CN102337357A - 用于检测小鼠呼肠孤病毒ⅲ型的引物、探针及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物、探针及其方法，所述引物是由具有序列表中的SEQ ID NO：1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：2的下游引物组成的一对寡核苷酸，与所述引物配合使用的探针具有序列表中的SEQ ID NO：3的核苷酸序列。用本发明的方法及试剂盒检测小鼠呼肠孤病毒III型具有快速简单、灵敏度高、特异性强且回收率高的优点，解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的不足，具有很好的应用前景。

Description

用于检测小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型的引物、探针及其方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物、探针及其方法。

背景技术

自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。

现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中小鼠呼肠孤病毒III型属于一类，人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物，对人体来说有很大的危险性。因此，鼠源性病毒检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。

呼肠孤病毒(Reoviridae)全称为呼吸道(respiratory)、肠道(enteric)和孤儿(orphan)病毒。呼肠孤病毒的基因组是分节段的双股RNA。1994年ICTV第6次病毒分类报告中，统一定位为属，将呼肠孤病毒科下设正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、科州蜱传热病毒属、水生呼肠孤病毒属、斐济病毒属、植物呼肠孤病毒属及水稻矮缩条叶枯病毒属。

呼肠孤病毒分为I、II和III型，其中呼肠孤病毒III型(Reovirus 3，Reo3)属于呼肠孤病毒科的正呼肠孤病毒属，Reo3具有特征的二十面体对称的双层衣壳结构，病毒粒子的核心由十条双链RNA基因组以及其密切链接的内衣壳组成，此外还有一层外衣壳，无囊膜，是呼肠孤病毒中致病性最强的。该病毒能感染所有哺乳动物，在啮齿类动物群体中多呈隐性感染。Reo3可引起小鼠“油毛综合征”，表现为黄疸、腹泻、矮小、毛皮油亮以及神经症状如运动失调等。还可引起乳鼠多种系统性疾病，包括坏死性肝炎、心肌炎及胰腺炎以及脑膜炎等病变，死亡率可达50％。

药典规定的鼠源病毒检测方法有：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。

而目前发展十分成熟的实时荧光定量PCR技术(Real-time FluorenceQuantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)检测灵敏度高，简单方便，且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Applied biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’-3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。

实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领域。迄今为止，实时荧光定量PCR技术检测小鼠呼肠孤病毒III型方面还未见有报道，无疑有着很广阔的发展空间。

发明内容

为了解决现有小鼠呼肠孤病毒III型检测方法的不足，本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物、探针及其方法，该方法简单方便、灵敏度高且检测时间短。

本发明的一个目的是提供一对用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物。

本发明提供的引物，是由具有序列表中的SEQ ID NO：1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：2的下游引物组成的一对寡核苷酸。

序列表中的SEQ ID NO：1由20个碱基组成；序列表中的SEQ IDNO：2由19个碱基组成。

本发明人设计了多对PCR引物，经过长期大量的实验从众多引物对中筛选出了由上述上游引物和下游引物组成的引物对。其扩增片断大小为100bp。该引物对小鼠呼肠孤病毒III型具有高度的保守性，且与小鼠基因组不具有显著的同源性，使用该引物进行PCR扩增，可实现准确定性、定量检测。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的探针，所述探针具有序列表中的SEQ ID NO：3的核苷酸序列，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

所述探针中荧光报告基团可选自包括但不限于FAM、VIC、JOE、HEX中的任意一种，优选为FAM；所述荧光淬灭基团选自TAMRA或Eclipse，优选为TAMRA。

所述序列表中的SEQ ID NO：3由27个碱基组成。

本发明的再一个目的是提供一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的方法，所述方法使用上述提及引物及探针进行实时荧光定量PCR检测。

优选地，所述实时荧光定量PCR的反应体系还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。

优选地，所述实时荧光定量PCR的退火温度为60℃。

优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：48℃，15min；95℃，10min；95℃，15sec，60℃，40sec，共40个循环。

优选地，所述方法还包括标准曲线的建立，方法为：扩增含序列表中SEQ ID NO：4所示的碱基同源序列的pMD18-T载体，得到190bp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA作为阳性RNA标准品，将其十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的标准曲线。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的试剂盒，所述试剂盒含上述提及的引物探针。

优选地，所述试剂盒的反应体系还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。

优选地，所述RT-PCR扩增试剂为2×Taqman PCR Mix、40×TaqmanRT-Enzyme MIX，也可直接使用Taqman RNA-Ct 1-Step kit。

优选地，所述阳性RNA标准品通过下述方法获得：扩增含序列表中SEQ ID NO：4所示的碱基同源序列的pMD18-T载体，得到190bp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得RNA即标准品。

本发明的还一个目的是提供上述提及的引物或探针在检测鼠源生物制品中呼肠孤病毒III型残留时的应用。

与现有检测方法相比，本发明提供的荧光定量PCR方法检测小鼠呼肠孤病毒III型具有以下优点：

1、简单快速：现有的药典小鼠呼肠孤病毒III型检测方法为：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验，从生物学效应角度检测生物制品中小鼠呼肠孤病毒III型的潜在感染，需时长(1～4周时间)，而本发明从核酸角度对呼肠孤病毒III型进行检测，从样品RNA提取开始到获得结果只需要6小时左右，其中本发明荧光定量PCR使用的是一步法反应体系，操作更为简便快速，只需1小时45分钟的时间。并且，本发明对操作实验室环境要求不高，规避了以前抽检产品可能产生的漏洞，可在企业实现批批检测，进一步提高了生物制品质控质量；

2、灵敏度高：现有检测方法是从生物学效应角度检测生物制品中小鼠呼肠孤病毒III型的潜在感染，其中因制剂在制备过程中经过了多个工艺步骤的处理，残留鼠源病毒的活病毒抗原及病毒抗体存在的可能性极小，而本发明从病毒核酸角度进行检测，相对前述药典规定方法而言，提高了检测的灵敏度。利用本发明中的实时荧光定量PCR检测鼠源生物制品中呼肠孤病毒III型时，可以准确定量，目标RNA在102～107浓度范围内，都有很好的线性关系，灵敏度高可达到20copies/μl(100copies/reaction)；

3、重复性、准确性和特异性：本发明中的引物和探针根据小鼠Reo3M2、M3的同源性序列设计，且与小鼠基因组无同源性，检测特异性强，重复性好；

4、准确性更高：本发明使用的是RNA标准品，更贴近病毒的天然状态；同时，在进行检测时标准品和样品都是RNA，在提取和扩增体系上具有一致性，从而弥补了常用DNA为标准品无法衡量在RT步骤中的检测效率的缺陷，准确性更高；

5、回收率高：本发明从提取步骤开始(而不只是荧光定量PCR过程)衡量了整个方法的可行性。行业内通用标准要求检测方法的回收率要达到50％以上，本发明实时荧光定量PCR方法回收率均达到了80％以上，是一种理想的可替代现有药典规定的检测方法。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR定量曲线；

图2为实时荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

以下所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。

下述实施例中所述试剂原料除特别注明来源外，均为市售的常见原料，试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆》第三版。

实施例1小鼠呼肠孤病毒III型专用引物和探针的设计

通过比对GenBank内Reo3M2和M3片段的序列，发现该病毒不同分离物间保守型非常高，达99.5％以上。确定保守的同源序列：即SEQ IDNO：4所示核苷酸序列。

针对找出的保守的同源序列区域设计实时荧光定量PCR检测专用引物和探针序列，扩增出的目的片段大小为100碱基。其中优选的引物、探针序列为：

上游引物QReo3-100bp-F：5’-CCGCTATAACGCCAACGAAT-3’，即SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

下游引物QReo3-100bp-R：5’-ACCGCACCCTTCACTGTCA-3’，即SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

所述探针QReo3-100bp-P：

5’-ATGCCTTGCTGACGATGTCCCCACTAT-3’，即SEQ ID NO：3所示核苷酸序列；

所述探针的5’端用荧光报告基团FAM标记，3’端用荧光淬灭基团TAMRA标记。

用设计的引物、探针进行同源性比对后发现其只对小鼠呼肠孤病毒III型具有高度保守型，与小鼠基因组/EST、及其他近缘病毒不同源，其特异性较高。

实施例2阳性RNA标准品的制备

首先制备含有同源序列SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的pMD18-T载体，以其为载体扩增得190bp的DNA片段，回收进行体外转录反应，反应结束后消化DNA模板并纯化RNA，定量后作为阳性RNA标准品。

1、体外转录模板的制备

合成SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，并将其插入pMD18-T载体中制备而成(由Invitrogen公司合成)，命名为pMD18T-Reo3。以pMD18T-Reo3为模板，用上游引物Reo3-190bp-F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTGGATCCCCGCTATA-3’和下游引物Reo3-190bp-R：5’-AAGCTTTCCTCCATCTG-3’进行扩增，扩增出190bp的DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收后，作为体外转录的模板。

2、体外转录制备大量RNA

在RNase free的EP管中配制反应体系，具体配制比例如下所示：

37℃反应4小时。

3、RNA标准品中DNA的去除

1)上述反应体系中加入10μl DNaseI，37℃继续反应30min；

2)加DEPC-H₂O 50μl/酚仿100μl，Vortex混匀，4℃离心，12000rpm，10min，转移上清，并重复该步骤一次；

3)加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，-20℃，30～60min；

4)4℃离心，12000rpm，10min，去上清。加1ml预冷的70％乙醇(RNase free)洗一次；

5)沉淀干燥后，溶于100μl RNase free的水；

6)以纯化后的RNA为模板，用引物Reo3-190bp-F、Reo3-190bp-R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，若无扩增条带则说明DNA消化完全，若有扩增条带则需从步骤1)开始重复。

4、RNA的定量分装

体外转录的Reo3RNA标准品全长190nt，分子量6.46×10⁴Da，即1μg纯化的RNA＝9.31×10¹³copies。紫外定量后，将Reo3RNA标准品用20ng/μl的酵母tRNA稀释至2×10⁷copies/μl，分装成30～40μl每管，-80℃冻存。

实施例3实时荧光定量PCR扩增方法的建立

1、实时荧光定量PCR模板制备——总RNA提取：

根据使用说明，分别用Trizol/Trizol LS试剂盒(Invitrogen公司提供)提取样品RNA，具体方法如下：

1)向样品(如为组织需研磨匀浆)中加入适量TRIzol//Trizol LS，混匀，室温静置5min；

2)加入氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液200μl，用vortex剧烈混匀10s，室温放置5min，4℃15000prm离心15min；

3)取上清，加等体积异丙醇沉淀，4℃15000prm离心15min；

4)去除上清，加入预冷的75％乙醇(体积比1∶1)洗RNA沉淀，4℃15000prm离心10min；

5)去除上清，真空干燥，用50μl RNase-free水溶解沉淀；

6)加DNase I消化液，37℃孵育30min；

7)加300μl RNase-free水，加苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液400μl，用vortex剧烈混匀30s，4℃15000prm离心4min；

8)取水相，加入氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液400μl，vortex剧烈混匀30s，4℃15000prm离心4min；

9)加入3M醋酸钠(pH5.2)20μl，vortex混匀。加入预冷的无水乙醇1000μl，vortex混匀10s，4℃15000prm离心15min；

10)去除上清，加入预冷的75％乙醇500μl，4℃15000prm离心10min；

11)真空干燥，加RNase-free水100μl溶解，-80℃备用。

2、实时荧光定量PCR反应体系

本发明人以Reo3RNA标准品为模板，对探针、引物的不同组合进行摸索，最终确定了探针和引物的最佳组合：20μl反应体系中10μM探针0.5μl、10μM实时荧光定量PCR上下游引物各0.5μl。

具体地，进行样品测定时，以总RNA为模板，进行实时荧光定量PCR，其中反应体系为：

反应体系(20μl)：

上述反应体系中所用试剂可购自AB公司，也可直接使用其试剂盒Taqman RNA to C_T 1-step kit(cat#4392938)。

3、实时荧光定量PCR反应条件

以上述反应体系进行实时荧光定量PCR，对反应程序中的退火温度进行摸索，确定最佳退火温度为60℃。

具体反应条件为：

48℃，15min；95℃，10min；95℃，15sec，60℃，40sec，共40个循环。每个循环结束后采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

实施例4方法学验证

1、标准曲线的建立及实时荧光定量PCR的灵敏度

将实施例2备用的Reo3RNA标准品稀释至10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷copies/μl为模板，按照实施例3中的反应体系和反应条件进行实时荧光定量PCR反应，随着PCR体系的每一个循环结束后测定吸光值，就得到了以循环数为横坐标，吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct为纵坐标的标准曲线。其中，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

本发明实时荧光定量PCR的检测低限：在40个循环内出现可信Ct值的稀释低限，当每差10倍模板量，Ct值相差3.3的Ct值被认为是可信的Ct值，由图1所示的定量曲线可得出，该实时荧光定量PCR的灵敏度可达到20copies/μl(100copies/reaction)。

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的阳性定量标准品作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

标准曲线如图2所示，标准曲线R²＝0.995，线性相关性良好。

2、实时荧光定量PCR的重复性、准确性和特异性

将Reo3RNA标准品分别稀释至浓度为10⁶、10⁴、10²copies/μl作为高、中、低值质控，以无病小鼠RNA为阴性对照即阴性质控品，以RNase-free H₂O为空白对照，进行实时荧光定量PCR，测量结果如下表1：

表1

由上述结果可知，

1)空白对照成立，实验结果有效；无病小鼠RNA检测结果为阴性；高中低值质控检测结果为阳性，故说明本检测方法具有很强的特异性；

2)3次实验标准偏差在15％以内，说明本发明重复性好，精密度符合要求；

3)准确度符合要求。

3、回收率实验

取4份小鼠肝脏组织(编号1～4)和4份市售苏肽生(编号4～8，溶解后的注射液)，将Reo3RNA标准品稀释至浓度10⁸、10⁶、10⁴copies/μl，按下表2配比配制供试样品(模拟阳性样品)。

表2供试样品配制

按实施例3中的提取方法提取RNA，作为PCR反应的模板，然后按实施例3的反应体系和条件进行实时荧光定量PCR反应，其中空白对照以RNase-free H₂O为模板，三次重复结果如表3所示，计算该方法的回收率。

表3

由上述结果可知，

空白对照成立，阴性对照无信号，阳性样品均为阳性，本实验成立，同时本检测方法回收率均在80％以上，比行业标准50％要高。

实施例5小鼠呼肠孤病毒III型的实时荧光检测试剂盒

将上述用于对小鼠呼肠孤病毒III型进行实时荧光定量PCR检测的上下游引物探针混合液500μl，2×Taqman RT-PCR Mix 10ml，40×Taqman RT-Enzyme MIX 0.5ml，阳性RNA标准品(1×10⁷copies/μl)50μl及酵母tRNA稀释液10ml，阴性对照品25μl，RNase-free H₂O10ml共同包装，得到小鼠呼肠孤病毒III型的实时荧光检测试剂盒。

该试剂盒使用方法：

以按实施例3-1中提取的样品总RNA作为模板，阳性RNA标准品1×10⁷copies/μl作为阳性对照模板，同时使用阴性对照、RNase-free H₂O空白对照，按照实施例3-2的反应体系和实施例3-3的反应条件进行实时荧光定量PCR，同时参照实施例4-1的方法将阳性RNA标准品稀释为不同浓度进行实时荧光定量PCR制作标准曲线。

结果分析，当阳性对照、阴性对照、空白对照都正常时，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的引物，其特征在于，所述引物是由具有序列表中的SEQ ID NO：1的上游引物与具有序列表中的SEQ IDNO：2的下游引物组成的一对寡核苷酸。

2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，所述探针具有序列表中的SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、HEX中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA或Eclipse。

5.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

6.一种用于检测小鼠呼肠孤病毒III型的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1中所述的引物及权利要求2～5任一所述的探针进行实时荧光定量PCR检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的退火温度为60℃。

9.根据权利要求6～8任一所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：48℃，15min；95℃，10min；95℃，15sec，60℃，40sec，共40个循环。

10.根据权利要求6～9任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括标准曲线的建立，方法为：扩增含序列表中SEQ ID NO：4所示的碱基同源序列的pMD18-T载体，得到190bp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA作为阳性RNA标准品，将其十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到检测小鼠呼肠孤病毒III型的标准曲线。

11.一种检测小鼠呼肠孤病毒III型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1中所述的引物及权利要求2～5任一所述的探针。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR扩增试剂为2×Taqman PCR Mix、40×Taqman RT-Enzyme MIX。

14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性RNA标准品通过下述方法获得：扩增含序列表中SEQ ID NO：4所示的碱基同源序列的pMD18-T载体，得到190bp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA即标准品。

15.权利要求1中所述的引物或权利要求2～5任一所述的探针在检测鼠源生物制品中呼肠孤病毒III型残留时的应用。

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