CN1661088A - 一种检测口蹄疫病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒利用荧光探针(TaqMan)和正义引物、反义引物并直接以体外转录RNA标准品作为逆转录和扩增的双重对照，使得定量结果更加准确、可靠。可高效方便地对病毒疫苗的效价进行定量检测和质量监控及对口蹄疫爆发疫情进行实时监控，同时可广泛用于动物产品的进出口及动物食品的安全检测，也可为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒，适用于对口蹄疫爆发疫情进行实时监控，可广泛用于动物产品的进出口及动物食品的安全检测和有效方便地对病毒疫苗的效价进行定量检测和质量监控及可为相关基础研究提供技术支持，还涉及在检测口蹄疫爆发疫情和病毒疫苗中的用途。
背景技术
口蹄疫病毒是一种小RNA病毒，主要引起偶蹄兽发生口蹄疫(FMD)。其发病特点是起病急、传播快、发病率高、病畜生产性能迅速下降等，给畜牧业及其国际贸易带来严重的经济损失。因此，该病历来都是国际社会最为关注的传染病之一。FMD十分顽固，一旦发生，就很难消灭，有的国家甚至在宣布消灭FMD后，仍会再度爆发该病。口蹄疫的快速检测是控制和消灭该病的前提，但口蹄疫的常规检测方法有一些不足之处，检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类：
1.血清学诊断技术包括补体结合实验、中和实验、凝集实验、免疫扩散、沉淀实验、免疫电泳技术、免疫荧光技术、放射免疫试验和免疫电镜技术等。在这些方法中得到普遍承认、采用并且广泛应用的有：补体结合实验、间接血凝试验、琼脂扩散实验、中和实验。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，反应时间长，材料多准备周期长，检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。
2.生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本高，周期长，浪费生物资源和人力物力。
3.分子生物学诊断技术包括核酸杂交、等电点聚焦电泳、寡核苷酸指纹图谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、单克隆抗体技术等。核酸杂交、寡核苷酸指纹图谱分析、等电点聚焦电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等检测方法更适合于对病毒特性进行更加深入的研究，由于整个系统操作复杂，过程繁多，成本高，不适宜同时进行大批量检测，因而受到很大限制。相比之下，普通RT-PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。样品可以是水泡皮，也可以直接用扁桃体、淋巴结、脊髓、肌肉和蹄冠、皮肤等组织，这是免疫学方法无法替代的。但这种传统的定量方法测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA or RNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA or RNA拷贝数。因此，如何快速、准确测定口蹄疫病毒是面临的主要难题之一。
近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determinedby LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，163：29-38)、病原体的定性(McGoldrick A，Lowings JP，Ibata G，et al.A Novel Approach to the Detection ofClassical Swine Fever Virus by RT-PCR with a Fluorogenic Probe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods，1998，72：125-135.；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCRassay(TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，83：1-10.)和定量检测(Kathy F.J.Tang，Jun Wang，DonaldV.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR witha TaqMan assay[J].J.Virol.Methods，115(2004)109-114.；Michaela Schwaiger，Pascal Cassinotti.Development of a quantitative real-time RT-PCR assay withinternal control for the laboratory detection of tick borne encephalitis virus(TBEV)RNA[J].J.Clin.Microbiol.，27(2003)136-145.；R.Frank Cooka，*，S.J.Cooka，et al，Development of a multiplex real-time reverse transcriptase-polymerase chain reactionfor equine infectious anemia virus(EIAN)[J].J.Virol.Methods，105(2002)171-179.；Birgit Liss*.Improved quantitative real-time RT-PCR for expression profiling ofindividual cells[J].Nucleic Acids Res.，2002，Vol.30 No.17 e89.；Franck Housseaua，1imberly R.Lindsey a，1，et al.Quantitative real-time RT-PCR as a method for monitoringT lymphocyte reactivity to full-length tyrosinase protein in vaccinated melanomapatients[J].J.Immunol.Methods 266(2002)87-103.；Desire N，Dehee A，Schneider V，et al.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load by aTaqMan Real-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，39：1303-1310.；MartellM，Gomez J，Esteban JI，et al.High-Throughput Real-Time ReverseTranscription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37：327-332.；Kearns AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detectionand Quantification of CMV DNA in Urine using Lightcycler-based Real-time PCR[J].J.Clin.Virol，2002，24：131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fiuorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95：111-119.)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量主要方法，国内目前也已有关于丙肝、乙肝、支原体、爱滋病、结核定量检测的试剂盒上市。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒适用于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高、定量快速准确、检测范围广，稳定性好。
本发明的另一个目的是在于提供一种荧光定量PCR试剂盒在对口蹄疫爆发疫情进行实时监控、病毒疫苗的效价进行定量和对动物产品的进出口及动物食品安全检测中的应用。
为了实现上述目的，本发明要用以下技术措施：a)RNA抽提液，b)逆转录酶和热启动Taq DNA聚合酶，c)RNA酶抑制剂，d)引物和荧光探针(TaqMan)，e)标准阳性RNA模板，f)一步法RT-PCR荧光定量反应液及其优化试剂牛血清白蛋白，其特征是：采用一步法扩增(One-Step RT-PCR)，即在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖一步完成，在处理大量样品省时且易于操作，有助于减少加样误差和交叉污染，另外用已知浓度的体外转录RNA作为标准品建立标准曲线，使定量结果更准确、直接，而用DNA为标准品时，则要考虑逆转录效率问题，而影响定量的准确性。RT-PCR反应液含有反转录和热启动Taq DNA聚合酶反应液，RNA酶抑制剂及牛血清白蛋白，荧光定量反应液含有引物和荧光探针，引物序列分别为正义引物：(FP)5’-GAACACATTCTTTACACCAGGAT-3’(SEQ ID NO：1)，反义引物(RT)：5’-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG-3’(SEQ ID NO：2)，扩增子大小为121bp。荧光探针序列为5′FAM-ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA-3′(SEQ ID NO：3)，探针的5’端标记荧光发射基团FAM(6-羧基荧光素)，靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA。标准阳性RNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(购自promega公司)载体体外转录制备，转录RNA于紫外分光光度计测A260定量并10倍梯度稀释。
在本发明的一个优选方案中，采用一步法扩增(One-Step RT-PCR)，即在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖反应一步完成，在处理大量样品省时且易于操作，有助于减少加样误差和交叉污染。在本发明的一个优选方案中，荧光定量反应液由正义引物(FP)，反义引物(RT)，荧光探针(TaqMan)，2×buffer溶液，反转录和热启动Taq DNA聚合酶，RNA酶抑制剂，牛血清白蛋白，无RNA酶的灭菌双蒸组成；在本发明的一个具体方案中，荧光定量反应液由2×buffer溶液25μl，25μmol/L正义(FP)、反义(RT)引物各2μl，25μmol/L荧光探针0.5μl，反转录和热启动Taq DNA聚合酶1μl，RNA酶抑制剂1μl，牛血清白蛋白(5mg/ml)1μl，无RNA酶的灭菌双蒸水7.5μl组成。其中荧光探针为(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标以荧光淬灭基团TAMRA。
在本发明的一个优选方案中，标准阳性RNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(购自promega公司)载体体外转录制备，转录RNA于紫外分光光度计测A260定量并10倍梯度稀释。实验所用的标准品制备过程为：PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用Omega公司的凝胶纯化试剂盒纯化，与pGEM-T载体(购自promega公司)4℃过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR鉴定阳性后送博亚生物工程有限公司测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆菌接种到含氨卞的LB培养基过夜培养，用SDS碱裂解法制备质粒DNA，经Omega公司的凝胶纯化试剂盒纯化后，Nco I酶切后，并利用SP6启动子(根据测序结果)体外转录制备RNA模板，乙醇沉淀纯化后于紫外分光光度计测A260定量，并稀释至梯度109-101拷贝/10μL，-70℃保存，转录所用一切物品均需无RNA酶处理。
在本发明提供检测口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒中，有一条一端标记有荧光报告基团另一端标记有荧光淬灭基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5’端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3’端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的FRET，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，所以荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对FMDV的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
在本发明提供检测口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒中，针对口蹄疫病毒的基因组的靶片段特殊性，将反应体系(引物和探针浓度、Mg2+浓度、扩增程序等)的优化，并将FQ-PCR技术和定量检测系统(包括LigthCycler系统，Roche；ABI Prism系统，PE Applied Bioasystems；)相结合，将其用于各种来源的口蹄疫病毒样品的定量检测。通过优化方案，反复实验，以及与传统检测方法进行比较，建立了定量检测FMDV的方法，并研制出口蹄疫病毒的定量检测试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10个以下的病毒基因拷贝数，检测范围可以达到九个数量级，是其它任何方法无法比拟的。
在本发明的另外一个方面，还提供了使用本发明的试剂盒对口蹄疫病毒进行检测的方法，该方法包括下列步骤：
A)用e)标准阳性RNA模板由插入目的片段的pGEM-T(购自promega公司)载体体外转录制备，并用紫外分光光度计定量；
B)用a)RNA抽提液从待测标本和阴阳性标准品中提取RNA，然后加C)
f)一步法RT-PCR荧光定量反应液及其优化试剂，c)RNA酶抑制剂和b)逆转录酶和热启动Taq DNA聚合酶，d)引物和TaqMan探针
D)将C)步中已加入了标准品及待测样品的荧光定量反应液PCR反应体系上机，用荧光定量检测仪进行PCR检测；
E)通过比较待测样品和标准品的循环域值根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。
在本发明中提供的检测口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒可对各种来源的口蹄疫病毒样品进行准确定量检测，从而可对口蹄疫爆发疫情进行实时监控，可广泛用于动物产品的进出口及动物食品的安全检测和有效方便地对病毒疫苗的效价进行定量检测和质量监控及可为相关基础研究提供技术支持。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1.与传统定量方法相比，此实时荧光定量PCR具有高灵敏性，高特异性和高准确性的特点，直接对PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始RNA拷贝数，做到了真正意义上RNA定量。
2.与两步法相比，本实验采用的一步法扩增(One-Step RT-PCR)在处理大量样品时易于操作，在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖，因而有助于减少交叉污染和加样误差，方便进行高通量的样品检测。
3.用已知浓度的RNA标准品可作为逆转录和扩增的双重对照，这样建立的标准曲线使定量结果更准确、直接，而用DNA为标准品时，则要考虑逆转录效率问题，而影响定量的准确性。
4.检测范围广，在109-101c/r浓度范围内有极好的线性关系(R＝0.9999)，检测范围可以达到九个数量级，已达到国际先进水平，其灵敏度可检测10copies以下，是其它任何方法无法比拟的。
5.适用于各种型号的荧光定量扩增仪，一次实验中三个重复样品相应的变异系数(CV)小于2％，说明其极高的重复性和稳定性。
6.适用于O、A、C、Asia-1型口蹄疫病毒的快速定量检测。
7.该实时荧光定量PCR利用外标准曲线，是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。
实施例1 口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒组成与配制及其反应条件：
A).试剂盒组成：
a)试剂盒组成如下：(10次反应)
RNA提取液A(4ml/管) RNA提取液B(800μl/管)
一步法扩增反应液(315μl/管) 反转录和热启动Taq DNA聚合酶(10μl/管)
强阳性标准品(100倍稀 PCR反应管(无菌、无RNA酶和DNA酶)
释定值准品20μl/管，共四管) DEPC H2O(2ml/管)
阴性标准品(50μl/管) 临界阳性标准品(50μl/管)
RNA酶抑制剂(400U/管)
RNA提取液A为Invitrogen公司产品，b)逆转录酶和热启动Taq DNA聚合酶(2U/μl)、c)一步法扩增(RT-PCR)反应液均购自Invitrogen公司，RNA酶抑制剂(40U/μl)购自Takara公司。
B).一步法荧光定量反应液(反应总体积是50μl)：2×buffer 25μl，正义引物FP(SEQ ID NO：1)和反义引物RT(SEQ ID NO：2)各2μl(25μmol/L)，荧光探针0.5μl(25μmol/L)，RNA酶抑制剂(40U/μl)，牛血清白蛋白(5mg/ml)1μl，反转录和热启动Taq DNA聚合酶1μl，抽提的标准品或待测样品均为10μl，无RNAse的灭菌双蒸水7.5μl组成。其中荧光探针为(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。
C).反应条件如下：(采用两步法)
cDNA synthesis： 50℃(水浴) 30min
PCR： 95℃ 5min
在每个循环的第二步结束时进行荧光检测。对FMDV的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。
D).荧光定量PCR试剂盒检测口蹄疫病毒的灵敏度、检测范围及稳定性的用途
取转录的标准品RNA109-101c/10μl浓度范围，每个浓度三个重复，加RNA裂解液400μl充分混匀，室温静置10分钟，加80μl氯仿，室温静置3分钟，于4℃12000g/min离心10分钟，上清液转移到另一个离心管，加200μl异丙醇，室温沉淀10分钟，4℃ 12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加1ml 75％乙醇充分吹散，于4℃ 7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然干燥，加无RNA酶水10μl 60℃ 10min溶解。
E).取D)步所提RNA 10μl，然后加一步法荧光定量反应液2×buffer 25μl，正义引物FP(SEQ ID NO：1)和反义引物RT(SEQ ID NO：2)各2μl(25μmol/L)，荧光探针0.5μl(25μmol/L)，RNA酶抑制剂(40U/μl)，牛血清白蛋白(5mg/ml)1μl，反转录和热启动Taq DNA聚合酶1μl。
分别加入对应编号的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变性5min；94℃30s，60℃90s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为518nm。
循环结束后，运用仪器自带分析软件，读取待检样品拷贝数。结果为：
| 序列号 | 名称 | 类型 | 阈 值(Ct) | 设定浓度 | 计算浓度 | 变异系数 |
| 1 | A1 | Standard | 5.71 | 1000000000 | 1000001200 | 0％ |
| 2 | A2 | Standard | 5.70 | 1000000000 | 1000070000 | 0％ |
| 3 | A3 | Standard | 5.72 | 1000000000 | 9999770000 | 0％ |
| 4 | B1 | Standard | 9.0 | 100000000 | 100000000 | 0％ |
| 5 | B2 | Standard | 9.02 | 100000000 | 999870000 | 0.013％ |
| 6 | B3 | Standard | 8.99 | 100000000 | 100006700 | 0.007％ |
| 7 | C1 | Standard | 12.29 | 10000000 | 10000020 | 0％ |
| 8 | C2 | Standard | 12.30 | 10000000 | 99993000 | 0.007％ |
| 9 | C3 | Standard | 12.31 | 10000000 | 99988000 | 0.012％ |
| 10 | D1 | Standard | 15.58 | 1000000 | 9999947 | 0％ |
| 11 | D2 | Standard | 15.57 | 1000000 | 1000121 | 0.01％ |
| 12 | D3 | Standard | 15.58 | 1000000 | 9999947 | 0％ |
| 13 | E1 | Standard | 18.86 | 100000 | 101300 | 1.3％ |
| 14 | E2 | Standard | 18.88 | 100000 | 99880 | 0.12％ |
| 15 | E3 | Standard | 18.94 | 100000 | 99566 | 0.43％ |
| 16 | F1 | Standard | 21.25 | 10000 | 9978 | 0.22％ |
| 17 | F2 | Standard | 21.22 | 10000 | 10003 | 0.03％ |
| 18 | F3 | Standard | 21.24 | 10000 | 9998 | 0.02％ |
| 19 | G1 | Standard | 24.55 | 1000 | 1000 | 0％ |
| 20 | G2 | Standard | 24.57 | 1000 | 999 | 0.1％ |
| 21 | G3 | Standard | 24.57 | 1000 | 999 | 0.1％ |
| 22 | H1 | Standard | 27.90 | 100 | 99 | 1％ |
| 23 | H2 | Standard | 27.88 | 100 | 99 | 1％ |
| 24 | H3 | Standard | 27.87 | 100 | 100 | 0％ |
| 25 | I1 | Standard | 31.17 | 10 | 10 | 0％ |
| 26 | I2 | Standard | 31.10 | 10 | 10 | 0％ |
| 27 | I3 | Standard | 31.21 | 10 | 10 | 0％ |
| 28 | CK- | NTC | 35.74 |
以上结果表明：该试剂盒检测范围广，在109-101c/r浓度范围内有极好的线性关系，相关系数R＝0.9999其检测范围可以达到九个数量级，其灵敏度可检测10copies以下，且稳定性好，一次实验中三个重复样品相应的变异系数(CV)小于2％，说明其极高的重复性，适用于各种型号的荧光定量扩增仪，是其它任何方法无法比拟的。
实施例2荧光定量PCR试剂盒检测对不同型口蹄疫病毒的检测及与传统的病毒滴度定量测定方法蚀斑滴定进行比较
A).试剂盒组成：
a)试剂盒组成如下：(10次反应)
RNA提取液A(4ml/管) RNA提取液B(800μl/管)
一步法扩增反应液(315μl/管) 反转录和热启动Taq DNA聚合酶(10μl/管)
强阳性标准品(100倍稀 PCR反应管(无菌、无RNA酶和DNA酶)
释定值准品20μl/管，共四管) DEPC H2O(2ml/管)
阴性标准品(50μl/管) 临界阳性标准品(50μl/管)
RNA酶抑制剂(400U/管)
RNA提取液A为Invitrogen公司产品，b)逆转录酶和热启动Taq DNA聚合酶(2U/μl)、c)一步法扩增(RT-PCR)反应液均购自Invitrogen公司，RNA酶抑制剂(40U/μl)购自Takara公司。
B).一步法荧光定量反应液(反应总体积是50μl)：2×buffer 25μl，正义引物FP(SEQ ID NO：1)和反义引物RT(SEQ ID NO：2)各2μl(25μmol/L)，荧光探针0.5μl(25μmol/L)，RNA酶抑制剂(40U/μl)，牛血清白蛋白(5mg/ml)1μl，反转录和热启动Taq DNA聚合酶1μl，抽提的标准品或待测样品均为10μl，无RNAse的灭菌双蒸水7.5μl组成。其中荧光探针为(SEQ ID NO：3)所示的核苷酸序列，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA。
C).反应条件如下：(采用两步法)
cDNA synthesis： 50℃(水浴) 30min
PCR： 95℃ 5min
在每个循环的第二步结束时进行荧光检测。对FMDV的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，Threshold Cycle)相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。
D.荧光定量PCR试剂盒检测对不同型口蹄疫病毒的检测及与传统的病毒滴度定量测定方法蚀斑滴定进行比较
分别取O、A、C、Asia-1型口蹄疫病毒感染的动物组织病料，剪碎研磨后取少量加RNA裂解液400μl充分混匀，室温静置10分钟，加80μl氯仿，室温静置3分钟，于4℃ 12000g/min离心10分钟，上清液转移到另一个离心管，加200μl异丙醇，室温沉淀10分钟，4℃ 12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加1ml 75％乙醇充分吹散，于4℃ 7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然干燥，加无RNA酶水10ul 60℃10min溶解。
E.取D步所提RNA 10μl，然后加一步法荧光定量反应液2×buffer 25μl，正义引物FP(SEQ ID NO：1)和反义引物RT(SEQ ID NO：2)各2μl(25μmol/L)，荧光探针0.5μl(25μmol/L)，RNA酶抑制剂(40U/μl)，牛血清白蛋白(5mg/ml)1μl，反转录和热启动Taq DNA聚合酶1μl。
分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变性5min；94℃30s，60℃90s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为518nm。
循环结束后，运用仪器自带分析软件，读取待检样品拷贝数。结果为：O、A、C、Asia-1型口蹄疫病毒在定量扩增仪上有明显的荧光信号增加，并具有完美的动力学曲线，所以该荧光定量RT-PCR系统可成功用于O、A、C、Asia-1型口蹄疫病毒的检测。
2.取O型口蹄疫病毒细胞毒原液100μl，10倍梯度稀释，先用荧光定量PCR检测试剂盒测定病毒粒子数，然后再用蚀斑滴定法检测。编号分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。每个样品三个重复，结果取其平均值如下表：
| 病毒样品 | 蚀斑滴定法 | 荧光定量PCRFQ-PCR病毒量(copies/ml) |
| 12345678910 | UDUDUDUDUD65068700 | 5.17×1095.16×1085.16×1075.17×1065.17×1055.15×1045.16×1035.18×1025.20×1015.0×100 |
UD：病毒浓度太大无法测定
病毒蚀斑滴定法：
铺满单层BHK-21消化，调整细胞浓度为1×105/ml，加入12孔板1ml/孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞形成90％单层，吸弃细胞上清，用1％双抗、2％FBS的MEM洗一次，加入0.1ml病毒悬液，每个浓度3个重复，37℃温育90min，每隔15min轻轻晃动一次以确保病毒均匀吸附，吸弃病毒悬液，用1％双抗、2％FBS的MEM洗两次，加入0.6-0.8ml/孔终浓度为0.4％温度43-45℃的营养琼脂糖(营养琼脂糖配方：2×MEM与去离子水配制并灭菌的PH7.2-7.4的0.8％琼脂糖以等体积混合，于43-45℃水浴中保温)，于超净台上20min冷却凝固后，移入CO2培养箱，72hour后，加入含2％结晶紫的10％的甲醛溶液200μl，于通风橱中染色2hour，吸弃结晶紫，用自来水冲掉琼脂糖，观察蚀斑并计数。
从上述实验对比可以说明，荧光定量PCR方法定量重复性好，定量准确，在检测范围内有极高的线性相关性，(R＝0.9999)而蚀斑滴定法由于方法本身的限制，检测范围很窄，检测灵敏度比荧光定量低两个数量级，其结果受细胞状态影响会导致测毒不准。而且，荧光定量PCR检测试剂盒对病毒的检测定量仅需4个小时就能完成，而传统的蚀斑滴定法约需1周左右才能完成，因此，使用该试剂盒可以大大缩短检测时间。
该试剂盒的操作只需1人即可完成整个定量操作过程，一次可检测32-384个(由定量检测仪的型号决定)样品，这样极大地提高了效率也减少了人力资源的浪费。
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<110>武汉大学
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<130>一种检测口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用
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<213>人工合成
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gaacacattc tttacaccag gat 23
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<212>DNA
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catatctttg ccaatcaaca tcag 24
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acaacctacc gccgagccaa ttc 23
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gaacacauuc uuuacaccag gaugaugauu ggcagauuuu gugcucaaau gcacucaaac 60
aacggaccgc gaauuggcuc ggcgguaggu uguaacccug auguugauug gcaaagauau 120
g 121
Claims (5)
1.一种检测口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有：a)RNA抽提液，b)逆转录酶和热启动Taq DNA聚合酶，c)RNA酶抑制剂，d)引物和TaqMan探针，e)标准阳性RNA模板，f)RT-PCR荧光定量反应液，其特征是：引物序列分别为正义引物：5’-GAACACATTCTTTACACCAGGAT-3’，反义引物：5’-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG-3’，扩增子大小为121bp，荧光探针序列为：5′FAM-ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA-3′，探针的5′端标记荧光发射基团FAM，靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA，标准阳性RNA模板由已插入口蹄疫病毒3D区121bp片段的pGEM-T载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒进行体外转录制备RNA，并于紫外分光光度计测A260定量并10倍梯度稀释。
2.根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征是：一步法逆转录和扩增荧光定量反应液是由2×buffer，25μmol/L的正义引物和反向义引物，25μmol/L荧光探针，逆转录酶和热启动Taq DNA聚合酶，RNA酶抑制剂，无RNA酶的灭菌双蒸水及牛血清白蛋白组成。
3.根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征是：标准阳性模板RNA核苷酸序列为：
gaacacauuc uuuacaccag gaugaugauu ggcagauuuu gugcucaaau gcacucaaac aacggaccgc
gaauuggcuc ggcgguaggu uguaacccug auguugauug gcaaagauau g
4.一种用于实现权利要求1所述的检测口蹄疫病毒的荧光定量PCR试剂盒制备方法，它包括下列步骤：
A.标本及标准品处理：向一高压灭菌且无RNase处理的1.5ml Ep中加入400μLRNA提取液a 4℃保存，再加入40μL液体或20-40mg固体及阳性标准品吹打混匀，再加入RNA提取液b 80μL混匀，室温静置10min，4℃12000g离心10min，小心吸取上清转移到另一管中，加入400μL异丙醇，室温静置5min，4℃12000g离心10min，沉淀加入500μL 75％的乙醇，震荡混匀，4℃7500g离心5min，沉淀干燥5-10min后用DEPC水溶解，使用或-70℃保存；
B.一步法RT-PCR扩增及实时荧光检测：向PCR反应管中依次加入一步法荧光定量反应液31.5μl，牛血清白蛋白1μl，浓度为5mg/ml，反转录和热启动TaqDNA聚合酶1μl，抽提标准品或待测样品和无RNA酶的灭菌双蒸水共17.5μl，混匀瞬时离心后放入荧光定量扩增仪上运行：程序为50℃30min，95℃5min，94℃30s，60℃90s，共40个循环，在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，反应结束后根据标准曲线计算出待测样品的基因拷贝数。
5.权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒在定量检测口蹄疫病毒中的应用。
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Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1877331B (zh) * | 2006-07-07 | 2010-07-28 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 口蹄疫病毒定型试纸条及其制备方法 |
| CN101565759B (zh) * | 2009-06-02 | 2011-08-17 | 武汉三利生物技术有限公司 | 一种检测牛细小病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 |
| CN101565757B (zh) * | 2009-06-02 | 2011-08-17 | 武汉三利生物技术有限公司 | 一种检测呼肠孤病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 |
| CN101423874B (zh) * | 2007-10-31 | 2011-08-31 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 口蹄疫病毒多重rt-pcr检测试剂盒、其制备方法及应用 |
| CN101724711B (zh) * | 2008-10-30 | 2011-12-07 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光pcr引物和探针 |
| CN102337357A (zh) * | 2011-11-02 | 2012-02-01 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 用于检测小鼠呼肠孤病毒ⅲ型的引物、探针及其方法 |
| CN103215248A (zh) * | 2005-10-03 | 2013-07-24 | 应用生物系统有限责任公司 | 用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒 |
| CN103468828A (zh) * | 2013-09-16 | 2013-12-25 | 上海卓润生物科技有限公司 | 单管同时检测四种牛传染病rna病毒的pcr方法 |
| CN105349704A (zh) * | 2015-12-10 | 2016-02-24 | 北京佰鸥创投生物科技有限公司 | 一种口蹄疫病毒微滴数字pcr绝对定量检测试剂盒 |
| CN108611440A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-10-02 | 上海申亚动物保健品阜阳有限公司 | 一种检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其检测方法 |
| CN108841999A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-20 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种检测口蹄疫o、a型的巣式pcr引物对及其方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002095074A1 (en) * | 2001-05-18 | 2002-11-28 | Tetracore, Inc. | Foot and mouth disease virus diagnostic and methods |
| DE60323153D1 (de) * | 2002-12-20 | 2008-10-02 | Du Pont | Diagnosesequenzen für maul- und klauenseuche |
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- 2004-12-24 CN CNB2004100614226A patent/CN1308461C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103215248B (zh) * | 2005-10-03 | 2016-05-18 | 应用生物系统有限责任公司 | 用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒 |
| CN103215248A (zh) * | 2005-10-03 | 2013-07-24 | 应用生物系统有限责任公司 | 用于扩增核酸的组合物、方法和试剂盒 |
| CN1877331B (zh) * | 2006-07-07 | 2010-07-28 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 口蹄疫病毒定型试纸条及其制备方法 |
| CN101423874B (zh) * | 2007-10-31 | 2011-08-31 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 口蹄疫病毒多重rt-pcr检测试剂盒、其制备方法及应用 |
| CN101724711B (zh) * | 2008-10-30 | 2011-12-07 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光pcr引物和探针 |
| CN101565757B (zh) * | 2009-06-02 | 2011-08-17 | 武汉三利生物技术有限公司 | 一种检测呼肠孤病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 |
| CN101565759B (zh) * | 2009-06-02 | 2011-08-17 | 武汉三利生物技术有限公司 | 一种检测牛细小病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 |
| CN102337357A (zh) * | 2011-11-02 | 2012-02-01 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 用于检测小鼠呼肠孤病毒ⅲ型的引物、探针及其方法 |
| CN102337357B (zh) * | 2011-11-02 | 2014-02-19 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 用于检测小鼠呼肠孤病毒ⅲ型的引物、探针及其方法 |
| CN103468828A (zh) * | 2013-09-16 | 2013-12-25 | 上海卓润生物科技有限公司 | 单管同时检测四种牛传染病rna病毒的pcr方法 |
| CN105349704A (zh) * | 2015-12-10 | 2016-02-24 | 北京佰鸥创投生物科技有限公司 | 一种口蹄疫病毒微滴数字pcr绝对定量检测试剂盒 |
| CN108611440A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-10-02 | 上海申亚动物保健品阜阳有限公司 | 一种检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其检测方法 |
| CN108841999A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-20 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种检测口蹄疫o、a型的巣式pcr引物对及其方法 |
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