CN108265122B - 快速鉴别川贝母真伪的pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药材鉴定技术领域，涉及一种快速鉴别川贝母真伪的PCR方法。具体地，本发明涉及用于鉴别川贝母真伪的引物及其在鉴别川贝母真伪中的应用。本发明进一步涉及利用所述引物快速、准确的鉴别川贝母真伪的PCR方法。
Description
技术领域
本发明属于中药材鉴定技术领域，具体涉及用于鉴别川贝母真伪的引物及其在鉴别川贝母真伪中的应用；进一步涉及利用所述引物快速、准确的鉴别川贝母真伪的PCR方法。
背景技术
中药川贝母属于百合科贝母属植物，是川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母或太白贝母的干燥鳞茎(国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版.一部[M].中国医药科技出版社,2015)，主产于四川及其邻近诸省(蒋舜媛、孙洪兵、秦纪洪等，基于生长适宜性和品质适宜性的川贝母功能型生产区划研究[J]，中国中药杂志，2016，41(17):3194-3201)。川贝母具有止咳化痰、降血压、增强心肌收缩力、清热、抗菌和抗病毒等作用(孙涛、彭成、谢晓芳等，川贝母止嗽颗粒对大鼠急性支气管炎的影响[J]，中药药理与临床，2013(03):150-153；孙涛、彭成，川贝母止嗽颗粒的平喘作用研究[J]，时珍国医国药，2013，24(7):1575-1577；颜晓燕、彭成，川贝母药理作用研究进展[J]，中国药房，2011，22(31):2963-2965)，被收录于历年的《中华人民共和国药典》中。在中药配方中，川贝母作为一种常规药而被广泛的应用，其中以川贝母为原料的中成药高达100种以上(中国药材公司，中国中药资源丛书，中国常用中药材[M]，科学出版社，1995)。由于川贝母的药用价值高，疗效显著，使得其市场需求量大；同时也由于川贝母的生长周期较长和过度采挖等原因，导致川贝母的野生植物资源锐减(黄璐琦，中国珍稀濒危药用植物资源调查[M]，上海科学技术出版社，2012)，进而使得川贝母的价格逐年上涨。优质川贝母每公斤的价格最高可至上万元。在经济利益驱使下，市场上以浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母混充川贝母的现象十分普遍。这严重影响了药品的安全有效性，因此川贝母的真伪鉴别意义重大。
传统的川贝母鉴别方法有性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别等方法(周亭亭，川贝母鉴定方法进展研究[J]，现代交际，2017(11):192-192)，这些鉴别方法容易受到药材生长环境、生长年限以及产地加工等诸多影响，在川贝母鉴别上存在一定的局限性(徐传林，李会军，李萍等，川贝母药材分子鉴定方法研究[J].中国药科大学学报，2010，41(03):226-230；陈士林、姚辉、韩建萍等，中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J]，中国中药杂志，2013，38(2):141-148)。例如，研究发现栽培的川贝母和暗紫贝母不含贝母素乙(王琳玲，王玲玲，于国强等，川贝母的HPLC指纹图谱研究[J]，华西药学杂志，2016，31(05):497-501)。而中国药典规定：川贝母在薄层鉴别反应中，应出现贝母素乙斑点(国家药典委员会.中华人民共和国药典:2015年版.一部[M].中国医药科技出版社,2015)。这就会出现薄层鉴别法将栽培的川贝母和暗紫贝母鉴定为伪品的情况。
为了提高中药材鉴别的准确性，DNA鉴别逐渐被广泛使用(辛天怡、李西文、姚辉等，中药材二维DNA条形码流通监管体系研究[J]，中国科学：生命科学，2015，45(7):695-702)。其中川贝母鉴别中最常用且最准确的DNA鉴别方法是聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP法)(胡伟、陈伟盛、林秀旎、侯惠婵，聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定川贝母药材的方法优化[J]，药物分析杂志，2017，37(09):1716-1720)，该法也被中国药典2015年版收录。PCR-RFLP法首先需要进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后将PCR扩增产物进行酶切，酶切时间2～3小时不等。中国药典规定川贝母鉴别取样时以单个贝母为单位，每次取6～10粒，进行6～10次独立实验。这样在利用PCR-RFLP法进行川贝母鉴别时，由于存在酶切步骤，工作量较大，实验时间较长且成本较高，阻碍了川贝母分子鉴定的大规模推广。
发明内容
本发明利用川贝母ITS1区序列的特点(徐传林，李会军，李萍等，川贝母药材分子鉴定方法研究[J]，中国药科大学学报，2010，41(03):226-230)，设计了一条特异性上游引物，用以鉴别真伪川贝母。该引物以川贝母ITS1区的第75位碱基“C”为3'未端，并且还在引物的3'端的第3个碱基处，引入了一个碱基错配，增加了鉴别的特异性和准确性。同时，本发明设计了相应的下游引物，配合上游引物进行PCR扩增。使用本发明所述的引物，只需PCR扩增而无须进行酶切反应即可鉴别川贝母真伪，极大减少了工作量，缩短了检测时间，降低了检测成本，并且准确度高，从而能更好的推广川贝母的分子鉴定。
一方面，本发明提供了用于鉴别川贝母真伪的引物，其特征在于，所述引物包含如下序列：
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'。
在一些实施例中，本发明所述的用于鉴别川贝母真伪的引物，其特征在于，所述引物还包含如下序列：
下游引物：5'GCTACGTTCTTCATCGAT 3'，或者
下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC 3'。
在一些实施例中，本发明所述的用于鉴别川贝母真伪的引物，其特征在于，所述引物包含如下序列：
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'，下游引物：5'GCTACGTTCTTCATCGAT 3'，即，引物1；或者
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'，下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC 3'，即，引物2。
另一方面，本发明提供了一种用于鉴别川贝母真伪的PCR扩增体系，其特征在于，所述扩增体系包含本发明所述的引物(即，引物1或引物2)。
在一些实施例中，本发明所述PCR扩增体系，其特征在于，所述扩增体系为：10×PCR缓冲液2μL，MgCl2(25mmoL/L)1μL，dNTP(25mmoL/L)3.2μL，上游引物(10μmoL/L)0.4μL，下游引物(10μmoL/L)0.4μL，基因组DNA 100ng，DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，无菌双蒸水补足至20μL。
一方面，本发明提供了一种鉴别川贝母真伪的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)川贝母样品基因组DNA的提取；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：
引物1：
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'，下游引物：5'GCTACGTTCTTCATCGAT 3'；
或者，
引物2：
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'，下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC 3'；
(3)对步骤(2)的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
在一些实施例中，本发明所述的鉴别川贝母真伪的方法中，所述步骤(2)中PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液2μL，MgCl2(25mmoL/L)1μL，dNTP(25mmoL/L)3.2μL，上游引物(10μmoL/L)0.4μL，下游引物(10μmoL/L)0.4μL，基因组DNA100ng，DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，无菌双蒸水补足至20μL。
在一些实施例中，本发明所述的鉴别川贝母真伪的方法中，所述步骤(2)中，PCR反应程序为：94℃预变性2min；扩增30个循环，每个循环包括以下步骤：98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min。
在一些实施例中，本发明所述的鉴别川贝母真伪的方法中，所述步骤(1)中的DNA提取使用DNA试剂盒提取，步骤包括：①取样品依次用灭菌水、75％乙醇和双蒸水清洗，置于超净工作台晾干，晾干后，在超净工作台中用研钵研磨至极细粉，准确称取样品粉末0.1g，转至另一个研钵中；②加入350μL PBS缓冲液和0.9μL RNase A用力碾磨30s，转移液体至1.5mL离心管中，用PBS缓冲液补足至350μL；③加入150μL Buffer C-L混匀后，再加入20μLProteinase K，混匀后置于56℃水浴30min，每5min上下混匀一下；④加入350μL Buffer P-D，混匀后12000rpm离心10min；⑤取上清液至DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液；⑥加入500μL Buffer W1，12000rpm离心1min，弃滤液；⑦加入700μL Buffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液；⑧空离心后，将DNA制备管置于另一洁净的1.5mL的离心管中，在制备管膜中央加30μL无菌超纯水，室温静置1min，12000rpm离心1min，-20℃保存。
在一些实施例中，本发明所述的鉴别川贝母真伪的方法中，所述步骤(3)中的琼脂糖凝胶电泳为1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：恒压，电压为5V/cm；电泳时间为30min。
在一些实施例中，本发明所述的鉴别川贝母真伪的方法中，其特征在于，所述方法还包括对所述鉴别结果的判断：使用所述引物1或2进行扩增，若所得的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在200bp处出现电泳条带，则对应的川贝母为真品。
本发明涉及一种新的引物，所述引物特异性良好，可以用于快速、准确的鉴别川贝母的真伪。其中，在所述引物中，上游引物5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'是关键的，当上游引物固定时，对下游引物的碱基序列进行细微调整所得的引物，同样可以准确的鉴别川贝母的真伪，例如，本发明所述的引物1和引物2。特别是所述上游引物3’端的第3个碱基A，该碱基的引入避免了假阳性检测结果的出现，增加了引物的特异性，同时提高了所述引物的检测准确度。
本发明还涉及一种鉴别川贝母真伪的方法：采用所述的引物，只需要通过PCR扩增即可鉴别川贝母的真伪，检出率达100％。所述方法具有操作简单、结果准确、灵敏度高、重复性好和特异性强的优点，可以在短时间内对大量的待测川贝母样品进行快速且准确的鉴别，大大的节约经济和时间成本。
附图说明
图1显示的是实施例1中利用中国药典收录的PCR-RFLP技术对川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母进行鉴别的电泳图谱。其中，1a、1b、1c、1d、1e、1f分别是使用引物3扩增的川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母的PCR产物的酶切产物电泳图谱。
图2显示的是根据本发明实施例2所述的方法对川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母进行鉴别的电泳图谱。其中，2a、2b、2c、2d、2e、2f分别是使用本发明所述的特异性引物1扩增的川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母的PCR电泳图谱。
图3显示的是根据本发明实施例3所述的方法对川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母进行鉴别的电泳图谱。其中，3a、3b、3c、3d、3e、3f分别是使用本发明所述的特异性引物2扩增的川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母的PCR电泳图谱。
图4显示的是实施例4中利用中国药典收录的PCR-RFLP技术对常见川贝母伪品——浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母进行鉴别的电泳图谱。其中，4a、4b、4c、4d分别是使用引物3扩增的浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母的PCR产物的酶切产物电泳图谱。
图5显示的是根据本发明实施例5所述的方法对浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母进行鉴别的电泳图谱。其中，5a、5b、5c、5d分别是使用引物1扩增的浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母的PCR产物电泳图谱。
图6显示的是根据本发明实施例6所述的方法对浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母进行鉴别的电泳图谱。其中，6a、6b、6c、6d分别是使用引物2扩增的浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母的PCR产物电泳图谱。
图7显示的是根据本发明实施例7所述的方法对川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母进行鉴别的电泳图谱。其中，7a、7b、7c、7d、7e、7f分别是使用本发明所述引物4扩增的川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母的PCR电泳图谱。
图8显示的是根据本发明实施例8所述的方法对浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母进行鉴别的电泳图谱。其中，8a、8b、8c、8d分别是使用引物4扩增的浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母的PCR产物电泳图谱。
图9显示的是按照实施例9示例1的方法，利用PCR-PFLP技术对川贝母、平贝母和9批市售川贝母进行鉴别的电泳图谱。其中，泳道M为DNA Marker I，泳道1为川贝母，泳道2为平贝母，泳道3-11为市售川贝母GZ-1至GZ-9，泳道12为空白对照。
图10显示的是根据实施例9示例2的方法，使用引物1对川贝母、平贝母和9批市售川贝母进行鉴别的电泳图谱。其中，泳道M为DNA Marker I，泳道1为川贝母，泳道2为平贝母，泳道3-11为市售川贝母GZ-1至GZ-9，泳道12为空白对照。
图11显示的是根据实施例9示例3的方法，使用引物2对川贝母、平贝母和9批市售川贝母进行鉴别的电泳图谱。其中，泳道M为DNA Marker I，泳道1为川贝母，泳道2为平贝母，泳道3-11为市售川贝母GZ-1至GZ-9，泳道12为空白对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐述本发明，而不是对本发明应用范围的限制。
实验材料：
甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母收集自各贝母主产地，经过贵州医科大学生药学教研室龙庆德副教授鉴定。川贝母标准品(批号：121000-201108)、平贝母标准品(批号：120924-201410)、伊贝母标准品(批号：120929-201005)、湖北贝母标准品(批号：120962-201005)、浙贝母标准品(批号：120972-201405)均购自中国食品药品检定研究院；其他9组样品GZ-1至GZ-9为市售川贝母。
试剂：
DNA提取试剂盒(货号AP-MN-MS-GDNA-50)购自AXYGEN公司；GelRed(货号41003)购自BIOTIUM公司；DNA Marker I(货号MD101)和50bp DNA Ladder(货号MD108)均购自北京天根生化科技有限公司；6×Loading Buffer(货号9156)、Taq酶(货号RR002A)均购自Takara公司；Sma I酶(货号ER0661)购自Thermo公司。
仪器：
凝胶成像仪(Syngene，型号G:BOX ChemiXL1.4)；PCR仪(BIO-RAD，型号S1000)；电泳仪(BIO-RAD，型号PowerpacTM Basic)；高速冷冻离心机(Thermo，型号Fresco 17)；振荡恒温孵育器(艾本森，型号TMC)。
实施例1利用中国药典收录的PCR-RFLP技术对川贝母基原——川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母进行鉴别
步骤1)基因组DNA的提取
每种贝母各取6个批次，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
①取样品依次用灭菌水、75％乙醇和双蒸水清洗，置于超净工作台晾干。晾干后，在超净工作台中用研钵研磨至极细粉，准确称取样品粉末0.1g，转至另一个研钵中；②加入350μL PBS缓冲液和0.9μL RNase A用力碾磨30s，转移液体至1.5mL离心管中，用PBS缓冲液补足至350μL；③加入150μL Buffer C-L混匀后，再加入20μL Proteinase K，混匀后置于56℃水浴30min，每5min上下混匀一下；④加入350μL Buffer P-D，混匀后12000rpm离心10min；⑤取上清液至DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液；⑥加入500μL Buffer W1，12000rpm离心1min，弃滤液；⑦加入700μL Buffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液；⑧空离心后，将DNA制备管置于另一洁净的1.5mL的离心管中，在制备管膜中央加30μL无菌超纯水，室温静置1min，12000rpm离心1min，-20℃保存。
步骤2)PCR扩增
以步骤1)提取的基因组DNA为模板，借助如下引物和底物(dNTP)，在Taq酶的作用下扩增序列：
引物3(收录于：《中华人民共和国药典》2015年版一部川贝母)：
上游引物：5'CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3'，
下游引物：5'GCTACGTTCTTCATCGAT 3'。
PCR反应条件为：10×PCR缓冲液2μL，MgCl2(25mmoL/L)1μL，dNTP(25mmoL/L)3.2μL，上游引物(10μmoL/L)0.4μL，下游引物(10μmoL/L)0.4μL，基因组DNA 100ng，DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，无菌水补足至20μL。
反应程序为：94℃预变性2min；扩增30个循环，每个循环包括以下步骤：98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min。
步骤3)酶切鉴定
取步骤2)的PCR反应液，置于1.5mL离心管中，利用Sma I酶对其进行酶切，鉴定样品的真伪。
反应体系为：10×酶切缓冲液2μL，PCR反应液10μL，Sma I酶(10U/μL)1μL，无菌水补足至20μL。反应条件为：30℃、2h。
步骤4)利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果
利用1.5％琼脂糖凝胶电泳及借助凝胶成像系统来分析步骤3)酶切反应的结果，其中，电泳条件为：恒压，电压为5V/cm；电泳时间为30min。其结果如图1所示。
图1显示，经Sma I酶切后，川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品在100～250bp之间出现了2条酶切条带，与中国药典规定相符，说明实验所用到的样品均为真品。
实施例2利用本发明所述的方法，使用引物1对川贝母基原——川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母进行鉴别
步骤1)基因组DNA的提取
每种贝母各取6个批次，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
按照实施例1步骤1)的方法，提取川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品的基因组DNA。
步骤2)PCR扩增
按照实施例1步骤2)的方法，以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用引物1进行PCR扩增。
引物1：
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'，
下游引物：5'GCTACGTTCTTCATCGAT 3'。
步骤3)琼脂糖凝胶电泳检测
按照实施例1步骤4)的方法，对步骤2)的扩增样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图2所示。
图2的检测结果显示，在引物1的作用下，川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品均扩出了200bp左右的条带，可判定实验所用到的样品均为川贝母的真品；这一检测结果与实施例1结果相符，说明本发明所述的方法能准确鉴定川贝母真品。
实施例3利用本发明所述的方法，使用引物2对川贝母基原——川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母进行鉴别
步骤1)基因组DNA的提取
每种贝母各取6个批次，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
按照实施例1步骤1)的方法，提取川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品的基因组DNA。
步骤2)PCR扩增
按照实施例1步骤2)的方法，以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用引物2进行PCR扩增。
引物2：
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'，
下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC 3'。
步骤3)琼脂糖凝胶电泳检测
按照实施例1步骤4)的方法，对步骤2)的扩增样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图3所示。
图3的检测结果显示，在引物2的作用下，川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品均扩出了200bp左右的条带，可判定实验所用到的样品均为川贝母的真品；这一检测结果与实施例1结果相符，说明本发明所述的方法能准确鉴定川贝母真品。
实施例4利用中国药典收录的PCR-RFLP技术对常见川贝母伪品——浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母进行鉴别
步骤1)基因组DNA的提取
每种贝母各取6个批次，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
按照实施例1步骤1)的方法，提取浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母样品的基因组DNA。
步骤2)PCR扩增
按照实施例1步骤2)的方法，以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用引物3进行PCR扩增。
引物3：
上游引物：5‘CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3‘，
下游引物：5‘GCTACGTTCTTCATCGAT 3‘。
步骤3)酶切鉴定
按照实施例1步骤3)的方法，对步骤2)的PCR反应液，进行酶切鉴定。
反应体系为：10×酶切缓冲液2μL，PCR反应液10μL，Sma I酶(10U/μL)1μL，无菌水补足至20μL。反应条件为：30℃、2h。
步骤4)利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果
利用1.5％琼脂糖凝胶电泳及借助凝胶成像系统来分析步骤3)酶切反应的结果，其中，电泳条件为：恒压，电压为5V/cm；电泳时间为30min。其结果如图3所示。
图4显示，经Sma I酶切后，浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母样品在100～250bp之间没有酶切条带，不符合中国药典对川贝母基原的规定，说明本实验所用到的样品均为川贝母伪品。
实施例5利用本发明所述的方法，使用引物1对常见川贝母伪品——浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母进行鉴别
步骤1)基因组DNA的提取
每种贝母各取6个批次，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
按照实施例1步骤1)的方法，提取浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母样品的基因组DNA。
步骤2)PCR扩增
按照实施例1步骤2)的方法，以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用引物1进行PCR扩增。
引物1：
上游引物5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'，
下游引物5'GCTACGTTCTTCATCGAT 3'。
步骤3)琼脂糖凝胶电泳检测
按照实施例1步骤4)的方法，对步骤2)的扩增样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图5所示。
图5的检测结果显示，在引物1的作用下，浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母未扩增出200bp左右的条带，可判定实验所用到的样品均为川贝母的伪品。这一检测结果与实施例4结果相符，说明本发明所述的方法能准确鉴别川贝母伪品。
实施例6利用本发明所述的方法，使用引物2对常见川贝母伪品——浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母进行鉴别
步骤1)基因组DNA的提取
每种贝母各取6个批次，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
按照实施例1步骤1)的方法，提取浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母样品的基因组DNA。
步骤2)PCR扩增
按照实施例1步骤2)的方法，以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用引物2进行PCR扩增。
引物2：
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'，
下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC 3'。
步骤3)琼脂糖凝胶电泳检测
按照实施例1步骤4)的方法，对步骤2)的扩增样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图6所示。
图6的检测结果显示，在引物2的作用下，浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母未扩增出200bp左右的条带，可判定实验所用到的样品均为川贝母的伪品。这一检测结果与实施例4结果相符，说明本发明所述的方法能准确鉴别川贝母伪品。
实施例7利用未引入碱基错配的引物对川贝母基原——川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母进行鉴别
步骤1)基因组DNA的提取
每种贝母各取6个批次，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
按照实施例1步骤1)的方法，提取川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品的基因组DNA。
步骤2)PCR扩增
按照实施例1步骤2)的方法，以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用引物4进行PCR扩增。
引物4：
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTGCC 3'，(未引入碱基错配)
下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC 3'。
步骤3)琼脂糖凝胶电泳检测
按照实施例1步骤4)的方法，对步骤2)的扩增样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图7所示。
图7的检测结果显示，在引物4的作用下，川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品均扩出了200bp左右的条带。
实施例8利用未引入碱基错配的引物对常见川贝母伪品——浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母进行鉴别
步骤1)基因组DNA的提取
每种贝母各取6个批次，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取。
按照实施例1步骤1)的方法，提取浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母样品的基因组DNA。
步骤2)PCR扩增
按照实施例1步骤2)的方法，以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用引物4进行PCR扩增。
引物4：
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTGCC 3'，
下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC 3'。
步骤3)琼脂糖凝胶电泳检测
按照实施例1步骤4)的方法，对步骤2)的扩增样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图8所示。
图8的检测结果显示，在引物4的作用下，浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母各有部分批次的样品扩增出200bp左右的条带。这一检测结果与实施例3结果不相符，说明未引入人为碱基错配的引物不能准确鉴别川贝母伪品，可能会将川贝母伪品鉴定为真品。
实施例9利用PCR-RFLP法和本发明所述的方法对市售川贝母进行鉴别
从市场上购买了9批川贝母样品GZ-1至GZ-9，利用PCR-RFLP法和本发明所述的方法分别进行鉴别，并比较两种方法的准确率。
示例1利用PCR-RFLP法对市售川贝母GZ-1至GZ-9进行鉴别
按照实施例1的方法，利用PCR-RFLP法，使用引物3对川贝母、平贝母和9批市售川贝母GZ-1至GZ-9进行鉴别，其结果如图9所示。
按照中国药典的规定，真品川贝母经Sma I酶切后，产生两条新的条带且大小在100～250bp之间。从图9可以看出，泳道1在100～250bp之间有两条带，证明其是川贝母真品；泳道2只有一条300bp左右的条带，说明其不是川贝母真品；泳道5、7和10只有一条300bp左右的条带，说明GZ-3、GZ-5和GZ-8三批药材是伪品，而泳道3、4、6、8、9和11在100～250bp之间有两条带，说明GZ-1、GZ-2、GZ-4、GZ-6、GZ-7和GZ-9六批药材是真品。
示例2利用本发明所述的方法，使用引物1对市售川贝母GZ-1至GZ-9进行鉴别
按照实施例2的方法，使用引物1对川贝母、平贝母和9批市售川贝母GZ-1至GZ-9进行鉴别，其结果如图10所示。
根据本发明所述的方法，真品川贝母经引物2PCR扩增后，应该出现一条200bp左右的条带。图10显示，对应川贝母的泳道1在200bp左右有单一条带，对应平贝母的泳道2无条带；泳道5、7和10无条带，说明GZ-3、GZ-5和GZ-8三批药材是伪品，而泳道3、4、6、8、9和11在200bp左右有单一条带，说明GZ-1、GZ-2、GZ-4、GZ-6、GZ-7和GZ-9六批药材是真品，实验结果和PCR-RFLP法的结果一致，说明书本发明所述的方法可以准确鉴别真伪川贝母。
示例3利用本发明所述的方法，使用引物2对市售川贝母GZ-1至GZ-9进行鉴别
按照实施例3的方法，使用引物2对川贝母、平贝母和9批市售川贝母GZ-1至GZ-9进行鉴别，其结果如图11所示。
根据本发明所述的方法，真品川贝母经引物2PCR扩增后，应该出现一条200bp左右的条带。图11显示，对应川贝母的泳道1在200bp左右有单一条带，对应平贝母的泳道2无条带；泳道5、7和10无条带，说明GZ-3、GZ-5和GZ-8三批药材是伪品，而泳道3、4、6、8、9和11在200bp左右有单一条带，说明GZ-1、GZ-2、GZ-4、GZ-6、GZ-7和GZ-9六批药材是真品，实验结果和PCR-RFLP法的结果一致，说明书本发明所述的方法可以准确鉴别真伪川贝母。
根据以上实施例及其结果可以得出如下结论：
(1)通过实施例1-6(对照药材鉴别试验)可以看出，本发明所述的引物1和引物2可以用于鉴别川贝母各基原和常见川贝母伪品，准确率与中国药典收录的PCR-RELP法一致。
(2)通过实施例7，8可以看出，如果没有在上游引物的3'端的第3个碱基处引入的碱基错配，当DNA模板为川贝母真品DNA时，该引物能顺利扩增出200bp左右的PCR产物(实施例7)；但是当DNA模板为川贝母伪品DNA时，该引物也能扩增出200bp左右的PCR产物(实施例8)，导致会将川贝母伪品鉴定为真品。
而从实施例3，6可以看出，如果在上游引物的3'端的第3个碱基处引入碱基错配，则能准确地鉴别川贝母的真品和伪品。说明本发明所述的在上游引物3'端的第3个碱基处引入的碱基错配能增加川贝母分子鉴定的准确度，是非常有必要的。
(3)从实施例9(市售药材鉴别试验)可以看出，本发明所述的引物(引物1和引物2)可以用于鉴别市售川贝母的真伪，准确率与中国药典收录的PCR-RELP法一致。
总的来说，使用本发明所述的特异性引物(即，引物1和引物2)，只需要通过1步聚合酶链式反应即可鉴别川贝母的真伪，检出率达100％。并且本发明所述的方法和中国药典收录的PCR-RFLP技术相比，由于少了一步酶切实验，本发明所述的方法耗时短(少2～3小时)，极大降低了工作量和成本，可以快速、准确的鉴别川贝母的真伪，更有利于川贝母分子鉴别的进一步推广。
Claims (9)
1.用于PCR方法鉴别川贝母真伪的引物对，其特征在于，所述引物对由上游引物和下游引物组成：
所述上游引物为：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'；
所述下游引物为：5'GCTACGTTCTTCATCGAT 3'或5'CTTCATCGATGCGAGAGC 3'。
2.用于鉴别川贝母真伪的PCR扩增试剂，其特征在于，所述扩增试剂包含权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的PCR扩增试剂，其特征在于，所述扩增试剂为：10×PCR缓冲液2μL，25mmoL/L MgCl2 1μL，25mmoL/L dNTP 3.2μL，10μmoL/L上游引物0.4μL，10μmoL/L下游引物0.4μL，基因组DNA 100ng，5U/μL DNA聚合酶0.2μL，无菌双蒸水补足至20μL。
4.一种鉴别川贝母真伪的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)川贝母样品基因组DNA的提取；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用如下引物对进行PCR扩增：
引物对1：
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'，下游引物：5'GCTACGTTCTTCATCGAT 3'；
或者
引物对2：
上游引物：5'ACTATGCCCGCCCTACC 3'，下游引物：5'CTTCATCGATGCGAGAGC 3'；
(3)对步骤(2)的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤(2)中PCR反应试剂包括：10×PCR缓冲液2μL，25mmoL/L MgCl2 1μL，25mmoL/L dNTP 3.2μL，10μmoL/L上游引物0.4μL，10μmoL/L下游引物0.4μL，基因组DNA 100ng，5U/μL DNA聚合酶0.2μL，无菌双蒸水补足至20μL。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤(2)中，PCR反应程序为：94℃预变性2min；扩增30个循环，每个循环包括以下步骤：98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤(1)中的DNA提取使用DNA试剂盒提取，步骤包括：①取样品依次用灭菌水、75％乙醇和双蒸水清洗，置于超净工作台晾干，晾干后，在超净工作台中用研钵研磨至极细粉，准确称取样品粉末0.1g，转至另一个研钵中；②加入350μL PBS缓冲液和0.9μL RNase A用力碾磨30s，转移液体至1.5mL离心管中，用PBS缓冲液补足至350μL；③加入150μL Buffer C-L混匀后，再加入20μL Proteinase K，混匀后置于56℃水浴30min，每5min上下混匀一下；④加入350μL Buffer P-D，混匀后12000rpm离心10min；⑤取上清液至DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液；⑥加入500μL Buffer W1，12000rpm离心1min，弃滤液；⑦加入700μL Buffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液；⑧空离心后，将DNA制备管置于另一洁净的1.5mL的离心管中，在制备管膜中央加30μL无菌超纯水，室温静置1min，12000rpm离心1min，-20℃保存。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述步骤(3)中的琼脂糖凝胶电泳为1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：恒压，电压为5V/cm；电泳时间为30min。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括对鉴别结果的判断：使用所述引物对1或引物对2进行扩增，若所得的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在200bp处出现电泳条带，则对应的川贝母为真品。
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