CN111575409B - 基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法 - Google Patents

基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，包括以下步骤，S1：将Vero E6细胞悬液稀释置于细胞培养箱中培养；S2：细胞密度达到90％时，弃去培养基，进行润洗；S3：将细胞加入含有整合素配体识别肽的基础培养基进行孵育；S4：弃液后，加入病毒维持液；S5：接种猪流行性腹泻病毒；S6：将接种有病毒的Vero E6细胞于细胞培养箱作用2h后吸除液体；S7：加入病毒维持液，置于细胞培养箱中培养；S8：储存细胞；S9：收集样品进行实时荧光定量PCR；S10：收集样品进行蛋白免疫印记；S11：统计研究结果。本发明中的研究方法能够验证整合素配体识别肽est、com、er是否具有抗PEDV感染作用，为PED的防控及抗病毒药物的开发提供参考。

Description

基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法
技术领域
本发明涉及猪流行性腹泻病毒感染技术领域，尤其涉及基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水为主要特征的一种高度接触性猪肠道传染病，对哺乳仔猪致死率高达100％。PEDV属于尼多病毒目、冠状病毒科、α-冠状病毒属(Alphacoronavirus)成员，是有囊膜的、不分节段、单股正链RNA病毒。近年来，PEDV感染呈现明显上升趋势。1972年，PED在英国首次被报道。2010年之后，中国、韩国、菲律宾、美国、德国等地大规模暴发，给养猪业造成了巨大的经济损失。随着PED的迅速蔓延，养猪场在疫苗接种方面的投入不断增加。
目前，PEDV感染临床尚无有效的抗病毒药物，疫苗接种依然是防治PEDV的主要措施。市场上获批用于预防及控制PED的疫苗多为传统PEDV弱毒苗、灭活苗和少数的基因工程疫苗，此类疫苗为防控PED发挥重要作用。但自2010年末开始，PEDV变异毒株在我国猪群中出现，导致传统疫苗不能完全为猪群防控PED提供有效的免疫保护，即便是针对变异株制备的传统疫苗也不能对所有猪群均起到保护作用。此外，传统疫苗还存在免疫保护力较弱、易散毒、毒力反强、针对变异株制备传统疫苗周期长等问题，以及目前在研发的PEDV基因工程苗又多存在表达量低、成本高等诸多问题，给该病的防控带来了巨大的挑战，PED的预防和治疗至关重要。
目前，有研究表明黄连素、甘草素、复方术芩提取液等中药组分具有抗PEDV活性，尽管有许多PEDV体内外抑制剂研究，但多处于实验室研究阶段，商品化开发应用的很少，并且存在生产环节复杂、成本高等缺点，因此，研发安全、高效的新型抗PEDV药物迫在眉睫。
整合素是一类分布比较广泛的细胞表面蛋白，是许多病毒感染的受体或共受体，在我们的前期研究中发现猪整合素αvβ3上调促进PEDV增殖作用，说明整合素可能是PEDV感染的辅助受体或感染促进因子。因此，以整合素为靶标设计的小分子化合物有可能会抑制PEDV感染。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，研究整合素配体识别肽是否具有抗PEDV感染作用，为PED的防控及抗病毒药物的开发提供参考。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：将生长并维持在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的高糖DMEM培养基中的Vero E6细胞悬液稀释成1×105个/mL，接入100cm2细胞培养皿，轻轻摇晃使细胞均匀分布，然后置于5％CO2，37℃细胞培养箱中培养；
S2：当Vero E6细胞密度达到90％时，弃去培养基，对Vero E6细胞进行润洗；
S3：将润洗后的Vero E6细胞加入含有40μmol整合素配体识别肽的基础培养基中，置于37℃细胞培养箱孵育6h；
S4：当Vero E6细胞密度达到90％时，弃去含有40μmol整合素配体识别肽的基础培养基，在Vero E6细胞中加入2mL病毒维持液润洗1遍，然后再在Vero E6细胞中加入6mL病毒维持液；
S5：在步骤S4的Vero E6细胞中接种猪流行性腹泻病毒；
S6：将接种有病毒的Vero E6细胞于5％CO2，37℃细胞培养箱作用2h后，轻轻吸除液体；
S7：在吸除液体后的接种有猪流行性腹泻病毒的Vero E6细胞中再加入病毒维持液，置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中培养；
S8：收集步骤S7中整合素配体识别肽处理过并接种猪流行性腹泻病毒的细胞样品，进行实时荧光定量PCR；
S9：收集步骤S7中整合素配体识别肽处理过并接种猪流行性腹泻病毒的细胞样品，进行蛋白免疫印记；
S10：将步骤S8和步骤S9进行三次独立重复试验进行研究，统计研究结果。
进一步的，步骤S2中的润洗操作具体包括：将Vero E6细胞用PBS轻轻润洗3遍，然后用无血清的DMEM基础培养基润洗一次。
进一步的，步骤S3中所述的整合素配体识别肽为est、com、er中的任一种。
进一步的，所述病毒维持液为含有0.25％胰酶的DMEM培养基。
进一步的，步骤S8的具体操作包括，
S81：根据总RNA提取试剂盒从收集的样品中提取总RNA；
S82：将总RNA定量反转录获得cDNA；
S83：用
Figure BDA0002505497530000031
SYBR qPCR SuperMix Plus通过实时荧光定量检测系统进行荧光定量PCR反应；
S84：反应结束后，读取Ct值。
进一步的，步骤S83的反应程序为：95℃30s；95℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环；92℃5s，60℃1min，95℃continues；50℃30s。
进一步的，步骤S9的具体操作包括，
S91：将收集的样品用适量含有PMSF的细胞裂解液置于冰上裂解45min，4℃12000rpm离心10min；
S92：取上清液加入4倍体积的5×蛋白上样Buffer，吹打混匀后再95℃加热5min，瞬离；
S93：待样品冷却后进行SDS-PAGE电泳，湿转到孔径0.45μm的PVDF膜上，将膜用含5％脱脂乳，0.05％吐温的PBS溶液于室温封闭4h；用相应的一抗在4℃条件下孵育过夜；
S94：用PBST充分洗5次后，将膜与对应的二抗室温避光条件下孵育2h，用0.05％吐温的PBS溶液充分洗5次后，膜上滴加适量ECL发光液，避光作用1min；
S95：通过ECL增强化学发光系统曝光成像，使用Image J 2x进行灰度分析。
进一步的，步骤S93中所述的一抗为鼠源PEDV-N单抗和鼠源GAPDH单抗。
进一步的，步骤S94中所述的二抗为羊抗鼠IgG。
本发明的有益效果是：
1、本发明中基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法对整合素配体识别肽进行抗PEDV活性验证，应用实时Western Blot技术检测Vero E6细胞中PEDV N蛋白表达水平，与对照组相比，用est、com、er三种肽处理细胞后，PEDV N蛋白的表达水平分别下降了64.4％、62％和54％；应用实时荧光定量PCR技术检测PEDV mRNA拷贝数，结果显示，三种肽处理细胞后PEDV mRNA相对水平均下降，即est、com和er均可抑制PEDV粘附和内化作用，具有抗PEDV活性，为PED的防控及抗病毒药物的开发提供参考。
2、本发明中基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法中所使用的整合素配体识别肽est、com、er为三个氨基酸的短肽，具有绿色环保、生产成本低、加工工艺简单等特点，最重要的是短肽可以加至动物饮用水中使用或注射使用，不受剂型的限制，不存在配伍禁忌，具有很好的应用前景，有望成为预防病毒感染的潜在药物。
附图说明
图1为本发明中PEDV S蛋白模型中整合素配体识别序列的位置示意图；
图2为本发明中PEDV感染细胞中加入不同的整合素配体识别肽后蛋白表达水平柱状图；
图3为本发明中验证est、com、er三种整合素配体识别肽对PEDV粘附细胞的影响时，利用实时荧光定量PCR技术检测PEDV mRNA拷贝数结果柱状图；
图4为本发明中验证est、com、er三种整合素配体识别肽对PEDV内化细胞的影响时，利用实时荧光定量PCR技术检测PEDV mRNA拷贝数结果柱状图；
图5为本发明中用40μmol est、com、er和15μg/mL surfactin分别预处理Vero E6细胞，接种猪流行性病毒后PEDV N蛋白表达水平柱状图；
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例一：
基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，包括以下步骤，
S1：将生长并维持在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的高糖DMEM培养基中的Vero E6细胞悬液稀释成1×105个/mL，接入100cm2细胞培养皿，轻轻摇晃使细胞均匀分布，然后置于5％CO2，37℃细胞培养箱中培养；
S2：当Vero E6细胞密度达到90％时，弃去培养基，对Vero E6细胞进行润洗；
具体的，将Vero E6细胞用PBS轻轻润洗3遍，然后用无血清的DMEM基础培养基润洗一次。
S3：将润洗后的Vero E6细胞加入含有40μmol整合素配体识别肽的基础培养基中，置于37℃细胞培养箱孵育6h；
具体的，所述的整合素配体识别肽为est。
S4：当Vero E6细胞密度达到90％时，弃去含有40μmol整合素配体识别肽的基础培养基，在Vero E6细胞中加入2mL病毒维持液润洗1遍，然后再在Vero E6细胞中加入6mL病毒维持液；
具体的，所述病毒维持液为含有0.25％胰酶的DMEM培养基。
S5：在步骤S4的Vero E6细胞中接种猪流行性腹泻病毒；
S6：将接种有病毒的Vero E6细胞于5％CO2，37℃细胞培养箱作用2h后，轻轻吸除液体；
S7：在吸除液体后的接种有猪流行性腹泻病毒的Vero E6细胞中再加入病毒维持液，置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中培养；
S8：收集步骤S7中整合素配体识别肽处理过的猪流行性腹泻病毒细胞样品，进行实时荧光定量PCR；
具体的，S81：根据总RNA提取试剂盒从收集的样品中提取总RNA；
S82：根据FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂说明书将总RNA定量反转录获得cDNA；
S83：用
Figure BDA0002505497530000062
SYBR qPCR SuperMix Plus法通过实时荧光定量检测系统进行荧光定量PCR反应；
所用荧光定量PCR引物如表1所示，荧光定量PCR的反应体系如表2所示。
表1荧光定量PCR引物
Figure BDA0002505497530000061
表2荧光定量反应体系
Figure BDA0002505497530000071
加样时注意避光，将荧光定量反应体系加于0.1mL的八联管内，混匀后瞬离上机，反应程序为：95℃30s；95℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环；92℃5s，60℃1min，95℃continues；50℃30s。
S84：反应结束后，读取Ct值。
进一步的，步骤S9：收集步骤S7中整合素配体识别肽处理过的猪流行性腹泻病毒细胞样品，进行蛋白免疫印记；
具体的，S91：将收集的样品用适量含有PMSF的细胞裂解液置于冰上裂解45min，4℃12000rpm离心10min；
S92：取上清液加入4倍体积的5×蛋白上样Buffer，吹打混匀后在95℃加热5min，瞬离；
S93：待样品冷却后进行SDS-PAGE电泳，湿转到孔径0.45μm的PVDF膜上，将膜用含5％脱脂乳，0.05％吐温的PBS溶液于室温封闭4h；用相应的一抗在4℃条件下孵育过夜；所述一抗为鼠源PEDV-N单抗和鼠源GAPDH单抗；
S94：用PBST充分洗5次后，将膜与对应的二抗室温避光条件下孵育2h，用0.05％吐温的PBS溶液充分洗5次后，膜上滴加适量ECL发光液，避光作用1min；所述二抗为羊抗鼠IgG；
S95：通过ECL增强化学发光系统曝光成像，使用Image J 2x进行灰度分析。
进一步的，S10：将步骤S8和步骤S9进行三次独立重复试验进行研究，统计研究结果。
具体的，运用ΔΔCt法对步骤S8中的Ct值数据进行分析，对步骤S9中的灰度数据进行分析。使用软件GraphPad prism 8.0进行数据统计与分析，P>0.05表示无显著性差异，不标记；0.01<P<0.05表示显著性差异，通常以*标记；P<0.01表示极显著性差异，通常以**标记。
实施例二：
实施例二与实施例一的区别仅在于所使用的整合素配体识别肽为com，其他操作均相同。
实施例三：
实施例三与实施例一的区别仅在于所使用的整合素配体识别肽为er，其他操作均相同。
进一步的，实施例一实施例三中的研究结果如下：
1、PEDV S蛋白中整合素配体识别序列分析
将从NCBI数据库下载的PEDV CV777毒株S蛋白氨基酸序列(GenBank:AF353511.1)导入至Editseq软件，查找整合素配体识别序列，经整理如表3所示，整合素配体识别序列DGE位于第1133-1135位氨基酸，KGE位于第621-623位和第655-657位氨基酸，RLD位于第1070-1072位氨基酸，IET位于第67-69位氨基酸，LDV位于第643-645位和第1266-1268位氨基酸，IDS位于第81-83位氨基酸。
表3 PEDV S蛋白中整合素配体识别序列的位置
Figure BDA0002505497530000081
在RCSB PDB蛋白质数据库中下载PEDV经典毒株CV777的S蛋白模型(PDB：6U7K)，用Pymol软件定位各个整合素配体识别序列在该S蛋白模型中的位置，如附图1所示，从附图1中可以看出，在PEDV S蛋白三聚体模型表面可见DGE、KGE、RLD和LDV，PEDV可能利用这四个关键氨基酸位点感染Vero E6细胞，受蛋白结构特性的影响，在PEDV S蛋白模型未见IET和IDS两个整合素配体识别序列。
2、整合素配体识别肽具有抗PEDV感染活性
为了验证本发明中的整合素配体识别肽是否具有抗PEDV感染活性，用另外三种整合素配体识别肽(sus-1，sus-2，sus-3)分别预处理Vero E6细胞，6h后弃液，PEDV感染细胞2h后弃液加入病毒维持液，继续置于细胞培养箱中培养，48h后收集样品，用裂解液进行总蛋白的提取，通过Western Blot技术检测PEDV N蛋白相对表达水平。与本发明中实施例一、实施例二和实施例三中的PEDV N蛋白相对表达水平进行对比，结果如附图2所示。
从附图2中可以看出，est、com、er三种整合素配体识别肽可显著抑制PEDV N蛋白相对表达水平，其他整合素配体识别肽不能显著抑制PEDV感染。
3、整合素配体识别肽抑制PEDV粘附作用
为验证est、com、er三种整合素配体识别肽对PEDV粘附细胞的影响，将实施例一至实施例三中用三种不同的肽分别预处理Vero E6细胞6h后弃液，用预冷PBS轻轻润洗细胞一次，接种病毒液后置于4℃感染2h，使病毒只粘附细胞表面，弃去未粘附细胞的病毒，用预冷PBS收集细胞样品，提取细胞总RNA，通过一步法定量反转录获得cDNA，通过实时荧光定量PCR技术检测PEDV mRNA拷贝数，结果如附图3所示。
从附图3中可以看出，est、com、er三种整合素配体识别肽均可抑制PEDV mRNA相对水平，抑制PEDV粘附细胞。
4、整合素配体识别肽抑制PEDV内化作用
为验证est、com、er三种整合素配体识别肽对PEDV内化细胞的影响，将实施例一至实施例三中用三种不同的肽分别预处理Vero E6细胞6h后弃液，用常温PBS轻轻润洗细胞一次，接种病毒液后置于37℃孵育2h后，弃液，补充病毒维持液置于37℃细胞培养箱中培养2h，弃去病毒维持液，用PBS轻轻润洗3遍细胞表面，利用0.25％的胰酶消化掉未内化入细胞的病毒粒子，再用PBS洗3遍细胞沉淀，收集细胞样品后提取总RNA，通过一步法反转录得到cDNA，应用实时荧光定量PCR技术检测PEDV mRNA拷贝数，结果如附图4所示。
从附图4中可以看出，est、com、er三种整合素配体识别肽显著抑制PEDV mRNA相对水平，整合素配体识别肽抑制PEDV内化细胞。
5、整合素配体识别肽的药物对比结果
为了比较整合素配体识别肽与表面活性肽surfactin的抗病毒效果，用40μmolest、com、er和15μg/mL surfactin分别预处理Vero E6细胞6h后弃液，病毒感染细胞2h后弃液，加入病毒维持液继续置于细胞培养箱中培养48h后收集样品，用裂解液裂解获得蛋白液，通过Western Blot技术检测PEDV N蛋白表达水平，结果如附图5所示。
从附图5中可以看出，est、com、er三种肽以及表面活性肽surfactin具有良好的抗PEDV活性，与对照组DMEM组相比，PEDV N蛋白表达水平分别下降了64.4％、62％、54％和50％，surfactin组抑制水平包含其溶剂乙醇的作用。
综合上述所有研究结果，可以看出，est、com、er三种肽具有较好的抗PEDV活性，主要发挥作用的阶段是病毒感染早期，有较好的预防作用，能够为PED的防控及抗病毒药物的开发提供参考。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4152
<212> DNA
<213> 猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 1
atgaggtctt taatttactt ctggttgctc ttaccagtac ttccaacact cagcctacca 60
caagatgtca ctaggtgcca gtctactact aactttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120
gttcaggcac ctgccgtcgt cgttttgggt ggttacctac ctagtatgaa ctcttctagc 180
tggtactgtg gcacaggcat tgaaactgct agtggcgttc atggtatttt tctcagctac 240
atcgattctg gtcagggctt tgagattggc atttcgcaag agccgtttga tcctagtggt 300
taccagcttt atttacataa ggccactaat ggtaacacta atgctattgc acgactgcgc 360
atttgccagt ttcccgataa taaaacattg ggccctactg ttaatgatgt tacaacaggt 420
cgtaactgcc tattcaacaa agccattcca gcttatatgc gtgatggaaa agatattgtt 480
gtcggcataa catgggataa tgatcgtgtc actgtttttg ctgacaagat ctatcatttt 540
tatcttaaaa atgattggtc ccgcgttgcg acaagatgtt acaatcgcag aagttgtgct 600
atgcaatatg tttatacacc tacctactac atgcttaatg ttactagtgc aggtgaggat 660
ggcatttatt atgaaccctg tacagctaat tgcactggtt acgctgccaa tgtatttgcc 720
actgattcca atggccatat accagaaggt tttagtttta ataattggtt tcttttatcc 780
aatgactcca ctttgttgca tggtaaagtg gtttccaacc aacccttgtt ggtcaattgt 840
cttttggcca ttcctaagat ttatggacta ggccaatttt tctcattcaa tcacacgatg 900
gatggcgttt gtaatggagc tgctgtggat cgtgccccag aggctctgag gtttaatatt 960
aatgacacct ccgtcattct tgctgaaggc tcaattgtac ttcatactgc tttaggaaca 1020
aatctttctt ttgtttgcag taattcctca gatcctcatt tagccatctt tgccatacct 1080
ctgggtgcta ctgaagtacc ctactattgc tttcttaaag tggatactta caactccact 1140
gtttataaat tcttggctgt tttacctcct actgtcaggg aaattgtcat caccaagtat 1200
ggtgatgttt atgtcaatgg gtttggctat ttgcatctcg gtttgttgga tgctgtcaca 1260
attaatttca ctggtcatgg cactgacgat gacgtttcag gtttctggac catagcatcg 1320
actaattttg ttgatgcact catcgaggtt caaggaactt ccattcagcg tattctttat 1380
tgtgatgatc ctgttagcca actcaagtgt tctcaggttg cttttgacct tgacgatggt 1440
ttttacccca tctcttctag aaaccttctg agtcacgaac agccaatttc ttttgttact 1500
ttgccatcat ttaatgatca ttcttttgtt aatattactg tctctgcggc ttttggtggt 1560
cttagtagtg ccaatctcgt tgcatctgac actactatca atgggtttag ttctttctgt 1620
gttgacacta gacaatttac cattacactg ttttataatg ttacaaacag ttatggttat 1680
gtgtctaaat cacaggatag taattgtcct ttcaccttgc aatctgttaa tgattacctg 1740
tcttttagca aattttgtgt ttcaaccagc cttttggctg gtgcttgtac catagatctt 1800
tttggttacc ctgcgttcgg tagtggtgtt aagttgacgt ccctttattt tcaattcaca 1860
aaaggtgagt tgattactgg cacgcctaaa ccacttgaag gtatcacaga cgtttctttt 1920
atgactctgg atgtgtgtac caagtatact atctatggct ttaaaggtga gggtattatt 1980
acccttacaa attctagcat tttggcaggt gtttattata catctgattc tggacagttg 2040
ttagccttta agaatgtcac tagtggtgct gtttattctg tcacgccatg ttctttttca 2100
gagcaggctg catatgttaa tgatgatata gtgggtgtta tttctagttt gtctaactcc 2160
acttttaaca atactaggga gttgcctggt ttcttctacc attctaatga cggctccaat 2220
tgtacagagc ctgtgttggt gtatagtaac ataggtgttt gtaaatctgg cagtattggc 2280
tatgttccat ctcagtatgg ccaagtcaag attgcaccca cggttactgg gaatattagt 2340
attcccacca actttagtat gagtattaga acagaatatt tacagcttta caacacgcct 2400
gttagtgttg attgtgctac atatgtttgt aatggtaact ctcgttgtaa acaattactc 2460
acccagtaca ctgcagcatg taagaccata gagtcagcat tacaactcag cgctaggctt 2520
gagtctgttg aagttaactc tatgcttacc atttctgaag aggctttaca gttagctacc 2580
atcagttcgt ttaatggtga tggatataac tttactaatg tgctgggtgc ttccgtgtac 2640
gatcctgcaa gtggcagggt ggtacaaaaa aggtctgtta ttgaagactt gctttttaat 2700
aaagtggtta ctaatggcct tggtactgtt gatgaagact ataagcgctg ttctaatggt 2760
cgctctgtgg ctgatctagt ctgtgcgcag tattactctg gtgtcatggt actacctggc 2820
gttgttgacg ctgagaagct tcacatgtac agtgcgtctc tcataggtgg tatggcgcta 2880
ggaggtataa ctgctgcagc ggcattgcct tttagctatg ctgttcaagc gagactcaat 2940
tatcttgctt tacagacgga tgttctacag cggaaccagc aattgcttgc tgagtctttt 3000
aactctgcta ttggtaatat aacttcagcc tttgagagtg ttaaagaggc tattagtcaa 3060
acttccaagg gtttgaacac tgtggctcat gcgcttacta aggttcaaga ggttgttaat 3120
tcgcagggtt cagctttgaa ccaacttacc gtacagctgc aacacaactt ccaagccatt 3180
tctagttcta ttgatgacat ttattcccga ctggacattc tttcagccga tgttcaggtt 3240
gatcgtctca tcaccggcag attatcagca cttaatgctt ttgttgccca aaccctcact 3300
aagtatactg aggttcaggc tagcaggaag ctagcacagc aaaaggttaa tgagtgcgtc 3360
aaatcgcaat ctcagcgtta cggtttttgt ggtggtgatg gcgagcacat tttctctctg 3420
gtacaggccg cacctcaggg cctgctgttc ttacatacag tacttgtacc gggtgatttt 3480
gtaaatgttc ttgccatcgc tggcttatgc gttaatggtg aaattgcctt gactctacgt 3540
gagcctggct tagtcttgtt tacgcatgaa cttcaaactt atactgcgac ggaatatttt 3600
gtttcatcgc gacgtatgtt tgaacctaga aaacctaccg ttagtgattt tgttcaaatt 3660
gagagttgtg tggtcaccta tgtcaatctg actagcgacc agctaccaga tgtaatccca 3720
gattacatcg atgttaacaa aacacttgat gagattttag cttctctgcc caatagaact 3780
ggtccaagtc ttcccctaga tgtttttaat gccacttatc ttaatcttac tggtgaaatt 3840
gcagatctag agcagcgttc agagtctctc cgtaatacta cagaagagct ccgaagtctc 3900
attaacaaca tcaacaacac acttgttgac cttgagtggc tcaaccgagt tgagacatac 3960
atcaagtggc cgtggtgggt ttggttgatc attgttattg ttctcatctt tgttgtgtca 4020
ttactagtgt tctgctgcat ttccacgggt tgttgtggat gctgcggttg ctgcggtgct 4080
tgtttttcag gttgttgtag gggtcctaga cttcaacctt acgaagcttt tgaaaaggtc 4140
cacgtgcagt ga 4152
<210> 2
<211> 1383
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 2
Met Arg Ser Leu Ile Tyr Phe Trp Leu Leu Leu Pro Val Leu Pro Thr
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Gln Ser Thr Thr Asn Phe
            20                  25                  30
Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val
        35                  40                  45
Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ser Met Asn Ser Ser Ser Trp Tyr Cys Gly
    50                  55                  60
Thr Gly Ile Glu Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Leu Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Ile Asp Ser Gly Gln Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu Pro Phe
                85                  90                  95
Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn Gly Asn
            100                 105                 110
Thr Asn Ala Ile Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Asp Asn Lys
        115                 120                 125
Thr Leu Gly Pro Thr Val Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu
    130                 135                 140
Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala Tyr Met Arg Asp Gly Lys Asp Ile Val
145                 150                 155                 160
Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ala Asp Lys
                165                 170                 175
Ile Tyr His Phe Tyr Leu Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val Ala Thr Arg
            180                 185                 190
Cys Tyr Asn Arg Arg Ser Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Thr Pro Thr
        195                 200                 205
Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Tyr Tyr
    210                 215                 220
Glu Pro Cys Thr Ala Asn Cys Thr Gly Tyr Ala Ala Asn Val Phe Ala
225                 230                 235                 240
Thr Asp Ser Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe Asn Asn Trp
                245                 250                 255
Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Leu His Gly Lys Val Val Ser
            260                 265                 270
Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro Lys Ile Tyr
        275                 280                 285
Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn His Thr Met Asp Gly Val Cys
    290                 295                 300
Asn Gly Ala Ala Val Asp Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg Phe Asn Ile
305                 310                 315                 320
Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val Leu His Thr
                325                 330                 335
Ala Leu Gly Thr Asn Leu Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser Ser Asp Pro
            340                 345                 350
His Leu Ala Ile Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Thr Glu Val Pro Tyr
        355                 360                 365
Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val Tyr Lys Phe
    370                 375                 380
Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile Thr Lys Tyr
385                 390                 395                 400
Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu Gly Leu Leu
                405                 410                 415
Asp Ala Val Thr Ile Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp Asp Asp Val
            420                 425                 430
Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp Ala Leu Ile
        435                 440                 445
Glu Val Gln Gly Thr Ser Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys Asp Asp Pro
    450                 455                 460
Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ala Phe Asp Leu Asp Asp Gly
465                 470                 475                 480
Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Arg Asn Leu Leu Ser His Glu Gln Pro Ile
                485                 490                 495
Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile
            500                 505                 510
Thr Val Ser Ala Ala Phe Gly Gly Leu Ser Ser Ala Asn Leu Val Ala
        515                 520                 525
Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg
    530                 535                 540
Gln Phe Thr Ile Thr Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr
545                 550                 555                 560
Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val
                565                 570                 575
Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu
            580                 585                 590
Ala Gly Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Ala Phe Gly Ser
        595                 600                 605
Gly Val Lys Leu Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu
    610                 615                 620
Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Ile Thr Asp Val Ser Phe
625                 630                 635                 640
Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly Phe Lys Gly
                645                 650                 655
Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Ile Leu Ala Gly Val Tyr
            660                 665                 670
Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn Val Thr Ser
        675                 680                 685
Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu Gln Ala Ala
    690                 695                 700
Tyr Val Asn Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu Ser Asn Ser
705                 710                 715                 720
Thr Phe Asn Asn Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr His Ser Asn
                725                 730                 735
Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser Asn Ile Gly
            740                 745                 750
Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln Tyr Gly Gln
        755                 760                 765
Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile Pro Thr Asn
    770                 775                 780
Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr Asn Thr Pro
785                 790                 795                 800
Val Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn Ser Arg Cys
                805                 810                 815
Lys Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr Ile Glu Ser
            820                 825                 830
Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Val Glu Val Asn Ser Met
        835                 840                 845
Leu Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile Ser Ser Phe
    850                 855                 860
Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Ala Ser Val Tyr
865                 870                 875                 880
Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Val Ile Glu Asp
                885                 890                 895
Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr Val Asp Glu
            900                 905                 910
Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp Leu Val Cys
        915                 920                 925
Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val Val Asp Ala
    930                 935                 940
Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly Met Ala Leu
945                 950                 955                 960
Gly Gly Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr Ala Val Gln
                965                 970                 975
Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu Gln Arg Asn
            980                 985                 990
Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly Asn Ile Thr
        995                 1000                1005
Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Thr Ser Lys Gly
    1010                1015                1020
Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val Gln Glu Val Val Asn
1025                1030                1035                1040
Ser Gln Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Thr Val Gln Leu Gln His Asn
                1045                1050                1055
Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp Asp Ile Tyr Ser Arg Leu Asp
            1060                1065                1070
Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu
        1075                1080                1085
Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val Ala Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Thr Glu
    1090                1095                1100
Val Gln Ala Ser Arg Lys Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn Glu Cys Val
1105                1110                1115                1120
Lys Ser Gln Ser Gln Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp Gly Glu His
                1125                1130                1135
Ile Phe Ser Leu Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu Phe Leu His
            1140                1145                1150
Thr Val Leu Val Pro Gly Asp Phe Val Asn Val Leu Ala Ile Ala Gly
        1155                1160                1165
Leu Cys Val Asn Gly Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu Pro Gly Leu
    1170                1175                1180
Val Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Thr Tyr Thr Ala Thr Glu Tyr Phe
1185                1190                1195                1200
Val Ser Ser Arg Arg Met Phe Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val Ser Asp
                1205                1210                1215
Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu Thr Ser
            1220                1225                1230
Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val Asn Lys Thr
        1235                1240                1245
Leu Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr Gly Pro Ser Leu
    1250                1255                1260
Pro Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn Leu Thr Gly Glu Ile
1265                1270                1275                1280
Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu Arg Asn Thr Thr Glu Glu
                1285                1290                1295
Leu Arg Ser Leu Ile Asn Asn Ile Asn Asn Thr Leu Val Asp Leu Glu
            1300                1305                1310
Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Trp Val Trp
        1315                1320                1325
Leu Ile Ile Val Ile Val Leu Ile Phe Val Val Ser Leu Leu Val Phe
    1330                1335                1340
Cys Cys Ile Ser Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala
1345                1350                1355                1360
Cys Phe Ser Gly Cys Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro Tyr Glu Ala
                1365                1370                1375
Phe Glu Lys Val His Val Gln
            1380

Claims (8)

1.基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：将生长并维持在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素溶液的高糖DMEM培养基中的Vero E6细胞悬液稀释成1×105个/mL，接入100cm2细胞培养皿，轻轻摇晃使细胞均匀分布，然后置于5％CO2，37℃细胞培养箱中培养；
S2：当Vero E6细胞密度达到90％时，弃去培养基，对Vero E6细胞进行润洗；
S3：将润洗后的Vero E6细胞加入含有40μmol整合素配体识别肽的基础培养基中，置于37℃细胞培养箱孵育6h；所述的整合素配体识别肽为est，且整合素配体识别肽est的氨基酸序列为IET；
S4：当Vero E6细胞密度达到90％时，弃去含有40μmol整合素配体识别肽的基础培养基，在Vero E6细胞中加入2mL病毒维持液润洗1遍，然后再在Vero E6细胞中加入6mL病毒维持液；
S5：在步骤S4的Vero E6细胞中接种猪流行性腹泻病毒；
S6：将接种有病毒的Vero E6细胞于5％CO2，37℃细胞培养箱作用2h后，轻轻吸除液体；
S7：在吸除液体后的接种有猪流行性腹泻病毒的Vero E6细胞中再加入病毒维持液，置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中培养；
S8：收集步骤S7中整合素配体识别肽处理过并接种猪流行性腹泻病毒的细胞样品，进行实时荧光定量PCR；
S9：收集步骤S7中整合素配体识别肽处理过并接种猪流行性腹泻病毒的细胞样品，进行蛋白免疫印记；
S10：将步骤S8和步骤S9进行三次独立重复试验进行研究，统计研究结果。
2.根据权利要求1所述的基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，其特征在于：步骤S2中的润洗操作具体包括：将Vero E6细胞用PBS轻轻润洗3遍，然后用无血清的DMEM基础培养基润洗一次。
3.根据权利要求1所述的基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，其特征在于：所述病毒维持液为含有0.25％胰酶的DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，其特征在于，步骤S8的具体操作包括，
S81：根据总RNA提取试剂盒从收集的样品中提取总RNA；
S82：将总RNA定量反转录获得cDNA；
S83：用
Figure FDA0004112126010000021
SYBR qPCR SuperMix Plus通过实时荧光定量检测系统进行荧光定量PCR反应；
S84：反应结束后，读取Ct值。
5.根据权利要求4所述的基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，其特征在于，步骤S83的反应程序为：95℃30s；95℃30s，60℃30s，72℃30s，40个循环；92℃5s，60℃1min，95℃continues；50℃30s。
6.根据权利要求1所述的基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，其特征在于，步骤S9的具体操作包括，
S91：将收集的样品用适量含有PMSF的细胞裂解液置于冰上裂解45min，4℃12000rpm离心10min；
S92：取上清液加入4倍体积的5×蛋白上样Buffer，吹打混匀后再95℃加热5min，瞬离；
S93：待样品冷却后进行SDS-PAGE电泳，湿转到孔径0.45μm的PVDF膜上，将膜用含5％脱脂乳，0.05％吐温的PBS溶液于室温封闭4h；用相应的一抗在4℃条件下孵育过夜；
S94：用PBST充分洗5次后，将膜与对应的二抗室温避光条件下孵育2h，用0.05％吐温的PBS溶液充分洗5次后，膜上滴加适量ECL发光液，避光作用1min；
S95：通过ECL增强化学发光系统曝光成像，使用Image J 2x进行灰度分析。
7.根据权利要求6所述的基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，其特征在于，步骤S93中所述的一抗为鼠源PEDV-N单抗和鼠源GAPDH单抗。
8.根据权利要求6所述的基于整合素配体识别肽抑制猪流行性腹泻病毒感染的研究方法，其特征在于，步骤S94中所述的二抗为羊抗鼠IgG。
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