CN109321562B

CN109321562B - 沉积物中dna的预处理方法

Info

Publication number: CN109321562B
Application number: CN201811160620.6A
Authority: CN
Inventors: 范俊韬; 闫振广; 郑欣; 郭芬; 王鹏远
Original assignee: Chinese Research Academy of Environmental Sciences
Current assignee: Chinese Research Academy of Environmental Sciences
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: CN109321562A

Abstract

本发明公开了一种沉积物中DNA的预处理方法，具体步骤如下：取5～10kg沉积物，加入4～6倍重量的水，搅拌混匀，沉降15～20min；(2)取上清5～10L，加入100～200g明矾，100～200g焦磷酸钠，搅拌混匀，沉降10～15min；(3)取上清3～6L，加入50～100g Tris，40～80g聚乙烯吡咯烷酮，23～47g NaCl，2～4g Triton X‑100，搅拌混匀，沉降15～20min；(4)取上清1.5～3L，提取DNA。本发明提供的一种大量沉积物中DNA的预处理方法，不仅能获得高纯度DNA，还能够准确反映物种的多样性。

Description

沉积物中DNA的预处理方法

技术领域

本发明涉及一种沉积物中DNA的预处理方法，属于环境科学与生物工程技术领域。

背景技术

环境样品是一种十分复杂的体系，一般由多种生物组成且化学成分复杂，如河流底泥是由细菌等微生物和原生动物、后生动物等微型动物组成的生态系统与胶体物质结合所形成的絮状体颗粒。因此，环境样品具有菌群结构多样、菌群功能复杂、可能含有腐殖酸、有机物、重金属等DNA杂交和PCR扩增抑制剂等特点。

以往提取河流底泥DNA，都是称取少量底泥用于提取DNA，而且底泥中的悬浮物、胶体物质、硫化物、腐殖质等对溶菌酶、蛋白酶K和Taq酶的活性有抑制作用，导致提取的DNA涵盖的物种少，纯度不够，不能准确地反映底泥中物种的多样性。

因此，提供一种大量沉积物中DNA的预处理方法，获得能够准确反映物种多样性且纯度高的DNA，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种大量沉积物中DNA的预处理方法，用来解决提取的DNA涵盖的物种少，纯度不够，不能准确地反映河流环境样品中物种多样性的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种沉积物中DNA的预处理方法，具体步骤如下：

(1)取5～10kg沉积物，加入4～6倍重量的水，搅拌混匀，沉降15～20min；

(2)取上清5～10L，加入100～200g明矾，100～200g焦磷酸钠，搅拌混匀，沉降10～15min；

(3)取上清3～6L，加入50～100g Tris，40～80g聚乙烯吡咯烷酮，23～47g NaCl，2～4g TritonX-100，搅拌混匀，沉降15～20min；

(4)取上清1.5～3L，经0.22um灭菌膜过滤，收集滤膜，将其剪碎置于无菌离心管中，加入无菌水，涡旋震荡，离心，取上清液，提取DNA。

优选地，步骤(1)所述沉积物为河流底泥。

优选地，步骤(3)中还加入50～100g脱脂奶粉。

优选地，步骤(4)取上清1.5～3L，经0.22um灭菌膜过滤，收集滤膜，将其剪碎置于10mL无菌离心管中，加入2～4mL无菌水，涡旋震荡5～10min，8000～12000rpm离心5～10min，取上清液，提取DNA。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种沉积物中DNA的预处理方法，先通过悬浮沉降去除大部分泥沙，然后利用明矾沉降细菌、藻类、泥沙、粘土等悬浮物，焦磷酸钠不仅能与金属离子生成络合物，还能作为分散剂将微生物与沉积物分离开；聚乙烯吡咯烷酮能与腐殖酸形成稳定的复合物，且聚乙烯吡咯烷酮的聚合度高，不溶性复合物即沉降到容器底部。本发明提供的一种沉积物中DNA的预处理方法，对大量沉积物进行预处理，去除悬浮物、腐殖质等影响DNA提取的物质，确保提取的DNA不仅纯度高，而且能够准确反映物种的多样性，避免因沉积物采样过少导致的物种多样性降低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1附图为本发明沉积物中DNA样品1-4的PCR扩增图；

其中，M：DL2000DNA Marker；1：以沉积物中DNA样品4为模板，引物1为引物扩增；2：以沉积物中DNA样品4为模板，引物2为引物扩增；3-5：分别以沉积物中DNA样品1-3为模板，引物1为引物扩增；6-8：分别以沉积物中DNA样品1-3为模板，引物2为引物扩增。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1沉积物中DNA的预处理

沉积物中DNA的预处理方法，具体步骤如下：

(1)取5kg河流底泥，加入4倍重量的水，搅拌混匀，沉降15min；

(2)取上清5L，加入100g明矾，100g焦磷酸钠，搅拌混匀，沉降10min；

(3)取上清3L，加入50g Tris，40g聚乙烯吡咯烷酮，23g NaCl，2g Triton X-100，50g脱脂奶粉，搅拌混匀，沉降15min；

(4)取上清1.5L，经0.22um灭菌膜过滤，收集滤膜，将其剪碎置于10mL无菌离心管中，加入2mL无菌水，涡旋震荡10min，8000rpm离心10min，取上清液，用于提取DNA。

实施例2沉积物中DNA样品的提取

取实施例1获得的上清液2mL，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1的混合液，上下颠倒抽提；12000rpm离心10min，取上清；用氯仿∶异戊醇＝24∶1的混合液再抽提一次，12000rpm离心10min，取上清液；向抽提后的上清液中加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的异丙醇，-20℃放置1h；12000rpm离心20min，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀1-2次，自然风干，用50μL TE溶解，得DNA。

TE溶液包括pH 8.0的10mmol/L Tris-HCl和pH8.0的1mmol/L EDTA。

实施例3沉积物中DNA样品的检测

上述实施例1和2，分别取3份5kg的河流底泥进行操作，获得3份沉积物中DNA样品；用紫外分光光度计分别测定3份沉积物中DNA样品的OD₂₆₀/OD₂₃₀、OD₂₆₀/OD₂₈₀值，结果见下表：

沉积物中DNA样品	OD<sub>260</sub>/OD<sub>230</sub>	OD<sub>260</sub>/OD<sub>280</sub>
			沉积物中DNA样品1	1.98	1.75
沉积物中DNA样品2	1.95	1.68
			沉积物中DNA样品3	1.91	1.72

3份沉积物中DNA样品的OD₂₆₀/OD₂₃₀值均接近2.0，说明提取的DNA溶液中腐殖酸含量较低；OD260/OD280值均接近1.8，表明提取的DNA溶液中蛋白质含量较低。

实施例4沉积物中DNA样品用于PCR检测

以上述提取的3份沉积物中DNA样品为模板，利用16S rDNA引物：

正向引物341-F：5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，SEQ ID NO：1；

反向引物534-R：5’-ATTACCGCGGCTGCTGGCA-3’，SEQ ID NO：2，进行PCR扩增。

PCR反应体系如下：ddH₂O 14.3ul，DNA 1ul，10×PCRbuffer 2ul，10mM dNTP0.5ul，100uM 341-F 1ul，100uM 534-R 1ul，5U/ul Taq Enzyme 0.2ul。

PCR反应程序如下：95℃预变性5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。

3份沉积物中DNA样品扩增的目的DNA片段大小均为193bp，表明采用本发明的DNA预处理方法处理后，提取的DNA能够用于PCR检测。

实施例5沉积物中DNA样品中泥鳅和大鳞副泥鳅的鉴定

分别针对泥鳅和大鳞副泥鳅设计特异性引物，泥鳅的特异性引物(引物1)序列如下：

F1：5’-GCGCATCTGTAGACCTTACCA-3’；SEQ ID NO：3；

R1：5’-TGGCCGAAGAATCAGAACAAGT-3’；SEQ ID NO：4；

扩增产物长301bp；

大鳞副泥鳅的特异性引物(引物2)序列如下：

F2：5’-TCAGACACCCTTATTTGTCTGAGC-3’；SEQ ID NO：5；

R2：5’-GGATAACAATTTCACACAGGACTTC-3’；SEQ ID NO：6；

扩增产物长212bp。

以提取的沉积物中DNA样品1-3为模板，利用泥鳅和大鳞副泥鳅的特异性引物分别进行PCR扩增；

PCR反应体系为：25mmol/L MgCl₂1.5ul，10mmmol/L dNTP 0.5ul，上下游引物各0.5ul(每种引物终浓度0.2ummol/L)，5U/ul Taq Enzyme 0.5ul，10×PCRbuffer 3ul，模板DNA 1ul，加水补足至20ul。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃50s，60℃1min，72℃45s，25个循环；72℃延伸10min。

1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，沉积物中DNA样品1-3利用泥鳅和大鳞副泥鳅的特异性引物进行PCR扩增，分别获得300bp左右和200bp左右的条带，与预期条带大小一致，表明沉积物中DNA样品1-3中含有泥鳅和大鳞副泥鳅的DNA。

对比例

取1-2g河流底泥，采用常规方法提取DNA，以获得的沉积物中DNA样品4为模板，采用实施例5的方法进行PCR扩增，结果如图1所示，利用泥鳅和大鳞副泥鳅的特异性引物进行PCR扩增，均没有获得扩增条带，表明沉积物中DNA样品4中没有泥鳅和大鳞副泥鳅的DNA。

结果表明，本发明对大量河流底泥进行预处理，可以避免因沉积物采样过少导致的物种多样性降低。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国环境科学研究院

<120> 沉积物中DNA的预处理方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cctacgggag gcagcag 17

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

attaccgcgg ctgctggca 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gcgcatctgt agaccttacc a 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tggccgaaga atcagaacaa gt 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tcagacaccc ttatttgtct gagc 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ggataacaat ttcacacagg acttc 25

Claims

1.一种沉积物中DNA的预处理方法，其特征在于，具体步骤如下：

(3)取上清3～6L，加入50～100g Tris，40～80g聚乙烯吡咯烷酮，23～47g NaCl，2～4gTritonX-100，搅拌混匀，沉降15～20min；

2.根据权利要求1所述的一种沉积物中DNA的预处理方法，其特征在于，步骤(1)所述沉积物为河流底泥。

3.根据权利要求1所述的一种沉积物中DNA的预处理方法，其特征在于，步骤(3)中还加入50～100g脱脂奶粉。

4.根据权利要求1所述的一种沉积物中DNA的预处理方法，其特征在于，步骤(4)取上清1.5～3L，经0.22um灭菌膜过滤，收集滤膜，将其剪碎置于10mL无菌离心管中，加入2～4mL无菌水，涡旋震荡5～10min，8000～12000rpm离心5～10min，取上清液，提取DNA。