CN115216472A - 一种从广泛物种和土壤中提取基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，具体的说就是一种从广泛物种和土壤中提取基因组DNA的方法。现有的基因组DNA提取方法只适用于一个或几个物种，并且从土壤等特殊材料中提取DNA难以去除腐殖质﹑色素等污染物，影响基因组DNA质量。本发明设计的二氧化硅颗粒机械研磨和琼脂糖凝胶电泳相结合的DNA提取方法同时适用于从动物细胞﹑植物植物﹑微生物﹑土壤等广泛的材料中提取基因组DNA。该方法提取的基因组DNA质量高，没有降解现象发生，也没有腐殖质和色素等污染物。因此，本发明所涉及的方法将在分子生物学﹑遗传学等领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体的说就是一种从广泛物种和土壤中提取基因组DNA的方法，用于高效地提取动物、植物、微生物及宏基因组DNA。
背景技术
高质量基因组DNA以及宏基因组DNA的提取是基因扩增﹑基因文库构建﹑微生物种群鉴定等工作的前提和基础，同时对于遗传学﹑系统发育学和基因组学等方面的研究也具有重要意义。近年来，随着宏基因组DNA序列高通量测序以及宏基因组16s DNA测学被广泛应用于分析功能基因组成及微生物群落组成，因此提取获得的宏基因组DNA质量和代表性，直接影响着上述分析结果的可靠性。2017年，Costea等人在Nat Biotechnol.发表论文，表述了不同研究方法对DNA提取结果的巨大影响。在该研究中，21个实验室针对所收到的样本分别采用至少4种DNA提取方法进行实验。21个实验室所获得的DNA，被送至一家测序中心进行建库和测序，以排除实验测序阶段对结果的影响。结果表明，不同的DNA提取方法会明显影响样本中DNA的完整性、提取量、肠道菌群丰度和多样性指数的检测结果(Costea PI.etal.Nat Biotechnol.2017Nov；35(11):1069-1076)。这一结果充分表明，基因组DNA提取方法的重要性远远超过人们的预期，因此高效基因组DNA提取方法的价值值得被科研人员肯定和重视。目前基因组DNA和宏基因组DNA应用最广泛的是基于蛋白酶K的基因组提取试剂盒。近年来，也有一些基于石英砂﹑氧化锆颗粒﹑玻璃珠等材料通过机械方法进行细胞破碎，进行基因组DNA的提取(Amy Davis et al.Biotechniques.2019；66(6):285-289)。Fei等(2018年)采用不同方法提取DNA，并基于由五种等丰度口腔细菌组成的模拟群落，比较了Illumina MiSeq平台上的16S扩增子测序结果。结果表明DNA提取方法对观察到的细菌多样性产生了相当大的影响，而高变区的影响相对较小。在酶介导的DNA提取反应中添加珠子的方案比没有珠子或酶的方案产生更准确的细菌群落结构(Fei et al.Sci Rep.2018；8(1):1632116S)。Markusková et al.分析了DNA提取方法对基于16S rRNA的奶酪中细菌群落分析的影响。结果表明，与样品制备、DNA提取、引物选择、测序平台和数据分析相关的许多因素都会影响16S rRNA测序结果的准确性，但是DNA提取方法被认为是测序成功的关键，因为它可能是微生物组分析中较大变化的来源。结果还表明七种DNA提取程序中有六种能够提供适用于16S rRNA序列分析的可扩增细菌DNA，但单独的提取程序会导致不同的结果。当使用不同的DNA提取方案时，比较奶酪中细菌群落的数据存在风险，并强调了在需要跨多个测序运行进行比较时选择标准化方法的必要性(Barbora Markusková et al.J MicrobiolMethods.2021；184:106210)。
虽然基因组DNA提取已经有很多试剂盒可供选择，但是这些试剂盒本身比较昂贵，而且提取过程比较耗时，其中蛋白酶K的处理过程就需要花费数小时。此外，从植物细胞﹑动物细胞和微生物中提取基因组DNA由于存在方法上的差异，采用的试剂盒也各不相同。这样，同时提取不同物种的基因组DNA就需要购买不同的试剂盒，从而增加了科研的成本。因此，如果能设计一种成本低廉的基因组DNA提取方法，可以跨越物种界限，实现众多物种细胞内DNA的提取，将具有非常显著的应用价值。另外，以往的研究中，基因组DNA的提取和宏基因组DNA的提取往往采用截然不同的策略。宏基因组DNA是从土壤等环境条件下直接提取到的DNA。常用的土壤宏基因组DNA的提取方法是CTAB法。Verma等(2017)开发了一种从不同土壤样品中分离高分子量和优质宏基因组DNA的改进方法。该方案结合了酶(溶菌酶和蛋白酶K)和化学(CTAB和CaCl2)策略，以确保有效的细胞裂解，以及使用PEG和异丙醇沉淀不含腐殖质杂质的DNA。用改进的方法从花园、生活垃圾场、污水处理场和制革厂废物场收集的不同土壤中获得了高产量的优质宏基因组DNA(Verma SK et al.3Biotech.2017；7(3):171)。尽管该方法有成功的案例，但是在应对腐殖质土壤样品中污染物的去除方面，仍然存在一定问题。腐殖质在物理性质上与DNA有很多相似之处，所以分离起来非常困难。本发明则利用垫有硅胶膜的亲和纯化柱吸附和纯化DNA，并首次将琼脂糖凝胶电泳和胶回收法运用到宏基因组DNA的提取过程中，可以起到CTAB法难以获得的纯化效果。同时，本方法既可以从各种不同物种细胞中提取基因组DNA，又能从土壤等材料中提取宏基因组DNA，将为分子生物学实验室提供极大的便利。
发明内容
本发明旨在提供一种从广泛物种和土壤中提取基因组DNA的方法。将动物细胞﹑植物细胞﹑微生物或者土壤等样品与一定量的SDS和酚氯仿异戊醇混合(如果是动物细胞﹑植物植物或者微生物，则需要加入石英砂)，经过研钵研磨后者斡旋震荡后，冰上放置，然后离心取上清。上清液用0.6体积的异戊醇沉淀，并离心弃掉上清。沉淀溶解后，用高浓度的盐酸胍沉淀，并离心取上清。将上清液通过硅胶膜过滤柱，经过高浓度乙醇溶液清洗过滤柱后，用洗脱液洗脱DNA，即可获得基因组或宏基因组DNA。当土壤样品中腐殖质含量很高时，为了确保纯化效果，则将洗脱后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分离，并用胶回收试剂盒纯化，去除腐殖质污染，最终获得高纯度的宏基因组DNA。具体的提取过程如下：
1)不同待提DNA样品的准备：
①土壤样品的准备：2.5g土壤与2ml水混合，加入0.5ml 1mol/L浓度的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1.25ml的0.5mmol/L的EDTA，2ml酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，1.25ml 20％SDS。
②植物﹑动物﹑微生物样品的准备：200mg细胞悬浊于1.5ml的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，加入终浓度2mg/ml RNA酶和10mmol/L的EDTA，以及1ml酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)和3g石英砂。
2)将上述样品斡旋或者研磨5min，放置在冰上5min，然后高速离心，取清液，与0.6体积的异戊醇混合后，冰上放置30min。
3)上述样品高速离心，弃掉上清，沉淀用400μl的10mmol/L的Tris-HCl(pH8.5)缓冲液溶解沉淀，加入3倍体积的硅胶膜绑定液(5.5mol/L盐酸胍，20mmol/L Tris-HCl，pH6.6)。混合物冰上放置20min。
4)上述样品高速离心，取上清，上载到硅胶膜过滤柱上，再通过离心将DNA吸附到硅胶膜上。用清洗液(20mmol/L NaCl溶于2mmol/L Tris-HCl，pH7.5，然后四倍体积的乙醇混合配制而成)清洗3次，清洗过程均用离心法清除洗液。然后用10mmol/L的Tris-HCl(pH8.5)缓冲液洗脱绑定在硅胶膜上的DNA。
5)如果待提DNA的样品为土壤样品，特别是富含腐殖质的土壤样品，则用洗脱的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳分离，并用胶回收方法纯化宏基因组DNA。
本发明所涉及的一种从广泛物种和土壤中提取基因组DNA的方法具有显著的优势，具体表现为：
1)本发明所涉及的方法是首个既能从生物组织中提取基因组DNA，也能从土壤中提取宏基因组DNA的方法。这一特点使得该方法具有广泛的应用范围，也更加方便使用。
2)本发明所涉及的方法能够有效的去除土壤宏基因组DNA中的腐殖质等杂质，显著提高宏基因组DNA的纯度。本方法则可以通过特定的纯化步骤设计，有效清除商品试剂盒都难以彻底清除的腐殖质等污染物。
3)本发明所涉及的方法将琼脂糖凝胶电泳与亲和纯化相结合，应用到基因组DNA的纯化，起到了以往方法难以达到的纯化效果。这一策略对于相关领域的研究也有重要的参考价值。
4)本发明所涉及的方法提取宏基因组DNA的成功率高。由于不同来源的土壤内含物组成十分复杂，致使商品试剂盒在提取土壤宏基因组DNA的过程中也经常会失败。我们在使用本发明所涉及方法提取土壤宏基因组DNA的过程中，保持100％成功率。
5)本发明所涉及的方法提取土壤宏基因组DNA的用时相对较短。本方法提取基因组DNA，包括琼脂糖凝胶电泳在内，总共需要大约70min。而商品试剂盒提取土壤宏基因组DNA的过程中，由于需要蛋白酶K的作用，需要数个小时才能完成。
附图说明
图1用16s rDNA测序方法比较本方法与
细菌DNA提取试剂盒提取的细菌基因组DNA样品的丰度。(a)细菌DNA提取试剂盒和本方法提取到的DNA所属细菌从属于各级分类系统的数量；(b)韦恩图显示细菌DNA提取试剂盒和本方法提取的DNA所属的菌种的相对数量；(c)细菌DNA提取试剂盒和本方法提取的DNA样品所属菌种的吻合度。S1显示本方法提取DNA的相关数据；S2显示细菌DNA试剂盒提取DNA的相关数据。
图2本方法提取不同细菌基因组DNA的产率稳定性。(a)本方法从8种土壤微生物及其混合物种提取基因组DNA样品的琼脂糖凝胶电泳图；(b)本方法从8种土壤微生物及其混合物种提取基因组DNA样品的产率。每个样品检测重复3次，取平均值。M代表DNA marker，S1-S8代表8种土壤微生物，MS:上述8种土壤微生物的混合物。
图3本方法从不同植物细胞、动物细胞、微生物细胞中提取基因组DNA的效果分析。(a)本方法从不同植物细胞、动物细胞、微生物细胞中提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图；(b)OD值比值分析本方法从不同植物细胞、动物细胞、微生物细胞中提取的基因组DNA的纯度；(c)本方法从不同植物细胞、动物细胞、微生物细胞中提取基因组DNA为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。M代表DNA marker；各图中1代表大肠杆菌，2代表地衣芽孢杆菌，3代表毕赤酵母，4代表菠菜，5代表水晶鱼。
图4本方法与经典CTAB方法从高腐殖质土壤中提取宏基因组DNA效果的比较。(a)不同OD比值分析比较不同方法提取宏基因组DNA的纯度。其中1为本方法；2为经典CTAB方法；(b)不同方法提取宏基因组DNA酶切效果图。其中泳道1和4分别是经典CTAB方法和本方法提取的宏基因组DNA样品；泳道2和5分别是经典CTAB方法和本方法提取的宏基因组DNA与BamHI缓冲液混合后的样品；泳道3和6分别是经典CTAB方法和本方法提取的宏基因组DNA经BamHI酶切后的样品；泳道M是DNA marker；(c)不同方法提取宏基因组DNA作为模板PCR扩增的结果。泳道1是经典CTAB方法提取的DNA为模板的PCR产物；泳道2是本方法提取的DNA为模板的PCR产物；泳道3是未加入任何模板的PCR产物；泳道M是DNA marker。
具体实施方式
本发明旨在提供一种从广泛物种和土壤中提取基因组DNA的方法。具体实施例如下：
实施例1：用16s rDNA测序方法比较本发明所涉及的方法与
细菌DNA提取试剂盒提取的细菌基因组DNA样品的丰度
取沈阳市棋盘山森林公园林下土壤0.01g接种到LB培养基中震荡培养12h，转接到TB培养基中培养6h，离心收集菌体200mg，悬浊于1.5ml的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，加入终浓度2mg/ml RNA酶和10mmol/L的EDTA，1ml酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)以及3g 4-8mm的石英砂。样品斡旋5min，放置在冰上5min，然后高速离心，取清液，与0.6体积的异戊醇混合后，冰上放置30min。上述样品高速离心，弃掉上清，沉淀用400μl的10mmol/L的Tris-HCl(pH8.5)缓冲液溶解沉淀，加入3倍体积的硅胶膜绑定液(5.5mol/L盐酸胍，20mmol/LTris-HCl，pH6.6)。混合物冰上放置20min，然后高速离心，取上清，上载到硅胶膜过滤柱上，再通过离心将DNA吸附到硅胶膜上。用清洗液(20mmol/L NaCl溶于2mmol/LTris-HCl，pH7.5，然后四倍体积的乙醇混合配制而成)清洗3次，清洗过程均用离心法清除洗液。然后用50μl的10mmol/L的Tris-HCl(pH8.5)缓冲液洗脱绑定在硅胶膜上的DNA。作为对照，同样的细菌样品用
细菌DNA提取试剂盒提取DNA，具体操作参考说明书。将不同方法提取的宏基因组DNA样本送往生物公司(Genewiz，中国苏州)进行16s rDNA高通量测序，并用Illumina进行分析，确定土壤中的微生物组成。结果表明，本发明所涉及方法提取的宏基因组DNA在展现土壤微生物丰富度方面与试剂盒提取的DNA具有相似的效果(如图1-a，b，c所示)。但是本发明所涉及方法结果所展示的革兰氏阳性菌占比明显高于试剂盒产生的结果。
实施例2：本方法提取不同细菌基因组DNA的产率稳定性分析
取沈阳市棋盘山森林公园林下土壤0.01g溶于蒸馏水，经过梯度稀释后分别涂布在LB平板和YPD平板上。在上述平板上分别挑取4个菌落，共8个菌落，接种LB液体培养基，进行液体培养。培养结束后，离心收集每种菌体200mg，采用本发明所涉及的方法进行基因组DNA提取，具体方法参考实施例1。另外，离心收集每种菌体25mg，混合后作为第9个样品，采用上述相同方法提取基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳分析上述9个样品的质量。结果表明，9个样品中提取得到的DNA都有较好的质量，电泳图谱显示其DNA大小均大于12kb，而且没有明显的弥散条带产生(图2-a)。另外，9个样品中提取DNA的产率都在300-400μg/g菌体的范围内(图2-b)。而且混合物质9号样品中提取到的DNA量基本接近8个菌体单独提取获得DNA产率的平均值。这些结果都表明，本提取方法具有较高的DNA产率，良好的可重复性和稳定性。
实施例3：本方法从不同植物细胞、动物细胞、微生物细胞中提取基因组DNA的效果分析
在LB培养基中培养地衣芽孢杆菌、大肠杆菌和毕赤酵母到对数生长期(OD600＝0.4-0.6)离心后收集菌体200mg；取清洗干净的银鱼和菠菜各200mg。上述样品采用本发明所涉及的方法进行基因组DNA提取，具体方法参考实施例1。用NanoDrop分光光度计测定提取到的DNA的OD260/OD230以及OD260/OD280的值，从而确定DNA的纯度。然后以上述基因组DNA为模板，进行PCR扩增16s-rDNA或者18s rDNA保守区段，并进行电泳验证。结果表明，从不同物种中提取的基因组DNA电泳后的条带均大于12kb，而且没有明显的弥散条带(图3-a)。同时，提取到的DNA的OD260/OD230以及OD260/OD280的值与理论值相符，表明提取的DNA纯度较高(图3-b)。此外，以上述基因组DNA为模板PCR扩增16s rDNAs或18s rDNAs保守序列区段均获得成功(图3-c)，进一步证明该方法从不同物种中提取的基因组DNA均有较高的质量。
实施例4：本方法与经典CTAB方法从高腐殖质土壤中提取宏基因组DNA效果的比较
取来自沈阳棋盘山森林公园的林下土壤2.5g与2ml水混合，加入0.5ml 1mol/L浓度的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，1.25ml的0.5mmol/L的EDTA，2ml酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，1.25ml20％SDS。将上述样品研磨5min，放置在冰上5min，然后高速离心，取清液，与0.6体积的异戊醇混合后，冰上放置30min。上述样品高速离心，弃掉上清，沉淀用400μl的10mmol/L的Tris-HCl(pH8.5)缓冲液溶解沉淀，加入3倍体积的硅胶膜绑定液(5.5mol/L盐酸胍，20mmol/LTris-HCl，pH6.6)。混合物冰上放置20min。上述样品高速离心，取上清，上载到硅胶膜过滤柱上，再通过离心将DNA吸附到硅胶膜上。用清洗液(20mmol/L NaCl溶于2mmol/L Tris-HCl，pH7.5，然后四倍体积的乙醇混合配制而成)清洗3次，清洗过程均用离心法清除洗液。然后用10mmol/L的Tris-HCl(pH8.5)缓冲液100μl洗脱绑定在硅胶膜上的DNA。用洗脱的样品进行琼脂糖凝胶电泳分离，并用胶回收方法纯化宏基因组DNA。作为对照，同样的土壤样品用CTAB方法进行了宏基因组DNA提取(Verma SK etal.3Biotech.2017；7(3):171)。
在此基础上，对不同方法提取的宏基因组DNA进行了OD比值分析(图4-a)，结果表明本方法提取的DNA样品的几组OD比值均与理论值接近，表明其DNA纯度较高，腐殖质污染被有效去除。相反，CTAB方法提取到的DNA样品的几组OD比值均显著低于理论值，表明该方法提取的DNA中含有较多的污染物。对不同方法提取的宏基因组DNA进行了酶切(图4-b)，结果表明本方法提取到的DNA能被有效酶切成弥散条带，而CTAB方法提取的DNA则无法被有效酶切。这可能是由于CTAB方法提取的DNA中的腐殖质等杂质对酶切过程产生了强烈的抑制作用。以不同方法提取的宏基因组DNA为模板进行PCR扩增(图4-c)，结果表明只有本方法提取到的DNA为模板能够扩增出明显的目的条带。这一结果表明CTAB方法提取的DNA中的腐殖质等杂质对PCR反应也有强烈的抑制作用，同时也进一步说明了去除DNA中杂质的必要性。
Claims (4)
1.一种从广泛物种和土壤中提取基因组DNA的方法，其特征在于：在基因组DNA提取过程中，用苯酚/氯仿/异戊基抑制DNase活性，用二氧化硅颗粒破坏细胞壁，用垫有硅胶膜的亲和纯化柱吸附和纯化DNA，用琼脂糖凝胶电泳和胶回收法最终纯化获得高质量的基因组DNA或者宏基因组DNA。
2.权利要求1所述的一种从广泛物种和土壤中提取基因组DNA的方法，其特征在于：同时适用于从动物细胞﹑植物植物﹑微生物等材料中提取基因组DNA，还适用于从土壤中提取高质量的宏基因组DNA。
3.权利要求1所述的一种从广泛物种和土壤中提取基因组DNA的方法，其特征在于：与常用的提取宏基因组DNA的商品试剂盒相比，本方法更有利于客观分析样品中各菌种的丰富度，特别有利于提高宏基因组库中厚壁革兰氏阳性菌DNA的占比。
4.权利要求1所述的一种从广泛物种和土壤中提取基因组DNA的方法，其特征在于：将琼脂糖凝胶电泳和胶回收法用于基因组DNA的纯化。作为结果，获得比商品试剂盒更高效的纯化效果，完全去除宏基因组DNA样品中的腐殖质和色素等顽固污染物，显著提高宏基因组DNA的提取质量。
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