CN116837135A - 一种鉴定川贝母的引物及其基于位点特异性pcr技术的川贝母鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定川贝母的引物及其基于位点特异性PCR技术的川贝母鉴定方法，所述鉴定川贝母的引物包括：上游引物BM‑Z‑F1：5’‑GCACTATGCCCGCCCTGTC‑3’，下游引物BM‑Z‑R1：5’‑GGTCATTGGGCACGGAGCG‑3’。本发明的特异性引物能够快速准确地鉴别出川贝母，并与其常见混伪品浙贝母、平贝母、伊犁贝母、新疆贝母和湖北贝母进行区分。本发明提供的鉴定方法仅通过PCR过程即可实现川贝母的真伪鉴定，简单高效且成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及中药分子鉴定技术方法，具体为一种鉴定川贝母的引物及其基于位点特异性PCR技术的川贝母鉴定方法。
背景技术
贝母是常用止咳化痰中药，2020年版《中国药典》收载了川贝母、平贝母、浙贝母、湖北贝母、伊贝母5个品种。其中川贝母来源于卷叶贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、太白贝母和瓦布贝母的鳞茎。中医认为川贝母的临床疗效优于其他贝母，且毒性低，自然资源有限，生长周期长，这使得川贝母的市场价格远远高于其他贝母，从而导致川贝母遭受过度无序采挖，野生资源日益匮乏，各种代用品不断出现，假冒伪劣现象频繁发生，因此进行川贝母的真伪鉴别研究至关重要。
传统的川贝母鉴别方法包括性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别等。形态鉴别主观性较大，对鉴定者的经验要求较高；理化鉴别中代谢物质易受生长环境、采收加工、运输及储藏等因素的影响。而遗传物质DNA不受发育阶段、加工状态、季节、环境等影响，多态性丰富、遗传稳定、准确性高，在中药鉴定方面展现出明显的优势。
近年来，DNA分子标记技术被广泛用于物种鉴定、系统发育等领域，开发出了DNA条形码、RAPD、PCR-RFLP、SSR等多种鉴别方法。2015版《中国药典》收载了PCR-RFLP技术用于川贝母的真伪鉴定，但该技术需对扩增产物进行酶切操作，技术要求较高，耗时较长；另外，川贝母DNA条形码的研究需对扩增产物进行测序比对，耗时长，费用高。因此，建立一种高效、简便的特异性PCR鉴别方法具有重要意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种检测川贝母的特异性PCR引物，以及用该特异性PCR引物快速、准确地检测川贝母的方法。
技术方案：本发明所述的用于鉴定中药川贝母的引物对，所述引物包含如下序列：
上游引物：BM-Z-F1：5’-GCACTATGCCCGCCCTGTC-3’；
下游引物：BM-Z-R1：5’-GGTCATTGGGCACGGAGCG-3’。
所述的用于鉴定中药川贝母的引物对在川贝母的真伪鉴定中的应用。
所述的应用，所述川贝母的品种包括：卷叶贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、太白贝母和瓦布贝母。
基于位点特异性PCR技术的川贝母鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取川贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，使用所述的引物对进行PCR反应；
(3)对(2)所得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判定样品是否为川贝母。
所述的方法，步骤(1)中，利用CTAB法提取川贝母样品的基因组DNA。
所述的方法，具体步骤包括：取样品粉末置于离心管中，利用核洗脱液洗至上清无色，离心后使用移液枪小心弃去上层清液，再使用CTAB法提取样品总DNA。
所述的方法，所述使用CTAB法提取样品总DNA具体包括以下步骤：沉淀加入CTAB溶液充分混匀，置50～70℃水浴0.5～1.5h，取出，振荡后离心，上清液转移至离心管中，加入氯仿-异戊醇混合液充分混匀，离心，重复上述操作，离心后上清液转移至离心管中，加入异丙醇，于-10℃～-30℃孵化5～20min，取出离心，沉淀使用乙醇洗涤，将乙醇挥干后加入水溶解。优选地，氯仿-异戊醇的体积比为20∶1～30∶1，更优选地，氯仿-异戊醇的体积比为24∶1。
所述的方法，步骤(2)中，所述PCR反应条件为：90～96℃预变性3-8min；90～96℃变性25-35s，60～68℃退火40～50s，70～75℃延伸0.5～1.5min，25～30个循环，70～75℃延伸3～8min；PCR反应体系包括：Premix TaqTM、上游引物、下游引物、DNA模板、水，其中，所述DNA模板为步骤(1)提取所得的DNA。优选地，所述PCR反应条件为：94～95℃预变性4～6min；94～95℃变性28～32s，63～65℃退火42～47s，71～73℃延伸0.8～1.2min，27～29个循环，71～73℃延伸3～7min。更优选地，所述PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸1min，28个循环，72℃延伸5min。
所述的方法，步骤(3)所述的凝胶电泳检测方法为：取步骤(2)所得扩增产物，加入核酸染料进行染色，取扩增产物上样，后通过琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果；若在凝胶电泳图中观察到在330～370bp有单一DNA条带，则可以确定待测样品中含有川贝母；若在凝胶电泳图中不能观察到330～370bp单一DNA条带，则可以确定待测样品中不含有川贝母。优选地，在凝胶电泳图中340～360bp有单一DNA条带。
所述的方法，扩增产物上样量为5～15μL；琼脂糖凝胶为1.0％～2.0％琼脂糖凝胶。
本发明所述的一种川贝母的PCR鉴别方法，待测样品为川贝母鳞茎。
本发明的技术关键点在于：
1、研究人员通过筛选得到可以鉴别川贝母及其混伪品的有效SNP位点；
2、通过对引物关键位点设计突变增强其特异性；
3、摸索得到特异性鉴别川贝母的PCR扩增条件。
有益效果：本发明与现有技术相比，本发明使用筛选得到的特异性PCR引物及最佳的PCR反应条件，对所收集川贝母及其常见混伪品的DNA进行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示川贝母在350bp左右具有单一的DNA条带，可据此确认样品是否为川贝母。本发明实现了川贝母的快速准确鉴别，为川贝母的真伪鉴定补充了新的方法。
附图说明
图1：BM-Z-F1+BM-Z-R1特异性引物鉴别，该引物能够特异性扩增获得川贝母的鉴别条带，而其他混伪品无条带；其中，从左往右依次为：M.Marker；1.暗紫贝母；2.瓦布贝母；3.卷叶贝母；4.甘肃贝母；5.太白贝母；6.梭砂贝母；7.浙贝母；8.平贝母；9.新疆贝母；10.伊犁贝母；11.湖北贝母；12.空白对照。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下面结合具体实施例对本申请做出详细说明。
实施例1
表1.对川贝母的特异性引物
上述引物对由上海生工生物公司合成，加无菌水稀释为10μM。
按照如表2所示配比配制核洗脱液，按照表3所示配比配制CTAB溶液。
(1)贝母基因组DNA的提取：收集川贝母及其常见混伪品，使用CTAB法提取样品总DNA。取单颗鳞茎进行研磨粉碎，取100mg细粉置于离心管中，利用核洗脱液洗至上清无色，离心后使用移液枪小心弃去上层清液，沉淀加入600μ LCTAB溶液充分混匀，置65℃水浴1h。取出，振荡后12000rpm离心5min，上清液转移至新的2mL离心管中。加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)充分混匀，12000rpm离心5min，重复上述操作。离心后上清液转移至新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，于-20℃孵化5～20min，取出离心5min。沉淀使用75％乙醇洗涤2次，除去残余的异丙醇，将乙醇挥干后加入50μL超纯水溶解。提取后的DNA稀释至50-100ng/μL备用。
(2)PCR扩增：取稀释后的DNA为模板，使用上述引物进行PCR反应。反应总体积为25μL，包括Premix TaqTM 12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，无菌超纯水9.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火45s，72℃延伸1min，28个循环，72℃延伸5min。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测：取步骤(2)所得扩增产物，加入核酸染料进行染色，分别取10μL扩增产物上样，后通过1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。
结果见图1，川贝母及其混伪品来源如表1所示，可见川贝母六种基原植物样品在350bp左右有单一DNA条带，其余品种无条带，阴性对照无条带，。
表2.核洗脱液配制表
表3.CTAB溶液配制表
表4.川贝母及其混伪品收集表
(2)本发明所述引物由上海生工生物公司合成，Premix TaqTM购自TAKARA。
Claims (10)
1.一种用于鉴定中药川贝母的引物对，其特征在于，所述引物包含如下序列：
上游引物：BM-Z-F1：5’-GCACTATGCCCGCCCTGTC-3’；
下游引物：BM-Z-R1：5’-GGTCATTGGGCACGGAGCG-3’。
2.权利要求1所述的用于鉴定中药川贝母的引物对在川贝母的真伪鉴定中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述川贝母的品种包括：卷叶贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、太白贝母和瓦布贝母。
4.一种基于位点特异性PCR技术的川贝母鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取川贝母样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，使用权利要求1所述的引物对进行PCR反应；
(3)对(2)所得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判定样品是否为川贝母。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用CTAB法提取川贝母样品的基因组DNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，具体步骤包括：取样品粉末置于离心管中，利用核洗脱液洗至上清无色，离心后使用移液枪小心弃去上层清液，再使用CTAB法提取样品总DNA。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述使用CTAB法提取样品总DNA具体包括以下步骤：沉淀加入CTAB溶液充分混匀，置50～70℃水浴0.5～1.5h，取出，振荡后离心，上清液转移至离心管中，加入氯仿-异戊醇混合液充分混匀，离心，重复上述操作，离心后上清液转移至离心管中，加入异丙醇，于-10℃～-30℃孵化5～20min，取出离心，沉淀使用乙醇洗涤，将乙醇挥干后加入水溶解。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR反应条件为：90～96℃预变性3-8min；90～96℃变性25-35s，60～68℃退火40～50s，70～75℃延伸0.5～1.5min，25～30个循环，70～75℃延伸3～8min；PCR反应体系包括：PremixTaqTM、上游引物、下游引物、DNA模板、水，其中，所述DNA模板为步骤(1)提取所得的DNA。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的凝胶电泳检测方法为：取步骤(2)所得扩增产物，加入核酸染料进行染色，取扩增产物上样，后通过琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果；若在凝胶电泳图中观察到在330～370bp有单一DNA条带，则可以确定待测样品中含有川贝母；若在凝胶电泳图中不能观察到330～370bp单一DNA条带，则可以确定待测样品中不含有川贝母。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，扩增产物上样量为5～15μL；琼脂糖凝胶为1.0％～2.0％琼脂糖凝胶。
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- 2023-07-27 CN CN202310939705.9A patent/CN116837135A/zh active Pending
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