CN110714006A - 川贝母对照药材dna克隆液的制备方法 - Google Patents

川贝母对照药材dna克隆液的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110714006A
CN110714006A CN201910465768.9A CN201910465768A CN110714006A CN 110714006 A CN110714006 A CN 110714006A CN 201910465768 A CN201910465768 A CN 201910465768A CN 110714006 A CN110714006 A CN 110714006A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
target gene
medicinal material
recombinant
bulbus fritillariae
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910465768.9A
Other languages
English (en)
Inventor
王艳双
李明成
孙丽媛
艾金霞
赵云东
周亭亭
苑广信
李盈诺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beihua University
Original Assignee
Beihua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beihua University filed Critical Beihua University
Priority to CN201910465768.9A priority Critical patent/CN110714006A/zh
Publication of CN110714006A publication Critical patent/CN110714006A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及中药现代化研究领域，是一种使用分子克隆及基因测序技术制备川贝母对照药材DNA克隆液的方法。该方法包括：川贝母对照药材基因组DNA的提取，目的基因PCR扩增和回收；目的基因与PGM‑T载体连接组成重组DNA分子；重组DNA分子转化到DH5α感受态细胞中；“蓝‑白斑”筛选出阳性菌落；提取重组质粒DNA，PCR扩增验证目的基因的正确性；目的基因序列测定与川贝母靶基因进行比对等步骤。本发明能够准确无误的制备出川贝母对照药材DNA克隆液。直接反映贝母独一无二的DNA序列，检测结果具有高度的稳定性、可靠性。并且使得川贝母对照品取之不尽用之不竭，节约更多的正品川贝母用于临床治病救人。

Description

川贝母对照药材DNA克隆液的制备方法
技术领域
本发明涉及使用分子克隆及基因测序技术制备川贝母对照药材DNA克隆液。属于中药现代化研究领域。
背景技术
中药材川贝母是百合科植物，是川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)、暗紫贝母(Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia)、甘肃贝母(Fritillariaprzewalskii Maxim)、梭砂贝母(Fritillaria delavayi Franch)、太白贝母(Fritillariataipaiensis P.Y.Li)或瓦布贝母(Fritillaria unibractcata Hsiao et K.C.Hsiavarwabuensis S.Y.Tang et S.C.Yue Z.D.Liu,S.Wang er S.C.Chen)的干燥鳞茎，川贝母性微寒而味甘苦，入心肺经，有润肺、止咳、化痰等功效，是我国名贵的中药材。
川贝母野生资源往往生长在人烟稀少，气候恶劣的高寒地区，主要分布于四川、云南、西藏、甘肃、青海、宁夏、陕西、山西、河南等省，海拔3000-4000米的山坡草丛或阴湿的小灌木丛，采挖不易且生长周期在4年以上。目前川贝母已经被列入了国家三级保护植物名单，属于珍稀濒危药材。而且由于川贝母良好的止咳化痰功效，中医处方用量相当大，以川贝母为原料生产的中成药达200种以上，商品远不能满足国内外市场的需求，价格越发昂贵，因此，市场上川贝母掺杂、掺假现象及其严重。
川贝母药材分布广泛，基源较为复杂，鉴定更加困难。2010年版《中国药典》增补本采用DNA指纹鉴定法作为川贝母检测的国家标准，运用了聚合酶链式反应(PCR)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)以及琼脂糖凝胶电泳等分子生物学技术，将正品川贝母与伪品区分开。按照《中国药典》分子生物学鉴定技术要求，每次实验必须设置川贝母正品(即标准品)为对照药材。正品川贝母药源珍贵，若每次实验都需要重新提取DNA，每次的对照药材都从食品药品监督部门购买，长期会造成巨大的经济负担，并且十分浪费正品川贝母。若自己购买川贝母作为对照药材，又不能保证每次所使用的川贝母都是正品，因而每次使用时需要重新鉴定样品的真伪，浪费时间和精力。并且道地的川贝母的产量稀少，而市场的需求又日益增大，若将大量的道地川贝母用来做对照药材，必定会导致中药材川贝母市场掺杂、掺假现象越来越严重，严重影响着临床用药的安全及疗效，影响着消费者的的利益和生命安全。
目前，中药材的对照药材，多以整体中药材、粗制大颗粒或粉末的形式存在，常常因保存不当易发生霉变和虫蛀等现象，会有外源性DNA的存在，直接导致检测结果的不稳定，影响检测结果的直观判断。
本专利将经过中国食品药品检验研究院鉴定道地川贝母，通过分子克隆及基因测序技术制备成对照药材DNA克隆液，代替川贝母对照药材，重组菌株可以无限增殖，DNA克隆液取之不尽用之不竭，可以说，一次克隆终身受益。大大节省道地川贝母的用于临床，用于治病救人，有效遏制川贝母市场掺杂、掺假现象，打击假冒伪劣。保障临床用药的安全及疗效，保障消费者的的利益和生命安全。
本专利把标准品以DNA的形式储存，直接反映了中药材川贝母独一无二的DNA序列，检测结果具有高度的稳定性、可靠性，并且重现性好、灵敏度高、样品用量少。极大的方便了标准品的储存，确保其稳定性，为检测结果的准确、可靠提供保障。
本专利运用分子克隆及基因测序技术，准确无误地实现了川贝母对照药材DNA克隆液的制备，建立与国际主流医药市场接轨的技术标准和统一的鉴定平台，打破技术性贸易壁垒，推动我国中药材标准的现代化、国际化，解决了中药材走向世界的颈瓶，促进我国国药走进国际化市场进程。
发明内容
本发明取川贝母对照药材(中国食品药品检验研究院121000-201007)，按照《中国药典》2015年版一部第36-37页PCR-RFLP步骤操作，提取川贝母基因组DNA，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离；在紫外灯下切取PCR扩增产物进行回收，获得川贝母目的基因；利用将目的基因与载体pGM-T进行连接，组成重组DNA分子；将重组DNA分子转化到DH5α感受态细胞中；通过“蓝-白斑”筛选出阳性重组体；从阳性重组菌中提取重组质粒DNA，以重组质粒DNA为模板，使用川贝母引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行验证目的基因的正确性；将重组质粒DNA送至上海生工，采用双向引物对目的基因进行序列测定；将测序结果与川贝母基因组进行比对，比对结果同源性100％，表明克隆川贝母对照药材DNA序列准确无误，因此，川贝母对照药材DNA克隆液可以代替川贝母对照药材作为阳性对照品；将含有序列比对同源性100％的重组质粒DNA的阳性重组菌接种到磁珠中，-80℃长期保存，随时使用，随时复苏；省时省力更节省道地川贝母，检测结果稳定可靠。
本发明的目的是在于运用分子克隆及基因测序技术，建立一种川贝母对照药材DNA克隆液的制备方法，为中药材检定标准品的制备提供新方法和新思路，促进我国中药材标准现代化、国际化进程。
本发明的目的是由以下技术方案来实现的：
一种川贝母对照药材DNA克隆液的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离目的基因即获取川贝母DNA分子
取川贝母对照药材(中国食品药品检验研究院121000-201007)，按照《中国药典》2015年版一部第36-37页PCR-RFLP步骤操作，提取川贝母基因组DNA，并进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳进行分离，在紫外灯下切取PCR扩增产物，利用DNA回收试剂盒进行回收，获得川贝母目的基因，并测定其浓度；
(2)连接目的基因与载体，组成重组DNA分子
利用pGM-T连接试剂盒在冰盒上按照如下顺序加样：ddH2O 3μl，10×T4 DNALigation Buffer 1μl，目的基因(50ng/μl)4μl，pGM-T载体(50ng/μl)1μl，T4 DNA Ligase(3U/μl)1μl，总体积10μl。16℃水浴16-18h；
(3)重组DNA分子转化到DH5α感受态细胞中
取上述重组DNA分子5μl，加入到含感受态细胞50μl的EP管中，靠冲力混匀，然后冰浴30min，紧接着42℃水浴90s，接着冰浴2min。然后在EP管中加入37℃预热的SOC培养基900μl，轻柔混匀，在37℃培养箱中培养2.5h，然后6000rpm/min，离心3min，弃上清500μl，留菌液400μl，轻轻混匀，涂到2个含有Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上(注意避光)，在37℃培养箱中平板正放40min后倒置放置16-18h，试验设置不含Amp的阴性对照；
(4)筛选阳性重组菌菌落
在含有“蓝-白斑”的平板上挑取含有重组DNA分子的阳性菌落(即白色菌落)，放入含有Amp的LB液体培养基中，37℃空气浴摇床，220rpm/min，培养16-18h；
(5)从阳性重组菌中提取重组质粒DNA进行PCR扩增
按照质粒DNA提取试剂盒操作，从阳性重组菌中提取重组质粒DNA，以重组质粒DNA为模板，使用川贝母引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行验证目的基因的正确性；
(6)目的基因序列测定与比对
将重组质粒DNA送至上海生工，采用双向引物对目的基因进行序列测定。将测序结果与川贝母靶基因进行比对，比对结果同源性100％，表明克隆川贝母对照药材DNA序列准确无误，因此，川贝母对照药材DNA克隆液可以代替川贝母对照药材作为阳性对照品；
(7)阳性重组菌的长期保存
将含有序列比对同源性100％的重组质粒DNA的阳性重组菌接种到磁珠中，-80℃长期保存，随时使用，随时复苏。
本专利发明的川贝母对照药材DNA克隆液的制备方法，为中药材检定标准品的制备提供新方法和新思路，对我国中药材标准现代化、国际化具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，实施例仅用于说明本发明并非对本发明的限制。
实施例一 川贝母对照药材DNA克隆液的制备
1.分离目的基因即获取川贝母DNA分子
取川贝母对照药材(中国食品药品检验研究院121000-201007)，按照《中国药典》2015年版一部第36-37页PCR-RFLP步骤操作，提取川贝母基因组DNA，并进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳进行分离，在紫外灯下切取PCR扩增产物，利用DNA回收试剂盒进行回收，获得川贝母目的基因，并测定其浓度；
2.连接目的基因与载体，组成重组DNA分子
利用pGM-T连接试剂盒在冰盒上按照如下顺序加样：ddH2O 3μl，10×T4DNALigation Buffer 1μl，目的基因(50ng/μl)4μl，pGM-T载体(50ng/μl)1μl，T4 DNA Ligase(3U/μl)1μl，总体积10μl。16℃水浴16-18h；
3.重组DNA分子转化到DH5α感受态细胞中
取上述重组DNA分子5μl，加入到含感受态细胞50μl的EP管中，靠冲力混匀，然后冰浴30min，紧接着42℃水浴90s，接着冰浴2min。然后在EP管中加入37℃预热的SOC培养基900μl，轻柔混匀，在37℃培养箱中培养2.5h。然后6000rpm/min，离心3min，弃上清500μl，留菌液400μl，轻轻混匀，涂到2个含有Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上(注意避光)，在37℃培养箱中平板正放40min后倒置放置16-18h，试验设置不含Amp的阴性对照；
4.筛选阳性重组菌菌落
在含有“蓝-白斑”的平板上挑取含有重组DNA分子的阳性菌落(即白色菌落)，放入含有Amp的LB液体培养基中，37℃空气浴摇床，220rpm/min，培养16-18h；
5.从阳性重组菌中提取重组质粒DNA进行PCR扩增
按照质粒DNA提取试剂盒操作，从阳性重组菌中提取重组质粒DNA，以重组质粒DNA为模板，使用川贝母引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行验证目的基因的正确性；
6.目的基因序列测定与比对
将重组质粒DNA送至上海生工，采用双向引物对目的基因进行序列测定，将测序结果与川贝母靶基因进行比对，比对结果同源性100％，表明克隆川贝母对照药材DNA序列准确无误，因此，川贝母对照药材DNA克隆液可以代替川贝母对照药材作为阳性对照品；
7.阳性重组菌的长期保存
将含有序列比对同源性100％的重组质粒DNA的阳性重组菌接种到磁珠中，-80℃长期保存，随时使用，随时复苏。
实施例二 川贝母对照药材DNA克隆液的制备(复苏)
1.阳性重组菌复苏
从-80℃冰箱中取出磁珠，直接接种到含有Amp的LB液体培养基中，37℃空气浴摇床，220rpm/min，培养16-18h；
2.从阳性重组菌中提取重组质粒DNA进行PCR扩增
按照质粒DNA提取试剂盒操作，从阳性重组菌中提取重组质粒DNA，以重组质粒DNA为模板，使用川贝母引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行验证目的基因的正确性；
3.验证无误的重组质粒DNA即川贝母对照药材DNA克隆液。
附图说明
图1为PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳图谱，其中：M为100bp DNA Marker；1、2均为川贝母对照药材(121000-201007)，扩增出308bp DNA片段。
图2为“蓝-白斑”筛选图谱，其中：1为氨苄青霉素阴性(Amp-)平板，长满了细菌；2为氨苄青霉素阳性(Amp+)平板，只有含Amp抗性基因(质粒中)的细菌才生长，蓝斑为不含重组DNA分子的阴性菌落，白斑为含重组DNA分子的阳性菌落。
图3为PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳验证图谱，其中：M为100bp DNA Marker；1、2、3均为川贝母对照药材(121000-201007)克隆液，扩增出308bp DNA片段；4为空质粒。
图4为测序结果比对图谱，目的基因测序结果与靶基因进行序列比对分析，同源性100％。

Claims (1)

1.一种川贝母对照药材DNA克隆液的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离目的基因即获取川贝母DNA分子
取川贝母对照药材(中国食品药品检验研究院121000-201007)，按照《中国药典》2015年版一部第36-37页PCR-RFLP步骤操作，提取川贝母基因组DNA，并进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳进行分离。在紫外灯下切取PCR扩增产物，利用DNA回收试剂盒进行回收，获得川贝母目的基因，并测定其浓度；
(2)连接目的基因与载体，组成重组DNA分子
利用pGM-T连接试剂盒在冰盒上按照如下顺序加样：ddH2O 3μl，10×T4 DNA LigationBuffer 1μl，目的基因(50ng/μl)4μl，pGM-T载体(50ng/μl)1μl，T4 DNA Ligase(3U/μl)1μl，总体积10μl，16℃水浴16-18h；
(3)重组DNA分子转化到DH5α感受态细胞中
取上述重组DNA分子5μl，加入到含感受态细胞50μl的EP管中，靠冲力混匀，然后冰浴30min，紧接着42℃水浴90s，接着冰浴2min。然后在EP管中加入37℃预热的SOC培养基900μl，轻柔混匀，在37℃培养箱中培养2.5h，然后6000rpm/min，离心3min，弃上清500μl，留菌液400μl，轻轻混匀，涂到2个含有Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上(注意避光)，在37℃培养箱中平板正放40min后倒置放置16-18h，试验设置不含Amp的阴性对照；
(4)筛选阳性重组菌菌落
在含有“蓝-白斑”的平板上挑取含有重组DNA分子的阳性菌落(即白色菌落)，放入含有Amp的LB液体培养基中，37℃空气浴摇床，220rpm/min，培养16-18h；
(5)从阳性重组菌中提取重组质粒DNA进行PCR扩增
按照质粒DNA提取试剂盒操作，从阳性重组菌中提取重组质粒DNA，以重组质粒DNA为模板，使用川贝母引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行验证目的基因的正确性；
(6)目的基因序列测定与比对
将重组质粒DNA送至上海生工，采用双向引物对目的基因进行序列测定，将测序结果与川贝母基因组进行比对，比对结果同源性100％，表明克隆川贝母对照药材DNA序列准确无误，因此，川贝母对照药材DNA克隆液可以代替川贝母对照药材作为阳性对照品；
(7)阳性重组菌的长期保存
将含有序列比对同源性100％的重组质粒DNA的阳性重组菌接种到磁珠中，-80℃长期保存。随时使用，随时复苏。
CN201910465768.9A 2019-05-31 2019-05-31 川贝母对照药材dna克隆液的制备方法 Pending CN110714006A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910465768.9A CN110714006A (zh) 2019-05-31 2019-05-31 川贝母对照药材dna克隆液的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910465768.9A CN110714006A (zh) 2019-05-31 2019-05-31 川贝母对照药材dna克隆液的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110714006A true CN110714006A (zh) 2020-01-21

Family

ID=69209336

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910465768.9A Pending CN110714006A (zh) 2019-05-31 2019-05-31 川贝母对照药材dna克隆液的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110714006A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101831494A (zh) * 2010-04-27 2010-09-15 中国药科大学 一种含贝母的中成药中川贝母的分子生物学鉴定方法
CN108265122A (zh) * 2018-02-09 2018-07-10 贵州医科大学 快速鉴别川贝母真伪的pcr方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101831494A (zh) * 2010-04-27 2010-09-15 中国药科大学 一种含贝母的中成药中川贝母的分子生物学鉴定方法
CN108265122A (zh) * 2018-02-09 2018-07-10 贵州医科大学 快速鉴别川贝母真伪的pcr方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIN，G.Z.等: "Authentication of Bulbus Fritillariae Cirrhosae by RAPD-Derived DNA Markers.", 《MOLECULES》 *
孙丽媛 等: "中药材川贝母聚合酶链式反应法-限制性片段长度多态性分析的鉴别及应用研究", 《中国药学杂志》 *
李萧涵 等: "中药材川贝母标准品特异 DNA 指纹片段的克隆及鉴定", 《中国药学杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101649350B (zh) 一种快速区分蛹虫草交配型的分子检测方法
US20210207226A1 (en) Dna barcoding-based method for rapid identification of lycium chinensis
CN106011228A (zh) 一种鉴定枸杞品种的est-ssr核心引物组及其鉴定方法和应用
CN104630149B (zh) 外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法
CN104830969A (zh) 一种三七分子身份证及鉴定方法
CN101942467B (zh) 双关键酶基因转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法
CN110714006A (zh) 川贝母对照药材dna克隆液的制备方法
CN106244694A (zh) 同时应用两种限制性内切酶实现真菌鉴别的方法
CN101875974A (zh) 检测百日咳杆菌的引物组、检测试剂盒以及检测方法
CN106955361A (zh) 一种含有结核病变态反应原ce的药物组合物
CN111440890B (zh) 一株野生灵芝w141201的特征核苷酸序列、鉴别引物和鉴别方法
US20200126633A1 (en) Method for controlling the quality of traditional chinese patent medicines based on metagenomics
CN102229659A (zh) 黑斑蛙抗菌肽及其基因和应用
WO2021026693A1 (zh) 鉴定发酵虫草菌粉的特征性核苷酸、探针、试剂盒及方法
CN109810982A (zh) 短须库蠓的特异基因及其分子鉴定方法
CN105018622A (zh) 一种快速检测口蹄疫疫苗中培养基质bhk-21细胞残留的方法
CN109504782A (zh) 一对特异性鉴别宽体金线蛭的引物
CN113430186B (zh) 一种来自真菌中药的果糖激酶及其编码基因和应用
CN104894150B (zh) 天山雪莲细胞苯丙氨酸解氨酶基因SiPAL及其编码产物和应用
CN109457023A (zh) 鉴定皂荚性别的基因组合、ssr引物组合、鉴定方法和应用
CN104928307A (zh) 一种茎瘤芥硫苷酶基因myr1、茎瘤芥硫苷酶及其基因工程表达方法
CN103602754A (zh) 一种北冬虫夏草的特异pcr鉴真方法
CN111575409B (zh) 基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法
Song et al. Impact of gene dosage on recombinant transglutaminase production of Pichia pastoris
TWI521060B (zh) A method for culturing the larvae of Cordyceps sinensis, a composition comprising Cordyceps sinensis and its use

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200121