CN104911178A

CN104911178A - 同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外dna的方法

Info

Publication number: CN104911178A
Application number: CN201510344497.3A
Authority: CN
Inventors: 沈亮; 图姆斯基·斯巴图·海伯特马里安; 袁霞; 卢英华; 王远鹏; 何宁
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2015-06-19
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2015-09-16

Abstract

同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，属于污水处理技术领域。先预处理；再分离胞内和胞外DNA，然后分别提取纯化胞内DNA和胞外DNA。可以从活性污泥法等生物处理污水样品中同时提取胞内和胞外DNA并进行准确定量，收率高，纯度高，并且菌体裂解的交叉污染小，简单易行，非常适合对含大量微生物的污水样品进行对比实验和科学研究使用，也具有开发加工成商业分析试剂盒的应用前景。

Description

同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法

技术领域

本发明属于污水处理技术领域，涉及微生物胞内和胞外DNA的提取方法，尤其是涉及一种同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法。

背景技术

通过微生物降解可溶性和悬浮性有机污染物是目前污水处理厂的核心工艺，最有代表性的即活性污泥法。只要为微生物提供适宜的生长环境，微生物充分生长，就可以最大限度的去除有机污染物，提高出水水质。换言之，微生物的数量和类别直接决定了污水生物处理的效果。而污水中微生物群落结构复杂，传统的微生物纯种培养方法费时费力且效果不佳，故目前关于环境微生物的研究大都采用以DNA为基础的分子生物学技术研究。同时，尽管胞外DNA在水体中数量极低且容易分解,一些胞外DNA也被发现对于环境微生物群体和污水处理效果有重要作用。当前胞外DNA对环境的影响越来越受到重视，但是胞外DNA提取工艺的研究很少，特别针对污水生物处理水样同时提取其中胞内胞外DNA的方法更是未见报道。

现有活性污泥DNA提取的方法中，一般是通过简单的污水水样预处理(如离心、过滤)等收获微生物泥渣，然后采用溶菌酶、珠磨、冻融等手段破胞释放胞内DNA，再进一步提取纯化(王爱杰，张运晴，阚洪静，刘充.一种厌氧活性污泥DNA的提取方法[P].中国，2009:CN101392248A；赵晓祥，张湾，邓航.一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法[P].中国，2013:CN103215254A)，这时甚至可以使用一些市售的DNA提取试剂盒。这样的污泥DNA提取流程，并没有特别考虑胞外基因问题，胞外DNA被当作杂质在预处理过程中被清除，或者仅提取样品总DNA不区分来源于胞内或胞外。因此，若要同时提取污水水样中的胞内和胞外DNA，面临很多困难，首先污水生物处理中的水样，除了含有微生物絮体，还有其他一些固体杂质，胞外DNA分子容易吸附在这些固体颗粒上，很难获得。其次，如同时提取污水水样中的胞内胞外DNA，还需防止污水微生物细胞裂解后的胞内DNA污染胞外DNA。

但目前尚未见适于同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于从污水生物降解工艺过程中的水样同时提取其中微生物胞内和胞外DNA的方法。

本发明包括以下步骤：

1、预处理

取污水样品10mL，加入NaH₂PO₄溶液和聚乙烯基吡咯烷酮，常温条件下放置摇床震荡混匀，得预处理样品；

2、分离胞内和胞外DNA

1)将步骤1预处理所得样品进行离心，得到沉淀物A和上清液A；

2)将步骤1)所得沉淀物A重悬于NaH₂PO₄溶液中，得重悬液A；

3)将步骤1)所得上清液A用无菌滤膜过滤，收集滤液放冰盒内保藏，含截留物的滤膜重悬于NaH₂PO₄溶液中震荡，滤膜洗脱截留物后弃除，得重悬液B；

4)合并重悬液A和重悬液B，再重复步骤1)～3)，得到重悬液C，另将冰盒内保藏的样品合并得总滤液；

5)将重悬液C和总滤液分别进行离心，分别得到沉淀物B1和沉淀物B2，以及上清液B1和上清液B2；将沉淀物B1和沉淀物B2合并，得沉淀物C，沉淀物C用于提取胞内DNA，将上清液B1和上清液B2合并，得上清液C，上清液C用于提取胞外DNA；

3、提取纯化胞内DNA

1)将沉淀物C加入DNA提取缓冲液和玻璃珠,涡旋震荡，然后加入SDS缓冲液，得混合液；

2)将步骤1)得到的混合液采用冻融法破胞，即将混合液交替进行液氮浴和水浴，然后进行离心，离心后所得上清液D置于冰盒内保藏，离心后所得沉淀物D重悬于DNA提取缓冲液中，得重悬液D；

3)将重悬液D进行涡旋震荡后水浴，再加入SDS缓冲液，然后水浴，接着离心，将离心后所得上清液E置于冰盒内保藏；

4)对上清液E采用商用试剂盒纯化DNA，得到胞内DNA；

4、提取纯化胞外DNA

将步骤2中的步骤5)所得上清液C加入CTAB后水浴，接着离心，离心后转移上清液，然后利用商用试剂盒纯化其中DNA，得到胞外DNA。

下面进一步给出较佳的附加技术条件：

在步骤1中，所述NaH₂PO₄溶液为0.12M，pH 8.0；NaH₂PO₄溶液加入量9～11mL；所述聚乙烯基吡咯烷酮加入量为0.5～1.5g。

在步骤2中，所述NaH₂PO₄溶液为0.12M，pH 8.0；所述无菌滤膜的孔径为≥0.22μm；所述重复步骤1)～3)的次数可为1～5次；所述离心的条件为：离心温度4℃，离心力≥10000g，离心时间10～20min。

在步骤3中，其中步骤1)使用的DNA提取缓冲液成分包括100mM Tris-HCl、100mMNa₂-EDTA、100mM Na3PO4、1.5M NaCl、1％CTAB以及0.001～0.1mg/mL蛋白酶K；DNA提取缓冲液的加入量是3～5mL；所述玻璃珠的直径为1mm，玻璃珠加入量是0.5～1g；所述SDS缓冲液为浓度10％SDS缓冲液，10％SDS缓冲液加入量为1～3mL；其中步骤2)所述将混合液交替进行液氮浴和水浴的次数可为1～5次；所述液氮浴的时间为1min，水浴的温度为60℃，水浴的时间为20min；所述离心的条件为：离心温度4℃，离心力≥13000g，离心时间≥20min；其中步骤3)所述涡旋震荡的转速为2500rpm，时间为5min，水浴的温度为37℃，水浴的时间为2h；所述SDS缓冲液为浓度10％SDS缓冲液，10％SDS缓冲液加入量是1～3mL。

在步骤4中，所述CTAB的浓度为1％(w/v)，1％CTAB的加入量与上清液C的体积比为1∶1；水浴的温度为65℃，水浴的时间为30min；所述离心的条件为：离心温度4℃，离心力≥13000g，离心时间≥20min。

与现有技术比较，本发明的有益效果如下：

本发明可以从活性污泥法等生物处理污水样品中同时提取胞内和胞外DNA并进行准确定量，收率高，纯度高，并且菌体裂解的交叉污染小，简单易行，非常适合对含大量微生物的污水样品进行对比实验和科学研究使用，也具有开发加工成商业分析试剂盒的应用前景。在步骤1中加入NaH₂PO₄和聚乙烯基吡咯烷酮，不仅可以去除腐殖酸等杂质，而且对菌体细胞有保护缓冲作用，防止细胞裂解造成胞内DNA污染胞外DNA。解决了目前胞外DNA容易被胞内DNA污染，不宜获得的难题。在其它步骤中使用离心和过滤等物理手段，可避免使用化学方法对DNA造成污染，同时NaH₂PO₄溶液对菌体细胞有保护缓冲作用。在步骤3中的步骤1)中使用的SDS缓冲液对污水中高浓度的菌体有很好的裂解效果，充分提高了DNA的回收率。步骤4提取胞外DNA过程中采用CTAB法，未添加其他对DNA有吸附作用的物质，利用高速离心一次性沉淀杂质，充分避免了胞外DNA的损失。

附图说明

图1是本发明实施例1提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图。在图1中，泳道1是胞内DNA，泳道2是胞外DNA。

图2是本发明实施例2提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图。在图2中，泳道1是胞内DNA，泳道2是胞外DNA。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

利用膜生物反应器(membrane bioreactor,MBR)处理生活污水时，分析膜生物反应器内部水样的胞内和胞外DNA含量。

使用8L浸没式中空纤维膜MBR，连续曝气200L/h，HRT为24h，污泥负荷0.24kg COD/kgVSS·d，常温下稳定运行。取10mL MBR内部混合液进行提DNA操作，混合液样品含较多活性污泥，颜色为浅褐黄色。

MBR混合液中加入10mL NaH₂PO₄溶液(0.12M,pH 8.0)和1g聚乙烯基吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrolidone,PVPP)，常温条件下放置摇床(250rpm)震荡10min混匀。

接着样品进行离心(10000g,4℃,10min)，离心上清液进一步用无菌滤膜(孔径0.22μm)，离心和过滤得到沉淀物用NaH₂PO₄(0.12M,pH 8.0)重悬后重复离心和过滤操作3次。合并全部滤液，同时与最后一次的重悬液分别进行离心(10000g,4℃,20min)，各自得到沉淀物和上清液。两者的沉淀物合并用于提取胞内DNA，两者的上清液合并用于提取胞外DNA。

所得沉淀物加入4mL DNA提取缓冲液(成分为100mM Tris-HCl,100mM Na₂-EDTA,100mM Na₃PO₄,1.5M NaCl,1％CTAB,0.050mg/mL蛋白酶K)和0.5g直径1mm的玻璃珠,涡旋震荡(2500rpm)10min。然后加入1mL SDS缓冲液(10％)，采用冻融法破胞即将混合液交替置于液氮(1min)和60℃水浴(20min)3次后，将混合液离心(13000g,4℃,20min)。离心后上清液置于冰盒内保藏，沉淀物重悬于2mL的DNA提取缓冲液涡旋震荡(2500rpm)5min后37℃水浴2h。在重悬液中加入1mL SDS(10％)，置于60℃水浴(20min)，接着离心(13000g,4℃,20min)，离心后上清液置于冰盒内保藏，最后合并冰盒内保藏的上清液，利用DNA Isolation试剂盒纯化DNA,用Nanodrop分光光度计检测该污水样品胞内DNA的含量为9.15±0.77μg/mL，260nm吸光度与280nm吸光度之比1.86。

所得上清液加入1％CTAB置于65℃水浴(30min)，接着离心(13000g,4℃,20min)，离心后转移上清液，利用DNA Isolation试剂盒纯化DNA，用Nanodrop分光光度计检测该污水样品胞外DNA的含量为2.63±0.33μg/mL，260nm吸光度与280nm吸光度之比为1.87。

实施例2

利用膜生物反应器(membrane bioreactor,MBR)处理生活污水时，分析膜生物反应器出水样的胞内和胞外DNA含量。

本实施例与实施例1不同之处在于污水样品来源于反应器出水，颜色较清澈，微生物含量少，故离心和过滤得到沉淀物用NaH₂PO₄(0.12M,pH 8.0)重悬后重复离心和过滤的操作仅1次，且采用冻融法破胞即将混合液交替置于液氮(1min)和60℃水浴(20min)仅1次，其他操作与实施例1相同，最后得到水样中胞内DNA的含量为0.091±0.013μg/mL，胞外DNA的含量为0.064±0.032μg/mL，260nm吸光度与280nm吸光度之比为1.45和1.55。

实施例3

利用纯水水样作为空白对照，采用与实施例1相同步骤提取胞内和胞外DNA的含量均为0。

实施例4

利用纯水添加1.07±0.31×10⁹/mL的E.coli细胞(含DNA5.63μg/mL)的水样作为胞内DNA可能污染胞外DNA的对照，采用和实施例1相同的步骤提取胞内和胞外DNA，其含量分别为3.77±0.23μg/mL和0。

Claims

1.同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)预处理

2)分离胞内和胞外DNA

(1)将步骤1)预处理所得样品进行离心，得到沉淀物A和上清液A；

(2)将步骤(1)所得沉淀物A重悬于NaH₂PO₄溶液中，得重悬液A；

(3)将步骤(1)所得上清液A用无菌滤膜过滤，收集滤液放冰盒内保藏，含截留物的滤膜重悬于NaH₂PO₄溶液中震荡，滤膜洗脱截留物后弃除，得重悬液B；

(4)合并重悬液A和重悬液B，再重复步骤(1)～(3)，得到重悬液C，另将冰盒内保藏的样品合并得总滤液；

(5)将重悬液C和总滤液分别进行离心，分别得到沉淀物B1和沉淀物B2，以及上清液B1和上清液B2；将沉淀物B1和沉淀物B2合并，得沉淀物C，沉淀物C用于提取胞内DNA，将上清液B1和上清液B2合并，得上清液C，上清液C用于提取胞外DNA；

3)提取纯化胞内DNA

(1)将沉淀物C加入DNA提取缓冲液和玻璃珠,涡旋震荡，然后加入SDS缓冲液，得混合液；

(2)将步骤(1)得到的混合液采用冻融法破胞，即将混合液交替进行液氮浴和水浴，然后进行离心，离心后所得上清液D置于冰盒内保藏，离心后所得沉淀物D重悬于DNA提取缓冲液中，得重悬液D；

(3)将重悬液D进行涡旋震荡后水浴，再加入SDS缓冲液，然后水浴，接着离心，将离心后所得上清液E置于冰盒内保藏；

(4)对上清液E采用商用试剂盒纯化DNA，得到胞内DNA；

4)提取纯化胞外DNA

将步骤2)中的步骤(5)所得上清液C加入CTAB后水浴，接着离心，离心后转移上清液，然后利用商用试剂盒纯化其中DNA，得到胞外DNA。

2.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述NaH₂PO₄溶液为0.12M，pH 8.0；NaH₂PO₄溶液加入量9～11mL；所述聚乙烯基吡咯烷酮加入量为0.5g～1.5g。

3.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述NaH₂PO₄溶液为0.12M，pH 8.0；所述无菌滤膜的孔径为≥0.22μm；所述重复步骤(1)～(3)的次数为1～5次；所述离心的条件为：离心温度4℃，离心力≥10000g，离心时间10～20min。

4.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特征在于，在步骤3)中，其中步骤(1)使用的DNA提取缓冲液成分包括100mM Tris-HCl、100mM Na₂-EDTA、100mM Na3PO4、1.5M NaCl、1％CTAB以及0.001～0.1mg/mL蛋白酶K；DNA提取缓冲液的加入量是3～5mL；所述玻璃珠的直径为1mm，玻璃珠加入量是0.5～1g；所述SDS缓冲液为浓度10％SDS缓冲液，10％SDS缓冲液加入量为1～3mL。

5.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特征在于，在步骤3)中，其中步骤(2)所述将混合液交替进行液氮浴和水浴的次数为1～5次；所述液氮浴的时间为1min，水浴的温度为60℃，水浴的时间为20min；所述离心的条件为：离心温度4℃，离心力≥13000g，离心时间≥20min。

6.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特征在于，在步骤3)中，其中步骤(3)所述涡旋震荡的转速为2500rpm，时间为5min，水浴的温度为37℃，水浴的时间为2h；所述SDS缓冲液为浓度10％SDS缓冲液，10％SDS缓冲液加入量是1～3mL。

7.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述CTAB的质量百分浓度为1％，1％CTAB的加入量与上清液C的体积比为1∶1；水浴的温度为65℃，水浴的时间为30min；所述离心的条件为：离心温度4℃，离心力≥13000g，离心时间≥20min。