污染，OD260/OD280≈1.8，OD260/OD280≈2.0，而进口试剂盒OD 260/OD280≈1.5，OD 260/OD 280≈1.5(无杂质的DNA的OD260/280在1.8-1.9，OD260/230应≥2.0)。
(3)根据琼脂糖凝胶电泳检测DNA结果显示，通过本发明获得的DNA完整性好，几乎不存在DNA片段碎片化问题，克服进口试剂盒的缺陷。本发明试剂盒采用腐殖物质去除材料，可高效专一的去除腐殖物质，同时利用硅胶柱吸附纯化DNA，保证基因组DNA的高纯度和完整。
(4)克服了国内已有技术操作步骤繁冗、总DNA提取量低、提取质量差、过度依赖酚氯仿此类有毒有害物质等问题，操作过程简单快速，成分组成上规避了有毒有害物质，获取的DNA纯度高，完整性好。
附图说明
图1是本发明的实施例一从0.25g各类土壤样本中提取基因组DNA的电泳检测图；
其中，M：脱氧核糖核酸分子量标准(DL 15000)；泳道1-6：1.花坛土；2.花盆土；3.农田土；4.林地土；5.河道淤泥；6.活性污泥；
图2为实施例二的革兰氏阴性和阳性细菌的总DNA的电泳检测图；其中，1,2为大肠杆菌；3,4为金黄色葡萄球菌，5,6为链球菌，7,8为棒状杆菌；
图3为本发明包含Q0至Q6溶液的试剂瓶照片；
图4为本发明包含W1至W5溶液的试剂瓶照片。
具体实施方式
本发明提出的通用型土壤基因组DNA提取试剂盒包括以下几种成分组成：
吸附柱
研磨管：内装1g石榴砂，直径为1-1.5mm；
溶液Q0：1.5-2.5M Tris-HCl、10-20mM EDTA、20-50mM盐酸胍、250-300mM蛋白酶K和0.5-1M乙酸钾，pH＝7.5；
溶液Q1：1M Tris-NaOH和质量百分含量为2-5％十六烷基磺酸钠，pH＝8.0；
溶液Q2：100-200mM乙酸钾缓冲液和质量百分含量为1-3％聚乙烯吡咯烷酮水溶液，pH＝4.0；
溶液Q3：100-200mM乙酸钾缓冲液和质量百分含量为15-30％的硫酸镁溶液，pH＝3.0；
溶液Q4：0.5-1M异硫氰酸胍、5-7M乙酸钾和体积百分含量为30-50％异丙醇，pH＝5.0；
溶液Q5：50-100mM Tris-HCl、0.1-0.5mM EDTA和体积百分含量为60-75％乙醇，pH＝5.0；
溶液Q6：10-50mM Tris-HCl，pH＝5.0。
溶液Q0、Q1、Q2、Q3、Q4、Q5和Q6均用乙酸或氢氧化钠调节pH。
本发明提出的通用型土壤基因组DNA提取试剂盒及其使用方法包括以下操作步骤：
(1)将样品加入到研磨管中，混匀；
(2)加入试剂盒中的Q1溶液60μL，上下颠倒混匀；
(3)涡旋连续振荡10min；
(4)室温下，13000r/min离心1min；
(5)转移上清至一个干净的收集管中；
(6)加入200μL溶液Q2到上清中，上下颠倒混匀，4℃孵育5min；
(7)室温下，13000r/min离心1min，转移上清到新的收集管中；
(8)加入200μL溶液Q3到上清中，上下颠倒混匀，4℃孵育5min，室温下，13000r/min离心1min，转移上清到新的收集管中，加入Q4溶液1200μL到上清中，上下颠倒混匀，加载710μL上清到吸附柱中，室温下，13000r/min离心1min，弃去滤液，继续加载上清到吸附柱中，重复至过滤完所有上清；
(9)加500μL溶液Q5到吸附柱中，13000r/min离心1min，弃去滤液；重复操作一次，吸附柱放回到收集管中，13000r/min离心3min，转移吸附柱到超净台上，晾干；
(10)吸附柱转入到新的离心管中，加入100μL溶液Q6，13000r/min离心1min，弃去吸附柱，收集管中的总DNA。
实施例一：分别从0.25g花坛土、花盆土、农田土、林地土、河道淤泥、活性污泥样本中提取基因组DNA。
本发明提出的通用型土壤基因组DNA提取试剂盒包括以下几种成分组成：
吸附柱
研磨管：内装1g石榴砂，直径为1-1.5mm；
溶液Q0：1.5-2.5M Tris-HCl、10-20mM EDTA、20-50mM盐酸胍、250-300mM蛋白酶K和0.5-1M乙酸钾，pH＝7.5；
溶液Q1：1M Tris-NaOH和质量百分含量为2-5％十六烷基磺酸钠，pH＝8.0；
溶液Q2：100-200mM乙酸钾缓冲液和质量百分含量为1-3％聚乙烯吡咯烷酮水溶液，pH＝4.0；
溶液Q3：100-200mM乙酸钾缓冲液和质量百分含量为15-30％的硫酸镁溶液，pH＝3.0；
溶液Q4：0.5-1M异硫氰酸胍、5-7M乙酸钾和体积百分含量为30-50％异丙醇，pH＝5.0；
溶液Q5：50-100mM Tris-HCl、0.1-0.5mM EDTA和体积百分含量为60-75％乙醇，pH＝5.0；
溶液Q6：10-50mM Tris-HCl，pH＝5.0。
溶液Q0、Q1、Q2、Q3、Q4、Q5和Q6均用乙酸或氢氧化钠调节pH。
本发明提出的通用型土壤基因组DNA提取试剂盒及其使用方法包括以下操作步骤：
(1)分别称取花坛土、花盆土、农田土、林地土、河道淤泥、活性污泥各0.25g，分别加入到研磨管中，混匀；
(2)加入试剂盒中的Q1溶液60μL，上下颠倒混匀；
(3)涡旋连续振荡10min；
(4)室温下，13000r/min离心1min；
(5)转移上清至一个干净的收集管中；
(6)加入200μL溶液Q2到上清中，上下颠倒混匀，4℃孵育5min；
(7)室温下，13000r/min离心1min，转移上清到新的收集管中；
(8)加入200μL溶液Q3到上清中，上下颠倒混匀，4℃孵育5min，室温下，13000r/min离心1min，转移上清到新的收集管中，加入Q4溶液1200μL到上清中，上下颠倒混匀，加载710μL上清到吸附柱中，室温下，13000r/min离心1min，弃去滤液，继续加载上清到吸附柱中，重复至过滤完所有上清；
(9)加500μL溶液Q5到吸附柱中，13000r/min离心1min，弃去滤液；重复操作一次，吸附柱放回到收集管中，13000r/min离心3min，转移吸附柱到超净台上，晾干；
(10)吸附柱转入到新的离心管中，加入100μL溶液Q6，13000r/min离心1min，弃去吸附柱，收集管中的总DNA。
实施例二
本实施例的一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒，包括研磨管、吸附柱、溶液W1、溶液W2、溶液W3、溶液W4和溶液W5；
所述的吸附柱规格为2mL；
所述的研磨管内装1g石榴砂，直径1-1.5mm；
0.8ml溶液包括2.5Mol的Tris，20mMol的EDTA、0.5Mol的盐酸胍、0.2mg/ml的蛋白酶K和2Mol的KCl，pH＝7.5；
所述的溶液W1包括100mMol的Tris、100mMol的NaCl和质量百分含量为5％的十六烷基磺酸钠，pH＝8.0；
所述的溶液W2包括100mMol的KCl缓冲液和15％的Al(OH)3溶液，pH＝3.0；
所述的溶液W3包括3Mol的盐酸胍、5Mol的KCl和体积百分含量为80％的乙醇，pH＝6.0；
所述的溶液W4包括50mMol的Tris、0.1mMol的EDTA和体积百分含量为75％的乙醇，pH＝5.0；
所述的溶液W5包括10mMol的Tris，pH＝8.0。
所述的溶液W1、W2、W3、W4和W5均用乙酸或氢氧化钠调节pH。
本实施例的一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒的使用方法，是按照以下步骤进行的：
使用前先向溶液W4中加入无水乙醇，其中，溶液W4与无水乙醇的体积比为3:20；
(1)将0.25g土壤样品加入到研磨管中，加入60μl溶液W1，颠倒混匀；
(2)将研磨管置于涡旋仪适配器上，涡旋振荡10min；
(3)在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；
(4)向上清液中加入200μl的溶液W2，颠倒混匀，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；转移上清(不超过900μl)到新的收集管中；
(5)向步骤(4)的上清液中加入1000μl溶液W3，颠倒混匀，得上清液与溶液W3的混合液；取710μl的上清液与溶液W3的混合液至吸附柱中，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；
(6)重复步骤(5)至过滤完所有上清液与溶液W3的混合液；
(7)向步骤(6)过完的上清液与溶液W3的混合液的吸附柱中加入500μl溶液W4，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；
(8)重复步骤(7)操作一次；
(9)将步骤(8)的吸附柱放回到收集管中，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心3min，弃去收集管，转移吸附柱到超净台上，晾干；
(10)将步骤(9)晾干后的吸附柱转入新的收集管中，加入100μl溶液W5，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，弃去吸附柱，收集管中的样品冷冻保存于-80℃冰箱。
图1和图2分别为实施例一从0.25g各类土壤样本中提取基因组DNA的电泳检测图；革兰氏阴性和阳性细菌的总DNA的电泳检测图；
由此可知，通过实施例一和二获得的DNA完整性好，几乎不存在DNA片段碎片化问题，克服进口试剂盒的缺陷。本发明试剂盒采用腐殖物质去除材料，可高效专一的去除腐殖物质，同时利用硅胶柱吸附纯化DNA，保证基因组DNA的高纯度和完整。
实施例一和二获得的DNA纯度高，抑制剂含量低，不存在无机盐污染，OD260/OD280≈1.8，OD260/OD280≈2.0，而进口试剂盒OD 260/OD 280≈1.5，OD 260/OD 280≈1.5(无杂质的DNA的OD260/280在1.8-1.9，OD260/230应≥2.0)。
Claims (8)
1.一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒，其特征在于它包括研磨管、吸附柱、溶液Q0、溶液Q1、溶液Q2、溶液Q3、溶液Q4、溶液Q5和溶液Q6；
所述的吸附柱规格为2mL；
所述的研磨管内装1g石榴砂，直径为1-1.5mm；
所述的溶液Q0包括1.5-2.5M Tris-HCl、3-6M NaCl、10-20mM EDTA、20-50mM盐酸胍、250-300mM蛋白酶K和0.5-1M乙酸钾，pH＝7.5；
所述的溶液Q1包括1M Tris-NaOH和质量百分含量为2-5％十六烷基磺酸钠，pH＝8.0；
所述的溶液Q2包括100-200mM乙酸钾缓冲液和质量百分含量为1-3％聚乙烯吡咯烷酮水溶液，pH＝4.0；
所述的溶液Q3包括100-200mM乙酸钾缓冲液和质量百分含量为15-30％的硫酸镁溶液，pH＝3.0；
所述的溶液Q4包括0.5-1M异硫氰酸胍、5-7M乙酸钾和体积百分含量为30-50％异丙醇，pH＝5.0；
所述的溶液Q5包括50-100mM Tris-HCl、0.1-0.5mM EDTA和体积百分含量为60-75％乙醇，pH＝5.0；
所述的溶液Q6包括10-50mM Tris-HCl，pH＝5.0。
2.根据权利要求1所述的一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒，其特征在于所述的溶液Q0、Q1、Q2、Q3、Q4、Q5和Q6均用乙酸或氢氧化钠调节pH。
3.使用权利要求1所述的一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒的方法。
4.根据权利要求3所述的一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将土壤样品加入到研磨管中，混匀；
(2)加入试剂盒中的Q1溶液50-100μL，颠倒混匀；
(3)涡旋连续振荡5-15min；
(4)室温下，在12 000r/min-15000r/min转速下振荡后的样品离心1-5min；
(5)转移上清液至一个干净的收集管中；
(6)加入100-500μL溶液Q2到上清液中，颠倒混匀，4℃孵育5-10min；其中，溶液Q2与上清液体积比为1：5；
(7)室温下，在12 000r/min-15000r/min转速下离心1-5min，转移上清到新的收集管中；
(8)加入100-500μL溶液Q3到上清中，上下颠倒混匀，4℃孵育5-10min，室温下，在12000r/min-15000r/min转速下离心1-5min，转移上清到新的收集管中，加入Q4溶液1000-2000μL到上清中，上下颠倒混匀，加载500-1000μL上清到吸附柱中，室温下，在12 000r/min-15000r/min转速下离心1-5min，弃去滤液，继续加载上清到吸附柱中，重复至过滤完所有上清；
(9)加500-1000μL溶液Q5到离心柱中，在12 000r/min-15000r/min转速下离心1-5min，弃去滤液；重复操作一次，吸附柱放回到收集管中，在12 000r/min-15000r/min转速下离心3-5min，转移离心柱到超净台上，晾干；
(10)离心柱转入到新的收集管中，加入50-200μL溶液Q6，在12 000r/min-15000r/min转速下离心1-5min，弃去离心柱，收集管中的总DNA。
5.根据权利要求3所述的一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒的使用方法，其特征在于所述的样品为花坛土、花盆土、农田土、山林土、河道淤泥或厌氧污泥。
6.一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒，其特征在于它包括研磨管、吸附柱、溶液W1、溶液W2、溶液W3、溶液W4和溶液W5；
所述的吸附柱规格为2mL；
所述的研磨管内装1g石榴砂和0.8mL溶液，石榴砂的直径1-1.5mm；
0.8mL溶液包括2-5Mol的Tris，15-30mMol的EDTA、0.5-2Mol的盐酸胍、0.1-1mg/ml的蛋白酶K和1-5Mol的KCl，pH＝7-8；
所述的溶液W1包括100mMol的Tris、100mMol的NaCl和质量百分含量为5％的十六烷基磺酸钠，pH＝8.0；
所述的溶液W2包括100mMol的KCl缓冲液和15％的Al(OH)3溶液，pH＝3.0；
所述的溶液W3包括3Mol的盐酸胍、5Mol的KCl和体积百分含量为80％的乙醇，pH＝6.0；
所述的溶液W4包括50mMol的Tris、0.1mMol的EDTA和体积百分含量为75％的乙醇，pH＝5.0；
所述的溶液W5包括10mMol的Tris，pH＝8.0。
7.根据权利要求6所述的一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒的使用方法，其特征在于所述的溶液W1、W2、W3、W4和W5均用乙酸或氢氧化钠调节pH。
8.使用权利要求6所述的一种通用型土壤基因组DNA提取试剂盒的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
使用前先向溶液W4中加入无水乙醇，其中，溶液W4与无水乙醇的体积比为3:20；
(1)将土壤样品加入到研磨管中，加入溶液W1，颠倒混匀，其中，土壤样品与溶液W1的质量体积比为0.25g：60μl；
(2)将研磨管置于涡旋仪适配器上，涡旋振荡10min；
(3)在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；
(4)向上清液中加入溶液W2，颠倒混匀，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；其中，上清液与溶液W2的体积比为1：5；
(5)向步骤(4)的上清液中加入溶液W3，颠倒混匀，得上清液与溶液W3的混合液；取35～40％体积的上清液与溶液W3的混合液至吸附柱中，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；其中，上清液与溶液W3的体积比为1：5；
(6)再取步骤(5)的35～40％体积的上清液与溶液W3的混合液，重复步骤(5)的上吸附柱，离心收集上清液操作，直至步骤(5)中的上清液与溶液W3的混合液取完为止，合并收集上清液；其中，最后取上清液与溶液W3的混合液不足35～40％体积时，按照剩余实际体积的上清液与溶液W3的混合液上吸附柱；
(7)向步骤(6)过完的上清液与溶液W3的混合液的吸附柱中加入溶液W4，其中，上清液与溶液W4的体积比为1：1，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，收集上清液；
(8)重复步骤(7)操作一次；
(9)将步骤(8)的吸附柱放回到收集管中，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心3min，弃去收集管，转移吸附柱到超净台上，晾干；
(10)将步骤(9)晾干后的吸附柱转入新的收集管中，加入100μl溶液W5，在温度为2-8℃、转速为13000rpm的条件下，离心1min，弃去吸附柱，收集管中的样品冷冻保存于-80℃冰箱。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111482405.XA CN114107286A (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 一种通用型土壤基因组dna提取试剂盒及其使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111482405.XA CN114107286A (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 一种通用型土壤基因组dna提取试剂盒及其使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114107286A true CN114107286A (zh) | 2022-03-01 |
Family
ID=80367504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111482405.XA Pending CN114107286A (zh) | 2021-12-06 | 2021-12-06 | 一种通用型土壤基因组dna提取试剂盒及其使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114107286A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115058415A (zh) * | 2022-08-18 | 2022-09-16 | 南京集思慧远生物科技有限公司 | 一种快速、高质量、通用型基因组dna提取试剂盒及dna提取方法 |
| CN115216472A (zh) * | 2022-09-06 | 2022-10-21 | 沈阳农业大学 | 一种从广泛物种和土壤中提取基因组dna的方法 |
| CN115532242A (zh) * | 2022-10-18 | 2022-12-30 | 广州美基生物科技有限公司 | 腐殖酸吸附剂及其制备方法土壤dna提取试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101935647A (zh) * | 2010-09-13 | 2011-01-05 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | 一种提取微生物dna的试剂盒及其方法 |
| CN102031252A (zh) * | 2010-11-09 | 2011-04-27 | 盎亿泰地质微生物技术（北京）有限公司 | 一种快速提取土壤总dna的方法 |
| CN102206630A (zh) * | 2011-04-12 | 2011-10-05 | 中国海洋大学 | 一种土壤和沉积物总dna提取方法及提取试剂盒 |
-
2021
- 2021-12-06 CN CN202111482405.XA patent/CN114107286A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101935647A (zh) * | 2010-09-13 | 2011-01-05 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | 一种提取微生物dna的试剂盒及其方法 |
| CN102031252A (zh) * | 2010-11-09 | 2011-04-27 | 盎亿泰地质微生物技术（北京）有限公司 | 一种快速提取土壤总dna的方法 |
| CN102206630A (zh) * | 2011-04-12 | 2011-10-05 | 中国海洋大学 | 一种土壤和沉积物总dna提取方法及提取试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TIEN,C.C.等: "Methods for DNA extraction from various soils: a comparison", 《JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY》, vol. 86, no. 6, 25 December 2001 (2001-12-25), pages 937 - 943 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115058415A (zh) * | 2022-08-18 | 2022-09-16 | 南京集思慧远生物科技有限公司 | 一种快速、高质量、通用型基因组dna提取试剂盒及dna提取方法 |
| CN115216472A (zh) * | 2022-09-06 | 2022-10-21 | 沈阳农业大学 | 一种从广泛物种和土壤中提取基因组dna的方法 |
| CN115532242A (zh) * | 2022-10-18 | 2022-12-30 | 广州美基生物科技有限公司 | 腐殖酸吸附剂及其制备方法土壤dna提取试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114107286A (zh) | 一种通用型土壤基因组dna提取试剂盒及其使用方法 | |
| Purdy et al. | Rapid extraction of DNA and rRNA from sediments by a novel hydroxyapatite spin-column method | |
| Steffan et al. | Recovery of DNA from soils and sediments | |
| Pitcher et al. | Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate | |
| Ogram et al. | The extraction and purification of microbial DNA from sediments | |
| Rajendhran et al. | Strategies for accessing soil metagenome for desired applications | |
| HELMS et al. | A new method for purifying lambda DNA from phage lysates | |
| CN108410861B (zh) | 一种皮张中古dna的提取方法及试剂盒 | |
| CN102031249A (zh) | 一种简易纯化核酸的方法 | |
| CN106399297B (zh) | 一种经济快速提取酒醅中微生物基因组dna的方法 | |
| CN110452902B (zh) | 一种革兰氏阴性菌全基因组dna提取试剂盒 | |
| CN111534509B (zh) | 用于深海微生物原位细胞裂解的组合物、试剂、试剂盒及应用 | |
| CN102533725A (zh) | 一体化缓冲液及使用该一体化缓冲液分离核酸的方法 | |
| KR100454869B1 (ko) | Ｄｎａ 추출용 세포 용해 버퍼 및 이를 이용한 ｄｎａ 추출방법 | |
| US20050164260A1 (en) | Rapid preparation of nucleic acids by enzymatic digestion | |
| CN111705053A (zh) | 一种快速提取细菌dna的试剂盒及提取方法 | |
| CN107151666A (zh) | 一种水体中微生物dna的提取方法 | |
| CN102807979A (zh) | 一种生物活性炭上微生物dna提取预处理方法 | |
| CN1884575B (zh) | 构建bac亚克隆库的方法 | |
| CN103333883B (zh) | 一种高效提取用于pcr扩增的地下水微生物dna的方法 | |
| CN111778237A (zh) | 一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系 | |
| CN112481252A (zh) | 一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法 | |
| CN115058415B (zh) | 一种快速、高质量、通用型基因组dna提取试剂盒及dna提取方法 | |
| CN116875590A (zh) | 一种基于纳米磁珠自动化提取土壤微生物dna试剂盒 | |
| CN109022426A (zh) | 一种提取牛樟芝总dna的试剂及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220301 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |