CN103215382A

CN103215382A - 一种检测小鼠痘病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用

Info

Publication number: CN103215382A
Application number: CN2013101316172A
Authority: CN
Inventors: 肖庚富; 张哲�; 郑从义
Original assignee: WUHAN CANVEST BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN CANVEST BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-04-16
Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2013-07-24

Abstract

本发明公开了一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒含有：a)DNA提取液、b)引物、c)标准阳性模板、d)SYBRGreenI实时荧光定量PCR反应液，从细胞样品中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，引物序列分别为正义引物：5’-GCCGTCATTCCTAAAAAAAGTGGT-3’，反义引物：5’-ATCAAAGCCTTGTTGTCTCCGA-3’，扩增子大小为176bp，标准阳性DNA模板由已插入小鼠痘病毒保守的病毒核心DNA连接蛋白编码区176bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。结果更加准确、可靠，重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广、稳定性好。也可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

Description

一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种检测小鼠痘病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒的应用，该SYBRGreen I实时荧光定量PCR试剂盒可高效方便的对小鼠细胞制品进行定量检测和质量监控，也可以进行小鼠痘病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

背景技术

小鼠痘病毒(Ectromelia virus，ECTV)属痘病毒科(Poxviridae)脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)正痘病毒属(Orthpoxvirus)，是一种单一分子双链DNA病毒，病毒粒子为砖形，大小为200nm×200nm×250nm，对乙醚抗性。其基因组序列与天花病毒有很大的相似性，因此《中华人民共和国药典》规定对鼠源性生物制品必须检测小鼠痘病毒。小鼠痘病毒感染有急性和慢性两种形式，常见实验室烈性传染性脱脚病就是由小鼠痘病毒急性感染引起，临床表现为四肢、尾和头部肿胀、溃烂、坏死甚至脚趾脱落为特征。慢性感染中主要为持续性感染，小鼠痘病毒慢性持续性感染小鼠没有明显临床症状，是诱发脱脚病或产生病毒传染的主要因素。因此，对实验小鼠慢性持续性小鼠痘病毒感染诊断，对控制小鼠痘病毒蔓延、防止脱脚病发生具有积极意义。目前检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类：

1、血清学诊断技术包括免疫荧光技术（IFA）、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。

2、生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力。

3、分子生物学诊断技术，即应用PCR技术检测小鼠痘病毒持续感染。PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。在上世纪90年代，国内就有报道使用PCR技术建立检测小鼠痘病毒的方法，最低检出小鼠痘病毒DNA量为0.1pg。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以该方法无法定量起始的DNA或RNA拷贝数。近年发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic QuantitativePCR,FQ-PCR)技术有灵敏度高、速度快、特异性好等优点。在基因表达水平分析(Nellemann C,Vinggaard AM,Dalagaard M,et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determined by Light Cycler Technology[J].Toxicology,2001,163:29-38)、病原体的定性(BhudeviB,Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay(TaqMan)for Detection and Classification ofBovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.,2001,83:1-10.)和定量检测(Kathy F.J.Tang,Jun Wang,Donald V.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR with a TaqMan assay[J].J.Virol.Methods,115(2004)109-114.;Birgit Liss.Improved quantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucleic Acids Res.,2002,Vol.30No.17e89.Florence KP,Glaucia PB,Mireille S,et al.Quantitationof HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001,95:111-119.)等方面得到广泛应用，并且已成为当前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比较多的荧光定量PCR方法有SYBR Green I荧光染料法和TaqMan法，这两种方法都具有灵敏度高、检测速度快、特异性好的优点。M.SofiIbrahim等(2003)使用基于TaqMan探针的real-timePCR法检测天花病毒，最低检测浓度能达到1fg/μL(25copies)，比普通PCR方法灵敏100倍。Luo A-dong等(2008)使用SYBR Green I荧光染料建立山羊痘病毒荧光定量PCR检测方法，最低能检测700copies DNA样品。SYBR Green I荧光染料法和TaqMan探针法在灵敏度上相差不大。目前，国内已有基于TaqMan探针技术的real-time PCR检测小鼠痘病毒的专利方法，“用于检测小鼠脱脚病病毒的引物、探针及其方法（申请公布号CN102329889A）”。本发明所采用的基于SYBR Green I荧光染料技术的荧光定量PCR检测方法其引物设计、合成更加简便。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，结果更加准确、可靠，重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广、稳定性好。

本发明的另一个目的是在于提供了一种荧光定量PCR试剂盒在检测（抗）小鼠痘病毒药物研究中的应用，可对小鼠、大鼠细胞制品进行定量检测和质量监控，也可以进行小鼠痘病毒引起的烈性传染性脱脚病的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种检测小鼠痘病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有：a)DNA提取液、b)引物、c)标准阳性模板、d)SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于：从细胞样品中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，定量检测未知样品。引物序列分别为正义引物：5’-GCCGTCATTCCTAAAAAAAGTGGT-3’，反义引物：5’-ATCAAAGCCTTGTTGTCTCCGA-3’，扩增子大小为176bp。标准阳性DNA模板由已插入小鼠痘病毒保守的病毒核心DNA连接蛋白编码区176bp的pTA2（购自TOYOBO公司）载体转化大肠杆菌DH5α(本实验室保存，大肠杆菌DH5α为最常用于常规克隆应用的大肠杆菌菌株。除支持蓝/白筛选外，DH5α的recA1和endA1突变可增强嵌入稳定性并提高自minipreps制备的质粒DNA质量)，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂ ₆₀定量并10倍梯度稀释。

所述的DNA提取液是由5mL100mM Tris-HCl(pH=8.5)、0.5mL0.5M EDTA、1mL10%SDS、2mL5M NaCl、0.25mL0.2mg/mL蛋白酶K和41.25mL灭菌的双蒸水组成。

所述的SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液由2×iTaq SYBR Green Supermix(with ROX)、10μM的正义引物和反义引物，以及灭菌的双蒸水组成。

所述的标准阳性DNA模板核苷酸序列为：

gccgtcattcctaaaaaaagtggtaggagaaagaataagaacatggttatcttccgtcaaggatcatcgcctatcttgtgtattttcgaaactcgtaaaaagattaatatttataaagaaaatatggaatccgcagctactgagtatacacctatcggagacaacaaggctttgat

在本发明的一个优选方案中，标准阳性DNA模板由含有插入目的片段的pTA2（购自TOYOBO公司）载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。实验所用的标准品制备过程为：PCR反应后，取适量产物凝胶电泳检测，扩增条带单一，即可与10×A-attachment Mix混合，于60℃反应30min；再与pTA2载体连接。转化感受态细胞，并将转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR鉴定阳性后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。根据测序结果将筛选的阳性克隆菌接种到含氨苄抗性的LB培养基过夜培养。次日提取质粒DNA，于紫外分光光度计测A₂₆₀定量，并稀释至梯度10⁸-10²拷贝/μL，-80℃保存。

一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒中，有非特异性荧光染料SYBR Green I。SYBR Green I是一种能够与双链DNA小沟结合的染料。没有与双链DNA结合时，其荧光信号很弱，当其与双链DNA结合后荧光信号大大增强并能够被仪器检测。利用SYBR Green I这种特点可以检测PCR扩增产物。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点。它能够与体系中所有的双链DNA相结合，因此无需为不同的模板特殊定制。此外，由于一个PCR产物可以与多个SYBR Green I染料相结合，因此灵敏度很高。对小鼠痘病毒的定量可通过与标准品的循环阈值（Ct，Threshold Cycle）相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数，Ct值与起始模板数的常用对数呈线性关系（log(起始模板数)=Ct值/斜率+X轴截距），Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒中，针对小鼠痘病毒的基因组的靶片段碱基排列的特殊性，将反应体系（引物浓度、扩增程序等）优化，并将Q-PCR技术和定量检测系统相结合，将其用于各种来源的小鼠痘病毒样品的定量检测。通过优化方案，建立了定量检测小鼠痘病毒的方法，并研制出小鼠痘病毒定量检测试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出100copies以下的病毒基因拷贝数，检测范围可以达到七个数量级。

所述的痘病毒为感染人和动物后常引起局部或全身化脓性皮肤损害的病毒。为病毒粒最大的一类DNA病毒，结构复杂。病毒粒呈砖形或椭圆形，大小（300～450）纳米×（170～260）纳米。有核心、侧体和包膜，核心含有与蛋白结合的病毒DNA。DNA为线型双链。痘病毒主要有①正痘病毒属：哺乳动物的病毒，含14个成员，多数引起全身性疹病。如天花病毒是人类天花的病原体；②痘苗病毒：实验室内经动物、鸡胚和细胞培养增殖后，用于对天花预防接种的病毒；③副痘病毒属：有蹄动物的病毒，可感染人。此外，还有禽痘病毒属、山羊痘病毒属、野兔痘病毒属、猪痘病毒属等。

在本发明的另外一个方面，本发明还提供了一种荧光定量PCR试剂盒在检测（抗）小鼠痘病毒药物研究中的应用，其应用过程是：

A.用c)标准阳性DNA模板由插入目的片段的pTA2（购自TOYOBO公司）载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并用紫外分光光度计定量；

B.用a)DNA提取液从待测标本中提取DNA；

C.荧光定量PCR由b)引物，d)SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，c)标准阳性DNA模板或所提取的标本DNA组成，已加入了标准品及待测品的荧光定量反应液PCR反应体系上机，用荧光定量检测仪进行PCR检测；

D.通过比较待测样品和标准品的循环阈值，根据拟合所得的标准曲线计算待测样品的起始拷贝数，并以此判断待测样品中是否含有鼠腺病毒。

在本发明中提供的检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒可对各种来源的小鼠痘病毒样品进行准确定量检测，并可对小鼠制品和小鼠细胞进行定量检测和质量监控，也可以进行小鼠痘病毒引起的烈性传染性脱脚病的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1.与传统定量方法相比，此实时荧光定量PCR具有高灵敏性、高特异性和高准确性的特点，直接对PCR每循环一次就收集一个数据，建立实施扩增曲线，准确的确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的核酸定量。

2.本实验采用SYBR Green I染料，通过融解曲线的分析可以区分单一引物、引物二聚体、非特异性扩增等，使结果更加可靠。使用SYBR Green I染料也降低了引物合成的成本。

3.检测范围广，在10⁸-10²copies/reaction浓度范围内有良好的线性关系（R=0.996），检测范围可以达到七个数量级，其灵敏度可检测100copies以下。

4.该实时荧光定量PCR利用外标准曲线，是迄今为止定量最准确、重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南（第三版）；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；F.M.奥斯伯等主编，科学出版社，2005，精编分子生物学实验指南；或按照制造厂商建议的条件。

实施例1：

一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒组成及其反应条件是：

A）试剂盒组成如下：（10次反应，检测10份待测样品）

DNA提取液（10mL/管）强阳性标准品（50μL/管）

PCR反应管（无菌）阴性标准品（50μL/管）临界阳性标准品（50μL/管）

强阳性标准品，即拷贝数为10⁸c/r的标准阳性DNA模板；

阴性标准品，即未感染鼠腺病毒的L929细胞(鼠腺病毒的宿主细胞)DNA；

临界阳性标准品，即拷贝数为10²c/r的标准阳性DNA模板。

SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液（110μL/管）（d)SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液购自Bio-rad公司）

所述DNA提取液(50mL)由5mL100mM Tris-HCl(pH=8.5)、0.5mL0.5M EDTA、1mL10%SDS、2mL5M NaCl、0.25mL0.2mg/mL蛋白酶K和41.25mL灭菌的双蒸水组成。

B）荧光定量反应液（反应总体积为20μL）：2×iTaq SYBR Green Supermix with ROX，正义引物FP和反义引物RT各1μL，待测样品DNA或标准品1μL，灭菌双蒸水7μL。

C）反应条件如下：

FQ-PCR：95℃，3min

95℃，15s

60℃，45s

40cycles

在每个循环的第二步结束时进行荧光检测。对小鼠痘病毒的定量可通过与标准品的循环阈值（Ct，Threshold Cycle）相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。

D)荧光定量PCR试剂盒检测小鼠痘病毒的灵敏度、检测范围及稳定性：

取c)标准阳性模板稀释至10⁸-10²c/r，8个浓度梯度，每个浓度三个重复，加SYBRGreen I实时荧光定量PCR反应液2×iTaq SYBR Green Supermix with ROX10μL，正义引物FP和反义引物RT各1μL，待测样品DNA或标准品1μL，灭菌双蒸水7μL。分别加入对应编号的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃3min，95℃15s，60℃45s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为518nm。

循环结束后，运用仪器自带的分析软件，读取待检样品拷贝数。结果为：

序列号	名称	类型	阈值（Ct）	设定浓度	变异系数%
						1	A1	Standard	10.13	100000000	0.77%
2	A2	Standard	10.07	100000000	0.16%
						3	A3	Standard	9.96	100000000	0.92%
4	B1	Standard	13.27	10000000	1.39%
						5	B2	Standard	13.00	10000000	0.70%
6	B3	Standard	12.99	10000000	0.76%
						7	C1	Standard	16.67	1000000	1.00%

8	C2	Standard	16.43	1000000	0.42%
						9	C3	Standard	16.40	1000000	0.59%
10	D1	Standard	19.95	100000	0.48%
						11	D2	Standard	19.82	100000	0.19%
12	D3	Standard	19.80	100000	0.28%
						13	E1	Standard	23.34	10000	0.39%
14	E2	Standard	23.67	10000	1.03%
						15	E3	Standard	23.29	10000	0.58%
16	F1	Standard	26.89	1000	0.49%
						17	F2	Standard	26.55	1000	0.79%
18	F3	Standard	26.84	1000	0.30%
						19	G1	Standard	30.51	100	2.41%
20	G2	Standard	30.05	100	0.87%
						21	G3	Standard	28.82	100	3.24%

以上结果表明：该试剂盒检测范围广，在10⁸-10²copies/reaction浓度范围内有非常良好的线性关系（R=0.999），检测范围可以达到七个数量级，其灵敏度可检测100copies以下，且稳定性好，一次实验中三个重复样品相应的变异系数（CV）小于5%，说明其具有较高的重复性。

实施例2：

一种小鼠痘病毒荧光定量PCR试剂盒在检测BHK-21细胞感染小鼠痘病毒药物中的应用，其应用过程是：

A）试剂盒组成如下：（10次反应）

DNA提取液（10mL/管）

强阳性标准品（50μL/管）

PCR反应管（无菌）

阴性标准品（50μL/管）

临界阳性标准品（50μL/管）

SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液（110μL/管）（d)SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，购自Bio-rad公司）

B）BHK-21细胞中提取病毒过程：将BHK-21细胞培养于T25细胞培养瓶，加入500μL a）DNA抽提液，于37℃消化3h；在细胞消化液中加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，于10000×g离心10min；弃去上清液，将沉淀溶解于40μL无菌H₂O。

C）反应条件如下：

FQ-PCR：95℃，3min

95℃，15s

60℃，45s

40cycles

D）荧光定量PCR试剂盒检测BHK-21细胞中的小鼠痘病毒：

取待检样品和阴性对照（未感染小鼠痘病毒的BHK-21细胞DNA），均做三个重复，加SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液2×iTaq SYBR Green Supermix with ROX10μL，正义引物FP和反义引物RT各1μL，待测样品DNA或标准品1μL，灭菌双蒸水7μL。分别加入对应编号的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃3min，95℃15s，60℃45s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为518nm。

E）循环结束后，运用仪器自带的分析软件，读取待检样品拷贝数。结果为：

样品编号	Ct值	小鼠痘病毒-copise/ml	变异系数%
				1	18.88	2.11×10⁵	0.09
2	18.92	2.06×10⁵	0.11
				3	18.90	2.10×10⁵	0.02
4	-	-
				5	-	-
6	-	-

以上结果表明，编号为1、2、3的样品中含有小鼠痘病毒，证实了小鼠痘病毒荧光定量PCR试剂盒能成功应用于小鼠痘病毒感染的细胞监测，且重复性好，变异系数小于1%。

Claims

1.一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有：a)DNA提取液、b)引物、c)标准阳性模板、d) SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液，其特征在于：从细胞样品中提取DNA，进行荧光定量PCR反应，同时引入标准阳性模板，引物序列分别为正义引物：5’-GCCGTCATTCCTAAAAAAAGTGGT-3’，反义引物：5’-ATCAAAGCCTTGTTGTCTCCGA-3’，扩增子大小为176bp，标准阳性DNA模板由已插入小鼠痘病毒保守的病毒核心DNA连接蛋白编码区176bp的pTA2载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。

2.根据权利要求1所述的一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的DNA提取液是由5mL 100mM Tris-HClpH=8.5、0.5mL 0.5M EDTA、1mL 10%SDS、2mL5M NaCl、0.25mL 0.2mg/mL蛋白酶K和41.25mL 灭菌的双蒸水组成。

3.根据权利要求1所述的一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的SYBR Green I实时荧光定量PCR反应液由2×iTaq SYBR Green Supermix 、10μM的正义引物和反义引物，以及灭菌的双蒸水组成。

4.根据权利要求1所述的一种检测小鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的标准阳性DNA模板核苷酸序列为：gccgtcattcctaaaaaaagtggtaggagaaagaataagaacatggttatcttccgtcaaggatcatcgcctatcttgtgtattttcgaaactcgtaaaaagattaatatttataaagaaaatatggaatccgcagctactgagtatacacctatcggagacaacaaggctttgat。

5.权利要求1所述的一种荧光定量PCR试剂盒在检测小鼠痘病毒药物中的应用。