CN103215381B - 一种检测仙台病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒含有：a)RNA提取液、b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d)RNA酶抑制剂、e)引物、f)标准阳性DNA模板、g)SYBRGreenI实时荧光定量PCR反应液，其特征在于：引物序列分别为正义引物：5’-ACCTATGGTCAACAAGAGTCCGCT-3’，反义引物：5’-CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3’，扩增子大小为142bp，标准阳性DNA模板由已插入仙台病毒保守的NP蛋白编码区142bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好，灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。也可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

Description

一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种检测仙台病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒的应用，该SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒可高效方便的对小鼠细胞制品进行定量检测和质量监控，也可以进行仙台病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

背景技术

仙台病毒(Sendai virus，SeV)属副粘病毒科副粘病毒亚科、呼吸道病毒属病毒，呈多形性，主要为球形，直径约200μm。SeV是一种单股负链RNA病毒，基因组大小为15kb。SeV是引起啮齿类动物呼吸系统疾病的主要病原，可影响幼鼠发育成长和降低成年鼠的繁殖率，且很难从鼠群中清除。SeV甚至可感染灵长类动物及人类，它主要引起婴幼儿下呼吸道严重疾病及较大儿童的上呼吸道感染，以发热、咳嗽、气喘或胸闷胸痛为主，甚至造成致死性感染。但对较大儿童和成人一般只引起普通感冒症状的上呼吸道感染，很少导致感染死亡。SeV广泛分布于世界各地，其流行或散发常与流感病毒伴发流行。因此《中华人民共和国药典》规定对鼠源性生物制品必须检测仙台病毒。诊断实验小鼠的仙台病毒感染和控制其蔓延都具有积极意义。目前的检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类：

1、血清学诊断技术包括免疫荧光技术（IFA）、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。

2、生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力。

3、分子生物学诊断技术，即应用普通RT-PCR技术检测仙台病毒(Yukiharu H,Kiyokake T,Michisato K,et al.Detection of nucleoprotein gene of Sendai virus in the lungs ofrats by touchdown nested reverse transcription polymerase chain reaction[J].ExperimentalAnimals,1997,46(4),307-310)。普通RT-PCR方法特异性好，检测灵敏度较高，解决了血清学方法无法对无血清生物制品和免疫缺陷小鼠进行检测的缺点。但是由于普通RT-PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以该方法无法定量起始的DNA或RNA拷贝数。近年发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR,FQ-PCR)技术具有灵敏度高、速度快、特异性好等优点。在基因表达水平分析(Nellemann C,Vinggaard AM,Dalagaard M,et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determined by Light Cycler Technology[J].Toxicology,2001,163:29-38)、病原体的定性(Bhudevi B,Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.,2001,83:1-10.)和定量检测(Kathy F.J.Tang,Jun Wang,Donald V.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR with a TaqMan assay[J].J.Virol.Methods,115(2004)109-114.;Birgit Liss.Improved quantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucleic Acids Res.,2002,Vol.30No.17e89.Florence KP,Glaucia PB,Mireille S,et al.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001,95:111-119.)等方面得到广泛应用，并且已成为当前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比较多的荧光定量PCR方法有SYBRGreen I荧光染料法和TaqMan法，这两种方法都具有灵敏度高、检测速度快、特异性好的优点。本发明所采用的基于SYBR Green I荧光染料技术的荧光定量PCR检测方法其引物设计、合成更加简便，且具有良好的重复性和灵敏度。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好，灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。

本发明的另一个目的是在于提供了一种仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒在检测（抗）仙台病毒药物研究中的应用，可对小鼠、大鼠细胞制品进行定量检测和质量监控，也可以进行仙台病毒引起的婴幼儿下呼吸道严重疾病及较大儿童的上呼吸道感染的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种检测仙台病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有：a)RNA提取液、b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d)RNA酶抑制剂、e)引物、f)标准阳性DNA模板、g)SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于：引物序列分别为正义引物：5’-ACCTATGGTCAACAAGAGTCCGCT-3’，反义引物：5’-CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3’，扩增子大小为142bp，标准阳性DNA模板由已插入仙台病毒保守的NP蛋白编码区142bp的pTA2载体（购自TOYOBO）转化大肠杆菌DH5α（本实验室保存，大肠杆菌DH5α为最常用于常规克隆应用的大肠杆菌菌株。除支持蓝/白筛选外，DH5α的recA1和endA1突变可增强嵌入稳定性并提高自minipreps制备的质粒DNA质量），增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。

所述的RNA提取液是由细胞裂解液（Trizol，购自Invitrogen）、氯仿、异丙醇、75%（质量体积比，下同）乙醇、灭菌的双蒸水组成。

所述的SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液是由2×iTaq SYBR Green Supermix(with ROX)、10μM的正义引物和反义引物和灭菌的双蒸水组成。

所述的标准阳性DNA模板核苷酸序列为：

Acctatggtcaacaagagtccgcttttccaggggcaacgagatgctgcagaccctgatacgctccttcaaatctatgggtatccggcatgcctaggggcaattattgtccaggtctggattgtgctggtgaaggcaatcacg。

在本发明的一个优选方案中，采用传统的两步法扩增（Two-Step RT-PCR），即第一步进行逆转录反应，将RNA样品逆转录成cDNA，第二步进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性DNA样品定量检测未知样品。用DNA作为标准品，使得定量反应结果更加稳定可靠，并大大增加了实验的重复性，减少误差。在本发明的一个具体方案中，逆转录反应液由反义引物(RT)、逆转录酶、RNA酶抑制剂、5×buffer溶液、10mM dNTPs和无核酸酶的灭菌双蒸水组成；荧光定量PCR反应液由2×iTaq SYBR Green Supermix(with ROX)、10μM的正义引物和反义引物，以及灭菌的双蒸水组成；在本发明的一个具体方案中，逆转录反应液由5×buffer溶液5μL、10μmol/L的反义引物(RT)2.5μL、10mM dNTPs1.5μL、逆转录酶和RNA酶抑制剂各1μL、无核酸酶的灭菌双蒸水9μL组成；荧光定量PCR反应液由2×iTaq SYBR Green Supermix(with ROX)10μL、10μM的正义引物和反义引物各1μL、灭菌的双蒸水7μL组成。

在本发明的一个优选方案中，标准阳性DNA模板由含有插入目的片段的pTA2（购自TOYOBO公司）载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。实验所用的标准品制备过程为：普通RT-PCR反应后，取适量产物凝胶电泳检测，若扩增条带单一，即可与10×A-attachment Mix混合，于60℃反应30min；再与pTA2载体连接。转化感受态细胞，并将转化产物涂X-gal平板过夜培养，次日挑取白斑菌落。菌落PCR鉴定为阳性后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。根据测序结果将筛选的阳性克隆菌接种到含氨苄抗性的LB培养基过夜培养。次日提取质粒，于紫外分光光度计测A₂₆₀定量，并稀释至梯度10⁸-10²拷贝/μL，-80℃保存。

一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒中，有非特异性荧光染料SYBR Green I。SYBR Green I是一种能够与双链DNA小沟结合的染料。没有与双链DNA结合时，其荧光信号很弱，当其与双链DNA结合后荧光信号大大增强并能够被仪器检测。利用SYBR Green I这种特点可以检测PCR扩增产物。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点。它能够与体系中所有的双链DNA相结合，因此无需为不同的模板特殊定制。此外，由于一个PCR产物可以与多个SYBR Green I染料相结合，因此灵敏度很高。对仙台病毒的定量检测可通过与标准品的循环阈值（Ct，Threshold Cycle）相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数，Ct值与起始模板数的常用对数呈线性关系（log(起始模板数)=Ct值/斜率+X轴截距），Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒中，针对仙台病毒的基因组的靶片段碱基排列的特殊性，优化反应体系（引物浓度、扩增程序等），并将FQ-PCR技术和定量检测系统相结合，将其用于各种来源的仙台病毒样品的定量检测。通过优化方案，建立了定量检测仙台病毒的方法，并研制出仙台病毒定量检测试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出100copies以下的病毒基因拷贝数，检测范围可以达到七个数量级。

所述的仙台病毒:亦称HVJ（Hemagglutinating virus of Jap－an的缩写），乙型副流感病毒。属副粘病毒属。仙台病毒是此属中最早分离到的（M．Kuroya），（1953）。质粒为多形态，直径150—600毫微。具包膜，其中含有分子量为6—7×10^6的RNA，但不是蛋白质合成的模板。不耐热，几乎可凝集所有种类的红血球，而且有溶血性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖。被感染的细胞株很易引起继发感染。因为具有融合各种细胞的能力，所以被广泛地用来进行细胞的异核体形成和培育杂种细胞。与新城疫病毒一起也多用于干扰素的诱导。此病毒常存在于小鼠和猪中，另外也从人体中分离到与仙台病毒具有交换抗原的病毒（HA2等）。

在本发明的另外一个方面，本发明还提供了一种荧光定量PCR试剂盒在检测（抗）仙台病毒药物研究中的应用，其应用过程包括下列步骤：

A.f)标准阳性DNA模板由插入目的片段的pTA2（购自TOYOBO公司）载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并用紫外分光光度计定量；

B.用a)RNA提取液从待测标本中提取RNA，然后加b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d)RNA酶抑制剂、e)反义引物；

C.荧光定量PCR由e)引物、f)标准阳性DNA模板或逆转录反应产物、g)SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液或所提取的标本DNA组成，已加入了标准品及待测品的荧光定量反应液PCR反应体系上机，用荧光定量检测仪进行FQ-PCR检测；

D.通过比较待测样品和标准品的循环阈值，根据拟合所得的标准曲线计算待测样品的起始拷贝数，并以此判断待测样品中是否含有鼠腺病毒。

在本发明中提供的检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒可对各种来源的仙台病毒样品进行准确定量检测，并可对小鼠制品和小鼠细胞进行定量检测和质量监控，也可以进行仙台病毒引起的婴幼儿下呼吸道严重疾病及较大儿童的上呼吸道感染的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1.与传统定量方法相比，此实时荧光定量PCR具有高灵敏性、高特异性和高准确性的特点，直接对PCR每循环一次就收集一个数据，建立实施扩增曲线，准确的确定Ct值，从而根据Ct值确定起始RNA拷贝数，做到了真正意义上的核酸定量。

2.本实验采用SYBR Green I染料。该染料与双链DNA非特异性结合，所以检测灵敏度更高。通过融解曲线的分析可以区分单一引物、引物二聚体、非特异性扩增等影响因素，使结果更加可靠。使用SYBR Green I染料也降低了引物合成的成本。

3.检测范围广，在10⁸-10²copies/reaction浓度范围内有良好的线性关系（R=0.999），检测范围可以达到七个数量级，其灵敏度可达100copies以下。

4.该实时荧光定量PCR利用外标准曲线，是迄今为止定量最准确、重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南（第三版）；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；F.M.奥斯伯等主编，科学出版社，2005，精编分子生物学实验指南；或按照制造厂商建议的条件。

实施例1：

一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒组成及其反应条件是：

A）试剂盒组成如下：（10次反应，检测10份待测样品）

RNA提取液A（4mL/管）          RNA提取液B（800μL/管）

逆转录反应液（90μL/管）      逆转录酶（10μL/管）

RNA酶抑制剂（400U/管）

强阳性标准品（50μL/管）

PCR反应管（无菌、无核酸酶）   DEPC水（2mL/管）

阴性标准品（50μL/管）

临界阳性标准品（50μL/管）

强阳性标准品，即拷贝数为10⁸c/r的标准阳性DNA模板；

阴性标准品，即未感染鼠腺病毒的L929细胞(鼠腺病毒的宿主细胞)DNA；

临界阳性标准品，即拷贝数为10²c/r的标准阳性DNA模板。

SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液（110μL/管）（g)SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，购自Bio-rad公司）

B)SeV病毒RNA提取：

取病毒样品加RNA裂解液400μL充分混匀，室温（20-25℃，以下相同）静置10min，加入80μL氯仿，室温静置5min，于4℃、12000rpm离心10min，上清液转移到另一支离心管中，加入200μL异丙醇，室温沉淀10min，再4℃、12000rpm离心10min，缓慢倒出上清，RNA沉淀在室温下自然干燥，最后加入无RNA酶水30μL于60℃、10min溶解。

C)取B)步所提取的RNA 5μL，加入逆转录反应液（反应总体积为25μL）：5×buffer溶液5μL、10μmol/L的反义引物(RT)2.5μL、10mM dNTPs 1.5μL、逆转录酶和RNA酶抑制剂各1μL、无核酸酶的灭菌双蒸水9μL。反应条件如下：

cDNA合成：65℃，5min

          0℃，2min

          37℃，50min

          70℃，10min

D)取逆转录反应产物5μL进行凝胶电泳检测，扩增条带单一，与10×A-attachmentMix混合，于60℃反应30min；再与pTA2载体连接。转化感受态细胞，并将转化产物涂平板过夜培养。挑取白斑菌落PCR鉴定阳性后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。根据测序结果将筛选的阳性克隆菌接种到含氨苄抗性的LB培养基过夜培养。次日提取质粒，于紫外分光光度计测A₂₆₀定量，并稀释至梯度10⁸-10²拷贝/μL，-80℃保存。

E)荧光定量PCR试剂盒检测仙台病毒的灵敏度、检测范围及稳定性

取c)标准阳性模板稀释至10⁸-10²c/r，8个浓度梯度，每个浓度三个重复，加SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液2×iTaq SYBR Green Supermix with ROX10μL，正义引物FP和反义引物RT各1μL，标准品质粒模板1μL，灭菌双蒸水7μL。分别加入对应编号的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做FQ-PCR检测。反应条件如下：

FQ-PCR：95℃，3min

        95℃，15s

        60℃，45s

        40cycles

在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，检测波长为518nm。对仙台病毒的定量可通过与标准品的循环阈值（Ct，Threshold Cycle）相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。结果为：

序列号	名称	类型	阈值（Ct）	设定浓度	变异系数%
						1	A1	Standard	11.92	100000000	1.71%
2	A2	Standard	11.82	100000000	0.86%
						3	A3	Standard	11.42	100000000	2.60%
4	B1	Standard	14.67	10000000	0.46%
						5	B2	Standard	14.68	10000000	0.54%
6	B3	Standard	14.47	10000000	0.90%
						7	C1	Standard	18.81	1000000	0.34%
8	C2	Standard	18.87	1000000	0.65%
						9	C3	Standard	18.57	1000000	0.98%
10	D1	Standard	22.59	100000	0.27%
						11	D2	Standard	22.62	100000	0.41%
12	D3	Standard	22.39	100000	0.63%
						13	E1	Standard	26.25	10000	0.71%
14	E2	Standard	26.01	10000	0.25%
						15	E3	Standard	25.95	10000	0.48%
16	F1	Standard	29.66	1000	1.17%
						17	F2	Standard	29.68	1000	1.23%

18	F3	Standard	28.62	1000	2.39%
						19	G1	Standard	33.50	100	0.50%
20	G2	Standard	34.79	100	3.32%
						21	G3	Standard	32.72	100	2.81%

以上结果表明：该试剂盒检测范围广，在10⁸-10²copies/reaction浓度范围内有非常良好的线性关系（R=0.999），检测范围可以达到七个数量级，其灵敏度可检测至100copies以下，且稳定性好，一次实验中三个重复样品相应的变异系数（CV）均小于5%，说明其具有较高的重复性。

实施例2：

一种荧光定量PCR试剂盒在检测Hela细胞感染仙台病毒药物中的应用，其应用过程是：

试剂盒组成如下：（10次反应）

RNA提取液A（4mL/管）        RNA提取液B（800μL/管）

逆转录反应液（90μL/管）      逆转录酶（10μL/管）

RNA酶抑制剂（400U/管）

强阳性标准品（50μL/管）

PCR反应管（无菌、无核酸酶）   DEPC水（2mL/管）

阴性标准品（50μL/管）

临界阳性标准品（50μL/管）

SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液（110μL/管）（g)SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液购自Bio-rad公司）

A)SeV病毒RNA提取：

取感染SeV病毒的细胞样品和未感染SeV病毒的阴性对照细胞样品，分别加RNA裂解液400μL充分混匀，室温（20-25℃，以下相同）静置10min，加入80μL氯仿，室温静置5min，于4℃、12000rpm离心10min，上清液转移到另一支离心管中，加入200μL异丙醇，室温沉淀10min，再4℃、12000rpm离心10min，缓慢倒出上清，RNA沉淀在室温下自然干燥，最后加入无RNA酶水30μL于60℃、10min溶解。

B)取B)步所提RNA5μL，加入逆转录反应液（反应总体积为25μL）：5×buffer溶液5μL、10μmol/L的反义引物(RT)2.5μL、10mM dNTPs 1.5μL、逆转录酶和RNA酶抑制剂各1μL、无核酸酶的灭菌双蒸水9μL，反应条件如下：

cDNA合成：65℃，5min

          0℃，2min

          37℃，50min

          70℃，10min

C)荧光定量PCR试剂盒检测仙台病毒的灵敏度、检测范围及稳定性

取阴性对照和待测样品的逆转录产物，每个样品三个重复，加SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液2×iTaq SYBR Green Supermix with ROX10μL，正义引物FP和反义引物RT各1μL，待测样品DNA或标准品1μL，灭菌双蒸水7μL。分别加入对应编号的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。反应条件如下：

FQ-PCR：95℃，3min

        95℃，15s

        60℃，45s

        40cycles

在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，检测波长为518nm。对仙台病毒的定量可通过与标准品的循环阈值（Ct，Threshold Cycle）相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。结果为：

样品编号	Ct值	仙台病毒-copise/ml	变异系数%
				1	19.68	5.46×105	0.4
2	19.87	4.85×105	0.5
				3	19.75	5.22×105	0.1
4	-	-
				5	-	-
6	-	-

以上结果表明，编号为1、2、3的样品中含有仙台病毒，证实了仙台病毒荧光定量PCR试剂盒能成功应用于仙台病毒感染的细胞监测，且重复性良好，变异系数小于1%。

Claims (5)

1.一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有：a)RNA提取液、b)逆转录酶反应液、c)逆转录酶、d)RNA酶抑制剂、e)引物、f)标准阳性DNA模板、g)SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于：引物序列分别为正义引物：5’-ACCTATGGTCAACAAGAGTCCGCT-3’，反义引物：5’-CGTGATTGCCTTCACCAGCACAAT-3’，扩增子大小为142bp，标准阳性DNA模板由已插入仙台病毒保守的NP蛋白编码区142bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。

2.根据权利要求1所述的一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的RNA提取液是由细胞裂解液、氯仿、异丙醇、75％质量体积比乙醇、灭菌的双蒸水组成。

3.根据权利要求1所述的一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液是由2×iTaq SYBR Green Supermix和灭菌的双蒸水组成。

4.根据权利要求1所述的一种检测仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的标准阳性DNA模板核苷酸序列为：

Acctatggtcaacaagagtccgcttttccaggggcaacgagatgctgcagaccctgatacgctccttcaaatctatgggtatccggcatgcctaggggcaattattgtccaggtctggattgtgctggtgaaggcaatcacg。

5.权利要求1所述的一种仙台病毒的荧光定量PCR试剂盒在制备检测仙台病毒药物中的应用。