CN101696410B

CN101696410B - 一种适用于底泥中微生物群落结构分析的dna提取方法

Info

Publication number: CN101696410B
Application number: CN2009101806300A
Authority: CN
Inventors: 赵大勇
Original assignee: Hohai University HHU
Current assignee: Hohai University HHU
Priority date: 2009-10-26
Filing date: 2009-10-26
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2029-10-26
Also published as: CN101696410A

Abstract

一种底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法，提取步骤为：用TENPbuffer清洗底泥样品，将清洗好的底泥样品悬浮于PBS buffer中；将预处理的底泥样品反复冻溶后加入溶菌酶，向底泥样品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠，所得样品在室温下离心后取上清液，向其中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，振荡混匀，所得样品室温下离心后取液相，向液相中加入等体积的氯仿∶异戊醇混合液，所得样品室温下离心后取液相，向液相中加入预冷的异丙醇；所得样品离心去上清，向沉淀中加入预冷的乙醇洗涤沉淀三次，再离心去乙醇；将样品在空气中自然风干，用TE缓冲液溶解DNA保存。

Description

一种适用于底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法

技术领域

本发明属于环境微生物生态学技术领域，具体涉及一种适用于底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法。

背景技术

河流或湖泊中的底泥是生态系统的重要组成部分，也是大量微生物类群的栖息地，这些微生物类群在湖泊进化演替以及营养元素循环等方面发挥着重要的作用。当前，有关底泥中的微生物群落结构组成的研究已成为微生物生态学研究中的热点领域。但是，由于自然界中存在的许多微生物不可培养，依靠传统的显微镜观察和分离培养来研究微生物的方法难以快速、全面的对湖泊沉积物中的微生物进行研究。近年来，随着分子生物学技术的发展，产生了一些新的微生物生态学研究方法，如：自动核糖体基因间隙分析(Automated ribosomal intergenicspacer analysis，ARISA)，变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)以及末端限制性片段长度多态性(Terminal restrictionfragment length polymorphisms，T-RFLP)等，这些方法的共同之处是突破了原有的微生物分离培养的过程限制，能够更加全面的分析自然界中存在的各种微生物。另外，这些基于核酸的分子生物学技术一般需要先从底泥中提取出DNA，然后再进行进一步的分子生物学研究。因此，DNA提取质量的好坏，会直接影响到微生物群落结构的分析结果。通常底泥成分复杂，难以直接提取到高浓度、高质量的DNA。另外，底泥中包含的腐质酸、重金属等物质会干扰后续的PCR反应，必须在DNA提取阶段予以去除。目前大多数学者使用的DNA提取方法有的无法有效去除底泥中的腐质酸等干扰物质，给后续的PCR扩增带来困难，有的需要使用高成本的核酸吸附柱。因此，探索简便、高效、低成本的DNA提取方法仍然是微生物生态学研究所面临的难题。

发明内容

技术问题：本发明提供了一种从底泥中提取DNA的简便、高效的方法，可直接用于底泥中微生物群落结构的分析。

技术方案：一种底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法，提取步骤为：

a.用TENP buffer清洗底泥样品，将清洗好的底泥样品悬浮于PBSbuffer中；

b.将经步骤a预处理的底泥样品在-80℃和65℃反复冻溶后加入溶菌酶，在37℃水浴1h，所述溶菌酶最终浓度为1mg/mL；

c.向底泥样品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠，在55℃水浴1.5h，所述蛋白酶K最终浓度为0.2mg/mL，所述十二烷基磺酸钠最终浓度为1％(w/v)；

d.步骤c所得样品在室温下离心后取上清液，向其中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，振荡混匀，所述混合液中各物质的体积比为25∶24∶1；

e.步骤d所得样品室温下离心后取液相，向液相中加入等体积的氯仿∶异戊醇混合液，混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；

f.步骤e所得样品室温下离心后取液相，向液相中加入预冷的异丙醇在-20℃沉淀2h；

g.步骤f所得样品在4℃条件下离心去上清，向沉淀中加入预冷的乙醇洗涤沉淀三次，再离心去乙醇；

h.将样品在空气中自然风干，用TE缓冲液溶解DNA保存于-20℃。

一种底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法，提取步骤为：称取0.5g湿重的底泥样品置于5mL灭菌后的离心管中，加入3mL TENP buffer，所述TENP buffer的配方为50mM Tris，200mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mLPVPP，pH10.0，漩涡振荡8min，10000rpm离心5min，弃上清，在沉淀中再加3mL TENP buffer，按上述方法再洗涤两次，最后加3mL的PBS buffer，所述PBS buffer配方为8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，溶于1L水中，pH7.4；将预处理之后的沉积物样品置于-80℃和65℃反复冻溶三次，向样品中加入溶菌酶，溶菌酶的终浓度为1mg/mL，在37℃水浴1h；向样品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠，蛋白酶K的终浓度为0.2mg/mL，十二烷基磺酸钠的终浓度为1％(w/v)，在55℃水浴1.5h，每10～15min轻轻倒置离心管几次，混匀；样品在室温下10000rpm离心5min，取出500μL上清液置于一新离心管中，向其中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，轻轻振荡、混匀；室温下14000rpm离心25min，取出400μL水相置于一新离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇混合液，氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；室温下14000rpm离心25min，取出300μL水相置于一新离心管中，加入200μL预冷的异丙醇，在-20℃沉淀2h；在4℃条件下，14000rpm离心25min，去上清，向沉淀中加入1mL 70％体积浓度的冷乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心10min，去乙醇，再用同样方法洗涤沉淀两次；倒掉乙醇，在空气中自然风干，用50μL TE缓冲液溶解DNA，保存于-20℃，所述TE缓冲液配方为10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0。

有益效果：本方法可有效去除底泥中存在的腐质酸等杂质，为后续的PCR扩增实验的顺利开展提供了有利的条件。

本方法操作简便，所用到的试剂均为常规生化试剂，不需要使用价格昂贵的DNA吸附柱，降低了实验成本。

附图说明

图1为应用本方法提取得到的DNA电泳图谱；其中：1～8号泳道为某湖泊不同采样点底泥样品中提取得到的DNA条带，9号泳道为λ-Hind III DNAMarker，最大片段为23.1Kb。

图2为应用本方法提取的DNA为模版，采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增得到的电泳图谱。其中：1～8号泳道分别为应用提取的1～8号总DNA进行PCR扩增所得的电泳条带，9号用到为DL 2000DNA Marker。

图3为应用其它方法提取得到的DNA电泳图谱；其中：1～8号泳道为某湖泊不同采样点底泥样品中提取得到的DNA条带，9号泳道为λ-Hind III DNAMarker，最大片段为23.1Kb。

具体实施方式

材料

(1)湖泊底泥样品；

(2)三羟基甲基氨基甲烷，乙二铵四乙酸，聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，蛋白酶K，溶菌酶，十二烷基磺酸钠，酚，氯仿，RNase A，异戊醇，异丙醇，无水乙醇；

(3)TENP缓冲液：50mM Tris，200mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mLPVPP，pH10.0；

(4)PBS缓冲液：8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，溶于1L水中，pH7.4；

(5)DNA抽提缓冲液：100mM Tris-HCl，100mM EDTA，100mMNa₃PO₄，1.5MNaCl，1％CTAB(w/v)。

DNA纯度的检测方法：用分光光度计测定OD₂₆₀/OD₂₈₀，与标准值进行比较。

实施例1

称取0.5g底泥样品(湿重)置于5mL灭菌后的离心管中，加入3mL TENPbuffer，漩涡振荡8min，10000rpm离心5min，弃上清，在土壤颗粒沉淀中再加3mL TENP buffer，按上述方法再洗涤两次，最后加3mL的PBS buffer。将预处理之后的底泥样品置于-80℃和65℃反复冻溶三次，向样品中加入溶菌酶(最终浓度为1mg/mL)，在37℃水浴1h。向样品中加入蛋白酶K(最终浓度为0.2mg/mL)和十二烷基磺酸钠(SDS)(最终浓度为1％，w/v)，在55℃水浴1.5h(每10～15min轻轻倒置离心管几次，混匀)。在室温下10000rpm离心5min，取出500μL上清液置于一新离心管中，向其中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液(体积比为25∶24∶1)，轻轻振荡、混匀。室温下14000rpm离心25min，取出400μL水相置于一新离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇混合液(体积比为24∶1)。室温下14000rpm离心25min，取出300μL水相置于一新离心管中，加入200μL预冷的异丙醇，在-20℃沉淀2h。在4℃条件下，14000rpm离心25min，去上清，向沉淀中加入1mL 70％体积浓度的冷乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心10min，去乙醇，再用同样的方法洗涤沉淀两次。倒掉乙醇，在空气中自然风干，用50μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解DNA，保存于-20℃。

将提取得到的总DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果在紫外灯下拍照，图谱见图1。

用紫外分光光度计测定所提取的DNA在260nm和280nm处的吸光度，计算出OD₂₆₀/OD₂₈₀的平均值为1.82，属于纯DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀≈1.8的范围，可直接用于后续的PCR扩增反应。

实施例2

将实施例1中提取得到的DNA作为聚合酶链式反应(PCR)的模板，使用美国Bio-Rad公司的PCR扩增仪，采用细菌的16S rRNA基因V3区的通用引物对GC-F341和R518进行扩增，引物具体序列为：F341(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)；R518(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，GC发卡结构(5′-CGCCCGCCGCGCGCG GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGC-3′)。(上海生工生物工程技术服务有限公司提供)

50μL的PCR反应体系包括：DNA模板50ng、正反向引物各20pmol、200μM dNTP、10×PCR buffer(不含MgCl₂)5μL、1.5mM的MgCl₂、1U的ExTaqDNA聚合酶和适量的双蒸水补足50μL。

PCR反应采用降落式PCR策略，即：94℃预变性5min，前20个循环为94℃1min，65～55℃1min和72℃3min(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，后10个循环条件为94℃1min，55℃1min和72℃3min，最后在72℃下延伸8min，4℃保存。PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果在紫外灯下拍照，图谱见图2。从图中可以看出，采用实施例1所述方法提取得到的DNA经PCR扩增后都得到了清晰、明亮的条带，说明按实施例1所述方法提取得到的DNA可直接用于PCR扩增。

实施例3

称取0.5g底泥样品(湿重)，同时加入5mL DNA抽提缓冲液(100mMTris-HCl，pH8.0，100mM EDTA，pH8.0，100mM Na₃PO₄缓冲液，pH8.0，1.5M NaCl，1％CTAB，w/v)和蛋白酶K(终浓度为200μg/mL)，混合均匀，于摇床中水平振荡(37℃，225rpm)约30min后，加入1mL TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)和溶菌酶(终浓度为1mg/mL)，继续振荡30min，再加0.5mL 20％(W/V)的SDS，经65℃水浴30min后加入2％的PVPP(w/v)，10000rpm离心10min，将上清液移入新的离心管，沉淀重复抽提2次，步骤为：往沉淀中加入DNA抽提缓冲液及20％的SDS(w/v)，65℃水浴10min，10000rpm离心10min，收集3次抽提的上清液于同一离心管中，加入RNaseA(终浓度为200μg/mL)，在37℃下作用15min，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液轻轻混匀，15000rpm离心15min，将上层水相移入新的离心管，加入0.6倍体积异丙醇，于-20℃中沉淀1h。在4℃，12000rpm条件下离心10min，弃上清，沉淀用70％体积浓度乙醇洗两次，溶解于50μL TE缓冲液中，于-20℃保存。

将提取得到的总DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果在紫外灯下拍照，图谱见图3。

用紫外分光光度计测定所提取的DNA在260nm和280nm处的吸光度，计算出OD₂₆₀/OD₂₈₀的平均值为1.66，说明其中含有蛋白等杂质。

序列表

<110>河海大学

<120>一种适用于底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法

<130>

<141>2009-10-22

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>人工引物

<400>1

cctacgggag gcagcag 17

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工引物

<400>2

attaccgcgg ctgctgg 17

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggc 40

Claims

1.一种底泥中微生物群落结构分析的DNA提取方法，其特征在于提取步骤为：称取0.5g湿重的底泥样品置于5mL灭菌后的离心管中，加入3mLTENP buffer，所述TENP buffer的配方为50mM Tris，200mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mL PVPP，pH10.0，漩涡振荡8min，10000rpm离心5min，弃上清，在沉淀中再加3mL TENP buffer，按上述方法再洗涤两次，最后加3mL的PBS buffer，所述PBS buffer配方为8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，溶于1L水中，pH7.4；将预处理之后的沉积物样品置于-80℃和65℃反复冻融三次，向样品中加入溶菌酶，溶菌酶的终浓度为1mg/mL，在37℃水浴1h；向样品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠，蛋白酶K的终浓度为0.2mg/mL，十二烷基磺酸钠的终浓度为1％，在55℃水浴1.5h，每10～15min轻轻倒置离心管几次，混匀；样品在室温下10000rpm离心5min，取出500μL上清液置于一新离心管中，向其中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1，轻轻振荡、混匀；室温下14000rpm离心25min，取出400μL水相置于一新离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇混合液，氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；室温下14000rpm离心25min，取出300μL水相置于一新离心管中，加入200μL预冷的异丙醇，在-20℃沉淀2h；在4℃条件下，14000rpm离心25min，去上清，向沉淀中加入1mL 70％浓度的冷乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心10min，去乙醇，再用同样方法洗涤沉淀两次；倒掉乙醇，在空气中自然风干，用50μLTE缓冲液溶解DNA，保存于-20℃，所述TE缓冲液配方为10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0。