CN104372078B - 一种食品中产气荚膜梭菌的hda引物及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物及其应用方法，所述HDA引物为：上游引物：如SEQ ID NO：1所示；下游引物：如SEQ ID NO：2所示。本发明应用该HDA引物对产气荚膜梭菌进行检测，是一种简便、快速的检测方法，操作简单，覆盖面广，能应用在检验的一线，能够准确、快速检测出该食品在卫生标准规定的范围内是否存在产气荚膜梭菌，可节约大量的人力物力，不仅可取得可观的经济效益，更为重要的是对进出口食品安全的意义特别重大。

Description

一种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物及其应用方法
技术领域
本发明涉及一种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物及其应用方法。
背景技术
我国当前主要的食品安全问题是致病微生物污染食品引起的食源性疾病，其中微生物性食物中毒在影响我国食品安全因素中排名第一，儿童、孕妇、年老体弱者和免疫力低下的人群更容易成为受害者。产气荚膜梭菌(C.perfringens)是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭菌。
产气荚膜梭菌的传统检测方法繁琐、耗时长，一般3-5天才能检出病原菌。随着分子生物学技术的发展和应用，PCR等核酸扩增技术以其快速灵敏和特异的优势，不仅日益取代了传统的检测方法，而且使以往无法完成的检测成为了可能。许多针对特异性病原体的检测方法，已经开发为试剂盒并应用于常规检测，取代了病原体体外培养等传统的微生物检测方法。然而，PCR技术始终无法摆脱依赖精良仪器设备的局限，使得以PCR为基础的核酸扩增技术无法更为广泛地推广和应用。
随着核酸扩增技术的发展和应用，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术近年来得到了迅猛的发展。多种机制的等温技术不仅诞生，而且有些技术已经相当成熟，完成了从实验室到实际应用的过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学等领域得到广泛的运用。特别是在现场快速检测技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是，核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间过程且摆脱了对精良仪器设备的依赖，使病原体的检测实现了快速、简便和高通量。在实际操作和仪器要求方面，这些等温技术都比PCR技术更为简单和廉价，从而更容易被开发成现场检测的应用产品。因此，等温扩增技术是核酸扩增技术的发展方向，具有广阔的应用前景。
依赖解旋酶DNA等温扩增技术(Helicase-Dependent isothermal DNAAmplification，简称HDA)是由美国NEB公司研究人员Vincent等于2004年发明一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内DAN在恒温下复制的自然过程，在恒温条件下利用生物复制系统的关键组分实现DNA的体外扩增。主要是利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，同时DNA单链结合蛋白(SSB)稳定解开的单链为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互补链。新合成的双链在解旋酶的作用下又形成单链，并作为下一轮合成的模板进入循环扩增反应，最终实现靶序列的指数增长。
HDA技术的优点在于：等温扩增，在一个恒定温度就能完成扩增反应，不需要像PCR那样循环的温度变化；原理简单，HDA技术模拟自然界DNA的合成方式，原理清晰易懂；操作简便，HDA对引物的设计与PCR相似，不需要复杂的引物设计。对于其他组分也不需要做任何特殊处理，只需要一个恒温装置即可进行反应；设备简单，HDA不需要复杂的设备，只需要一个简单的恒温器，如果选用室温可以进行反应的酶，甚至不需要恒温器就可进行反应。因此，HDA技术具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物及其应用方法，检测灵敏度高，耗时短，特异性强。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物，所述HDA引物为：
上游引物：如SEQIDNO：1所示；
下游引物：如SEQIDNO：2所示。
一种利用上述HDA引物的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，采用一步法，使用的反应体系包括：
5μL10×缓冲液，0.04μmol dNTPs，0.16μmol ATP，10U Bst ploymerase，0.10～0.30μg UvrD helicase，1.0～5.0μg T4gp32或1.0～6.0μg RecA蛋白，25μM海藻糖，2μL模板DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用ddH2O补至50μL；所述10×缓冲液包括100mM二硫苏糖醇、350mM Tris-HAc、100mM MgSO4和1mg/mLBSA；将反应体系放入65℃恒温金属浴中恒温扩增2h。
作为本发明的一种改进，反应结束后，吸取5μL扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为120V，80mA，电泳时间45min，置凝胶成像系统观察并拍照。
作为本发明的一种改进，反应体系中，UvrD helicase的浓度为0.1μg。
作为本发明的一种改进，反应体系中，T4gp32的浓度为5.0μg，或者RecA蛋白的浓度为3.0μg。
作为本发明的一种改进，反应体系中还包括2U～10U的Phi29嗜温聚合酶。
作为本发明的一种改进，Phi29嗜温聚合酶的浓度为10U。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明是一种简便、快速的检测方法，操作简单，覆盖面广，能应用在检验的一线，能够准确、快速检测出该食品在卫生标准规定的范围内是否存在产气荚膜梭菌，可节约大量的人力物力，不仅可取得可观的经济效益，更为重要的是对进出口食品安全的意义特别重大。
附图说明
图1是实施例2中产气荚膜梭菌HDA法检出限检测结果；图中，泳道1：100bp laddermarker，泳道2：100CFU/g，泳道3：101CFU/g，泳道4：102CFU/g，泳道5：103CFU/g，泳道6：104CFU/g，泳道7：105CFU/g，泳道8：106CFU/g。
图2是实施例2中产气荚膜梭菌HDA法特异性试验结果；图中，泳道1：100bp laddermarker，泳道2：产气荚膜梭菌(22949)，泳道3：金黄色葡萄球菌(23478)；泳道4：阪崎克罗诺杆菌(21548)；泳道5：乙型溶血性链球菌(10373)；泳道6：蜡样芽胞杆菌(10041)；泳道7：肠炎沙门氏菌(21482)，泳道8：福氏志贺氏菌(21534)。
图3是实施例2中反应体系中UvrD helicase的优化结果；图中，泳道1:100bpladder marker，泳道2：0.30μg，泳道3：0.25μg，泳道4：0.20μg，泳道5：0.15μg，泳道6：0.10μg，泳道7：0.05μg。
图4是实施例2中反应体系中T4gp32的优化结果；图中，泳道1:100bp laddermarker，泳道2：6.0μg，泳道3：5.0μg，泳道4：4.0μg，泳道5：3.0μg，泳道6：2.0μg，泳道7：1.0μg。
图5是实施例2中反应体系中Phi29嗜温聚合酶提高聚合速率的试验结果；图中，泳道1:100bp ladder marker；泳道2：Phi29嗜温聚合酶浓度为2U扩增结果；泳道3：Phi29嗜温聚合酶浓度为4U扩增结果；泳道4：Phi29嗜温聚合酶浓度为6U扩增结果；泳道5：Phi29嗜温聚合酶浓度为8U扩增结果；泳道6：Phi29嗜温聚合酶浓度为10U扩增结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明各实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。并且各实施例中所用的材料及试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明各实施例中部分材料为：DNA Marker，ATP，dNTPs，均购自大连宝生物工程公司；海藻糖购自Sigma公司；大肠杆菌UvrD解旋酶购自上海富众生物科学有限公司；Bstpolymerase、MutL protein、T4gp32均购自New England公司；引物(正向引物、反向引物)由大连宝生物工程公司合成；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。
所采用的菌株均购自于中国工业微生物菌种保藏中心：产气荚膜梭菌(22949)、金黄色葡萄球菌(23478)、阪崎克罗诺杆菌(21548)、乙型溶血性链球菌(10373)、蜡样芽胞杆菌(10041)、肠炎沙门氏菌(21482)、福氏志贺氏菌(21534)。
本发明各实施例中部分仪器为：金属浴为上海东升仪器有限公司生产的6400型恒温金属浴，电泳仪为北京市六一厂生产DXY-33A型电泳仪，凝胶成像系统为UVP GelDoc-IT凝胶成像系统。
实施例1：产气荚膜梭菌HDA引物的设计
引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，2条引物序列见表1。
表1产气荚膜梭菌HDA引物序列表
Primername Len Sequence(5’→3’)
上游引物 20 ACATCAGTCTACGACATGGC(序列1)
下游引物 20 GACTAACGTAGCCGATATCT(序列2)
实施例2：引物在金黄色葡萄球菌的LAMP检测中的应用
(1)产气荚膜梭菌基因组DNA的提取
挑取产气荚膜梭菌加入1％蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分混匀，36℃±1℃培养24h±2h。移取1mL转种于10mL SPS，6℃±1℃培养24h±2h。最后取1mL增菌液用细菌基因组DNA提取试剂盒提产气荚膜梭菌基因组DNA，-20℃保存备用。
(2)优化及建立HDA反应体系及反应条件
采用一步法HDA反应体系。HDA法检测产气荚膜梭菌的反应体系为：5μL10×buffer(100mM二硫苏糖醇、350mM Tris-HAc、100mM MgSO4、1mg/mL BSA)，0.04μmol dNTPs，0.16μmol ATP，10U Bst ploymerase，0.10～0.30μg UvrD helicase，1.0～5.0μg T4gp32或1.0～6.0μg RecA蛋白，25μM海藻糖，2μL模板DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用ddH2O补至50μL。将上述反应体系放入65℃恒温金属浴中恒温扩增2h。
HDA产物电泳：反映结束后，吸取5μL扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为120V，80mA，电泳时间45min，置凝胶成像系统观察并拍照。
(3)HDA法检测产气荚膜梭菌的检出限
将产气荚膜梭菌人工污染到猪肉匀浆中，使猪肉匀浆中产气荚膜梭菌浓度依次为100CFU/mL→106CFU/mL，提取基因组DNA后进行HDA法检测，由图1可知，猪肉匀浆在产气荚膜梭菌浓度为101CFU/mL→106CFU/mL均能产生单一、清晰的目的基因片段，长度约为176bp，而产气荚膜梭菌浓度为100CFU/mL时则无清晰可见的目的电泳条带产生，因此，可以证明HDA法检测肉中产气荚膜梭菌的检出限为101CFU/mL。
(4)HDA法检测产气荚膜梭菌的特异性
将表1中所涉及的菌种按照试剂盒法进行提取基因组DNA，按照上述建立的反应体系同时进行HDA检测，经2％的琼脂糖凝胶电泳(100V、45min)检测扩增产物，利用凝胶成像系统成像分析结果。
由图2可以看出，产气荚膜梭菌(22949)被有效的扩增出186bp长度的目的片段，而且电泳条带清晰，无非特异性扩增；而其他6种菌种均未产生电泳条带，说明没有基因扩增。因此，可以证明该方法检测产气荚膜梭菌的特异性较好。
.(5)HDA法检测产气荚膜梭菌的产物分析结果
将产气荚膜梭菌进行HDA扩增，并通过凝胶电泳，凝胶回收，质粒转化，由生物工程(上海)有限公司将扩增产物进行DNA测序，通过美国州立生物技术信息中心(NCBI)生物信息平台进行在线BLAST，验证扩增产物的同源性，结果表明检测结果符合率为100％，BLAST结果见表3，证明HDA法检测产气荚膜梭菌的扩增产物为目的扩增产物，符合检测需要。
表3产气荚膜梭菌扩增片断的比对结果
Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident
JQ655731.1 Clostridium perfringens strain NE_10plasmid pNetB-NEl0，complete sequence 398 398 100％ le-107 100％
JN689220.1 Clostridium perfringens plasmid pJIR3537，complete sequence 398 398 100％ le-107 100％
JN689219.1 Clostridium perfringens plasmid pJlR3536，complete sequence 398 398 100％ le-107 100％
DQ366035.1 Clostridium perfringens strain CW92plasmid pCW3，complete sequence 398 398 100％ le-107 100％
AB236337.1 Clostridium perfringens F5603plasmid pCPF5603DNA，complete sequence 398 398 100％ le-107 100％
AB236336.1 Clostridium perfringens F4969plasmid pCPF4969DNA，complete sequence 398 398 100％ le-107 100％
AB604032.1 Clostridium perfringens plasmid pCPPB-1DNA，complete sequence 387 387 100％ 2e-104 100％
AB444205.1 Clostridium perfringens plasmid pCP8533etx DNA，complete sequence 370 370 100％ 2e-99 100％
(6)HDA反应体系的优化结果
针对建立的产气荚膜梭菌HDA检测体系，对反应体系中UvrD helicase(0.05μg、0.10μg、0.15μg、0.20μg、0.25μg、0.30μg)、T4gp32(1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg、6.0μg)的终浓度进行优化，优化结果分别如图3、4所示，当反应体系中UvrD helicase大于0.05μg时，有比较清晰的电泳条带产生；当反应体系中T4gp32大于4.0μg时，有比较清晰的电泳条带产生。最终确定UvrD helicase、T4gp32的终浓度分别为0.1μg、5.0μg。
(6)Phi29嗜温聚合酶提高聚合速率的研究结果
将Phi29嗜温聚合酶加入上述一步法HDA反应体系中，按照2U、4U、6U、8U、10U梯度浓度进行优化，扩增时间为90min，由图5可知Phi29嗜温聚合酶浓度为8U时有电泳条带产生，但是不足够清晰，因此，确定Phi29嗜温聚合酶在一步法HDA反应体系中适宜终浓度为10U，并且可以得出Phi29嗜温聚合酶对HDA法检测产气荚膜梭菌速率有明显提升。

Claims (7)

1.一种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物，其特征在于：所述HDA引物为：
上游引物：如SEQ ID NO：1所示；
下游引物：如SEQ ID NO：2所示。
2.一种利用如权利要求1所述HDA引物的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于：该方法用于检测食品中的产气荚膜梭菌，所述HDA检测方法采用一步法，使用的反应体系包括：
5μL 10×缓冲液，0.04μmol dNTPs，0.16μmol ATP，10U Bst ploymerase，0.10~0.30μgUvrD helicase，1.0~5.0μg T4 gp32或1.0~6.0μg RecA蛋白，25μM 海藻糖，2μL模板DNA，上游引物和下游引物各20 pmol，用ddH2O补至50μL；所述10×缓冲液包括100mM 二硫苏糖醇、350 mM Tris-HAc、100mM MgSO4和1mg /mL BSA；
将反应体系放入65℃恒温金属浴中恒温扩增2h。
3.根据权利要求2所述的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于：反应结束后，吸取5µL扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为120V，80mA，电泳时间45min，置凝胶成像系统观察并拍照。
4.根据权利要求2所述的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于：反应体系中，UvrDhelicase的浓度为0.1μg。
5.根据权利要求2所述的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于：反应体系中，T4gp32的浓度为5.0μg，或者RecA蛋白的浓度为3.0μg。
6.根据权利要求2所述的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于：反应体系中还包括2U~10U的Phi29嗜温聚合酶。
7.根据权利要求6所述的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于：Phi29嗜温聚合酶的浓度为10U。
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