CN111474339A - 一种利用荧光标记痘病毒颗粒的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用荧光标记痘病毒颗粒的方法及其应用，该方法利用CFSE荧光染料染色痘病毒颗粒，得到CFSE标记的痘病毒颗粒，另外本发明提供荧光标记痘病毒颗粒的应用，用于获取痘病毒颗粒感染靶细胞的情况，此时，CFSE标记的痘病毒颗粒可以在体外或体内感染靶细胞，通过流式细胞仪检测CFSE荧光颗粒的数量或者荧光显微镜下观察CFSE荧光颗粒的数量和分布情况，即可快速检测痘病毒颗粒感染靶细胞的情况，整个步骤不需要购置特殊的病毒或种属特异性抗体，具有检测快速高效，成本低的特点和优势。

Description

一种利用荧光标记痘病毒颗粒的方法及其应用
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，特别涉及一种利用荧光标记测痘病毒颗粒的方法及其应用。
背景技术
痘病毒，是能够使得人和动物被感染后引起局部或者全身化脓性皮肤损害的病毒。痘病毒，属于痘病毒科，其种类繁多，包括天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、鸡痘病毒等，不仅如此，痘病毒也是病毒颗粒最大的一类DNA病毒，其有着复杂庞大、高达200Kb的双链DNA基因组，病毒颗粒直径超过0.2μm。
实时、可视化的病毒侵染宿主细胞的过程有助于从本质上诠释病毒的侵染机制及致病机理,为了成功地跟踪病毒，需要一种有效的标记方法。病毒标记技术可分为荧光蛋白标记和化学标记：荧光蛋白标记主要是指重组荧光蛋白标记；化学标记技术主要包括量子点技术，双砷结合技术，点击化学以及化学荧光染料标记技术。尽管基因工程和化学偶联已被应用于追踪宿主细胞和体内的病毒感染，但这些策略可能会干扰病毒的侵入途径，而且技术要求高、过程繁琐、效率不高。
荧光染料(CFSE)，是一种可对活细胞进行荧光标记的小分子新型染料，可以标记活体细胞。其基本原理如下：CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。CFSE主要用于细胞增殖，体内细胞追踪，细胞毒性检测等，此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患，且可以更快速，更准确和更安全的得到想要的实验数据。
然而CFSE通常应用于真核细胞标记，也偶见于原核细胞如细菌，在病毒中未见有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用荧光标记痘病毒颗粒的方法及其应用，该方法利用CFSE荧光染料染色痘病毒颗粒，得到CFSE标记的痘病毒颗粒，另外本发明提供荧光标记痘病毒颗粒的应用，用于检测痘病毒颗粒感染靶细胞的情况，此时，CFSE标记的痘病毒颗粒可以在体外或体内感染靶细胞，通过流式细胞仪检测CFSE荧光颗粒的数量或者荧光显微镜下观察CFSE荧光颗粒的数量和分布情况，即可快速检测痘病毒颗粒感染靶细胞的情况，整个步骤不需要购置特殊的病毒或种属特异性抗体，具有检测快速高效，成本低的特点和优势。
为实现以上目的，本方案提供一种利用荧光标记痘病毒颗粒的方法,包括以下步骤:取纯化的痘病毒颗粒，加入CFSE荧光染料进行染色，得到CFSE标记的痘病毒颗粒。
在本方案中，将加入CFSE荧光染料的痘病毒颗粒置于37摄氏度室温条件下孵育15-45分钟，在孵育结束后，加入2倍体积的含有10％FBS的完全培养基终止染色。
另外，可通过流式细胞仪检测CFSE荧光颗粒的数量或在荧光显微镜下观察CFSE荧光颗粒。其中荧光显微镜选择为倒置荧光显微镜，本申请人通过多次验证实验证明CFSE荧光染料的确可以染色痘病毒颗粒。
另，本方案提供一种利用荧光标记痘病毒颗粒的应用，用于获取痘病毒颗粒感染靶细胞的情况。
此时，该方案的具体步骤如下：
步骤S1:取纯化的痘病毒颗粒，加入荧光染色试剂CFSE荧光染料进行染色，得到CFSE标记的痘病毒颗粒；
步骤S2：将CFSE标记的痘病毒颗粒按照设定浓度比例加入待检测样本中，其中待检测样本内含有靶细胞；
步骤S3:用荧光显微镜观察CFSE荧光颗粒，根据CFSE荧光颗粒的位置分布来判断痘病毒颗粒是否感染靶细胞，若CFSE荧光颗粒出现在靶细胞表面或细胞内则表示痘病毒颗粒成功感染靶细胞。
另外，在步骤S3中用流式分析仪对CFSE标记的痘病毒颗粒或是CFSE标记痘病毒感染后的靶细胞进行荧光检测，观察CFSE荧光颗粒的数量可以分析痘病毒颗粒的浓度和残留情况。
在本方案的一实施例中，在步骤S3当中用倒置荧光显微镜在200倍的物镜下进行观察。
值得一提的是，该方法特别适用于在科研过程中研究痘病毒颗粒感染细胞的情况，可用该方法直接观察培养皿中及在体的痘病毒颗粒，用于研究各种环境条件变化对痘病毒颗粒感染细胞的影响，也可以对痘病毒颗粒分布的变化情况进行定性和定量分析。
在本方案的步骤S1中，首先需要对痘病毒颗粒进行CFSE荧光标记。标记步骤中，CFSE和痘病毒颗粒的浓度和比例控制为1-10μM:0.5-5×108pfu/ml。以上浓度比例可以保证全部痘病毒颗粒被标记，并发出较强的可检测的荧光信号。
在本方案的步骤S2中，需要用CFSE标记的痘病毒颗粒体外感染或在体感染靶细胞，对应的，待检测样本可以是平面或悬浮培养的靶细胞样本，也可以是含有靶细胞的组织样本。
若待检测样本是平面或悬浮培养的靶细胞样本，可以直接在培养基中加入CFSE标记的痘病毒颗粒进行感染，CFSE标记的痘病毒颗粒和靶细胞的比例控制在0.5以上，并且可以直接在倒置荧光显微镜下观察病毒颗粒分布及靶细胞感染情况。
若待检测样本是含有靶细胞的组织样本，应往活体内注射一定剂量的CFSE标记的痘病毒颗粒，取活体的组织样本制备组织切片，组织切片用荧光染料进行细胞核染色后可以在倒置荧光显微镜下进行病毒颗粒观察。以小鼠为例，可以通过活体腹腔注射的方式注入CFSE标记的痘病毒，病毒剂量可以是每只小鼠1-10x106pfu。
在本方案中，染色条件为在37摄氏度室温条件下孵育15-45分钟，随即用2倍体积含有10％FBS的完全培养基中止染色。
本方案中的痘病毒的种类不受限制，所述痘病毒颗粒是痘病毒科的常见种类痘病毒，包括牛痘病毒，鸡痘病毒，天花病毒，猪痘病毒的任一种。
另，得到CFSE标记的痘病毒颗粒仅需要15-45分钟即可，其后利用得到CFSE标记的痘病毒颗粒感染靶细胞，利用荧光显微镜观察CFSE荧光颗粒的分布情况获知靶细胞的被感染情况，相较其他痘病毒的检测方法来说效率和时间都有了很大的提升。
本方案不仅仅可以在痘病毒颗粒感染细胞过程中定性检测痘病毒颗粒，还可定量检测痘病毒颗粒。
定性分析：在步骤S1中用过量的CFSE荧光染料染色标记痘病毒颗粒，随后用CFSE标记的痘病毒颗粒感染靶细胞，再利用荧光显微镜观察CFSE荧光颗粒的分布情况即可获知痘病毒颗粒感染靶细胞的感染情况。
定量分析：用流式分析仪对CFSE标记的痘病毒颗粒进行荧光检测，观察CFSE荧光颗粒的数量来分析痘病毒颗粒的浓度；用流式分析仪对CFSE标记痘病毒感染后的靶细胞进行荧光检测，观察CFSE荧光颗粒的数量来分析痘病毒颗粒感染靶细胞的数量。
由于痘病毒颗粒很大，直径可达到0.2-0.3um，接近细菌大小，且痘病毒颗粒的蛋白质衣壳外还包括一层有磷脂和蛋白组成的包膜，痘病毒颗粒的大尺寸和特殊的包膜结构使得痘病毒颗粒具有被CFSE染色的条件。基于其上的原理，本申请人在研究过程中发现痘病毒颗粒可以被CFSE染色，在此基础上本申请人研发利用荧光染色方法检测痘病毒颗粒感染细胞情况的方法，利用CFSE染色标记的痘病毒颗粒感染靶细胞，通过流式细胞仪检测CFSE荧光颗粒的数量或荧光显微镜观察CFSE荧光颗粒的分布和数量来分析痘病毒颗粒感染靶细胞的情况，该方法不需要购买特殊的病毒抗体，在科研过程中可以直接利用该方法观察培养皿中及在体组织中的痘病毒颗粒感染细胞的情况，也可以对痘病毒颗粒分布情况进行定性和定量分析。
附图说明
图1是是根据本发明提供的方法对牛痘病毒颗粒进行CFSE染色的实验结果图。
图2是不同比例的荧光标记的牛痘病毒颗粒感染143TK靶细胞后应用流式细胞仪的检测示意图。
图3是根据本发明用CFSE标记的痘病毒体外感染靶细胞的检测结果图。
图4是根据本发明用CFSE标记的痘病毒感染小鼠后，小鼠肝组织免疫荧光切片的检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。
可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
CFSE，羧基荧光素乙酸盐琥珀酰亚胺酯，是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光，CFSE标记非常稳定，可长达数周之久，因此，CFSE常与流式细胞术配合，用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。
长时间以来，本领域的技术人员都集中研究CFSE染色活体细胞的技术，而没有考虑CFSE应用于非细胞颗粒的染色(如细菌、病毒)的可能性，本申请人在研究过程中发现CFSE可用于染色痘病毒颗粒，并基于该发现利用CFSE标记的痘病毒颗粒感染靶细胞，进而获取靶细胞的被感染情况。
一、痘病毒CFSE染色实验：
该实验的目的是为了证明痘病毒可被CFSE染色，在该实验中选择牛痘病毒为痘病毒做实验，其他类型的痘病毒颗粒只要具备大尺寸以及特殊包膜的结构特点，就可用该方法进行染色。
实验材料及仪器：
牛痘病毒颗粒(纯化的牛痘病毒株VR-1354购买自ATCC)，CFSE(Invitrogen)，PBS缓冲液，FBS(Gibco)；
流式细胞仪(BD FACSCantoII)。
实验过程：
1.取约1-2x108pfu的纯化的牛痘病毒颗粒添加至1ml 5μM利用PBS配制的CFSE溶液中；
2.将混合CFSE溶液和牛痘病毒颗粒的培养皿置于37℃环境下孵育30min；
3.加入2倍体积含有10％FBS的完全培养基终止染色；
4.将终止染色后的样品放入流式分析仪中上样检测。
实验结果：
实验结果如图1所示，流式上机检测到CFSE标记的牛痘病毒颗粒。图1的左排上是未标记的牛痘病毒颗粒的前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)检测结果，左排下是标记的牛痘病毒颗粒的前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)检测结果。可见，牛痘病毒颗粒的物理参数可被流式细胞仪检测到，且痘病毒颗粒在流式FSC和SSC的检测下数值远小于一般细胞颗粒，可知此时检测到的是牛痘病毒颗粒。
图1右排上是未标记的牛痘病毒颗粒用流式分析仪的绿色荧光通道的检测结果，右排下是标记的牛痘病毒颗粒用流式分析仪的绿色荧光通道的检测结果，可见CFSE标记牛痘病毒颗粒的染色效率接近100％，因此也可得出结论，牛痘病毒颗粒可被CFSE完全地染色。
二、感染靶细胞的牛痘病毒颗粒的CFSE染色检测方法：
该实验的目的是为了证明CFSE标记的痘病毒颗粒体外感染靶细胞后可被荧光检测，进而实现定性和定量的目的，本方案依旧选择牛痘病毒为痘病毒做实验，选择143TK细胞为靶细胞。当然，其他同类痘病毒和靶细胞均可作为实验样本，任何可被痘病毒感染的细胞均可作为靶细胞。
实验材料及仪器：
牛痘病毒颗粒(纯化的牛痘病毒株VR-1354购买自ATCC)，CFSE(Invitrogen)，PBS,143TK细胞(购买自ATCC)；
倒置荧光显微镜(Nikon)。
实验过程：
首先通过预实验确定痘病毒感染靶细胞的比例范围：
1.按每孔5×105143TK细胞接种6孔板，常规培养条件过夜。
2.按照MOI从0到5加入不同剂量共表达GFP的重组纯化牛痘病毒颗粒(VV-GFP)感染143TK细胞，继续培养24小时。
3.胰蛋白酶消化处理后，用流式分析仪直接检测感染牛痘病毒(GFP阳性)的143TK细胞，检测结果如图2所示。
4.按照痘病毒CFSE染色实验中的染色方法对纯化的牛痘病毒VR-1354进行CFSE染色，得到CFSE染色标记的牛痘病毒颗粒。
5.根据步骤3中的检测结果，利用CFSE染色标记的牛痘病毒颗粒以感染复数5(MOI＝5)的比例感染143TK细胞；
6.感染1h和24h，分别用倒置荧光显微镜，在200倍物镜下观察明场和绿色荧光颗粒，其中绿色荧光信号表明牛痘病毒颗粒所在位置，如果绿色荧光信号位于靶细胞表面或细胞内(两者光信号重合)，即说明CFSE标记的牛痘病毒颗粒已感染上靶细胞。
实验结果：
如图2所示，用不同比例的牛痘病毒感染143TK靶细胞，可用流式细胞仪检测到GFP阳性的细胞比例逐渐增高，当MOI达到0.5时，90％以上细胞都被感染。
倒置荧光显微镜检测的实验结果如图3所示，可见利用倒置荧光显微镜可观察到CFSE标记的牛痘病毒颗粒,绿色荧光标记的牛痘病毒颗粒其大小远远小于靶细胞，并且无细胞形态，因此可用显微镜观察区别痘病毒颗粒和靶细胞。
且发现牛痘病毒按照MOI＝5感染靶细胞后1h，细胞内已经含有绿色荧光的牛痘病毒颗粒，在感染24h后，仍能检测到细胞内的CFSE荧光信号。需要说明的是，1小时是常规感染时间，1小时后对细胞进行换液，同时洗去培养皿中细胞碎片和其他杂质。因为培养过程中部分细胞发生分裂，CFSE标记的VV随着细胞分裂分散到子细胞中，因此单个细胞中的CFSE荧光强度可能会减弱。而，体外感染细胞24小时后且经过换液的步骤后显微镜下仍可观察到细胞内有荧光信号，说明该信号不是细胞碎片或其他杂质。
由于本方案提供的是黑白图，图中的高亮部分为荧光。
三、在体感染的牛痘病毒颗粒CFSE染色检测方法：
实验材料及仪器：
牛痘病毒颗粒(纯化的牛痘病毒株VR-1354购买自ATCC)，CFSE(Invitrogen)，C5BL/6小鼠(购买自美国Jackson lab)；
倒置荧光显微镜(Nikon)。
实验过程：
1.取约1-2x108pfu的纯化的牛痘病毒颗粒添加至1ml 5μM利用PBS配制的CFSE中，得到CFSE染色标记的牛痘病毒。
2.随机选择等量(每组小鼠数量选择为5)的C5BL/6小鼠分为实验组小鼠和对照组小鼠，将CFSE染色标记的牛痘病毒颗粒按照5x106pfu/1ml PBS的浓度分装，分别腹腔注射到实验组小鼠体内，同时对照组小鼠腹腔注射等体积的PBS溶液。
3.实验组小鼠和对照组小鼠在同样的条件下养育30min后，取同等位置和同等大小的小鼠肝脏做冷冻切片，切片用Hoechst 33258标记细胞核，然后用倒置荧光显微镜，在200倍物镜下观察蓝色信号和绿色荧光颗粒。其中绿色荧光颗粒即CFSE标记的牛痘病毒颗粒，蓝色信号为肝细胞核。
实验结果：
实验结果如图3所示，由于检测图为黑白图，蓝色荧光是Hoechst 33258标记的肝细胞核，图中显示为暗色部；绿色荧光是CFSE荧光颗粒，图中显示为亮色部，由实验结果可见，实验组小鼠的肝脏组织内均匀分布有绿色荧光的牛痘病毒，说明CFSE标记的痘病毒已感染小鼠肝细胞。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用荧光标记痘病毒颗粒的方法,其特征在于,包括以下步骤:
取纯化的痘病毒颗粒，加入CFSE荧光染料进行染色，得到CFSE标记的痘病毒颗粒。
2.根据权利要求1所述的利用荧光标记痘病毒颗粒的方法,其特征在于,加入CFSE荧光染料的痘病毒颗粒置于37摄氏度室温条件下孵育15-45分钟，在孵育结束后，加入2倍体积的含有10％FBS的完全培养基终止染色。
3.根据权利要求1所述的利用荧光标记痘病毒颗粒的方法,其特征在于,通过流式细胞仪检测CFSE荧光颗粒的数量或在荧光显微镜下观察CFSE荧光颗粒。
4.一种利用荧光标记痘病毒颗粒的方法的应用，其特征在于，用于获取痘病毒颗粒感染靶细胞的情况。
5.根据权利要求4所述的利用荧光标记痘病毒颗粒的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1:取纯化的痘病毒颗粒，加入CFSE荧光染料进行染色，得到CFSE标记的痘病毒颗粒；
步骤S2：将CFSE标记的痘病毒颗粒按照设定的浓度比例加入待检测样本中，其中待检测样本内包括靶细胞；
步骤S3:用荧光显微镜观察CFSE荧光颗粒，根据CFSE荧光颗粒的位置分布来判断痘病毒颗粒是否感染靶细胞，若CFSE荧光颗粒出现在靶细胞表面或靶细胞内则表示痘病毒颗粒成功感染靶细胞。
6.根据权利要求5所述的利用荧光标记痘病毒颗粒的方法的应用，其特征在于，待检测样本是平面或悬浮培养的靶细胞样本或含有靶细胞的组织样本。
7.根据权利要求6所述的利用荧光标记痘病毒颗粒的方法的应用，其特征在于，若待检测样本为含有靶细胞的组织样本，在步骤S2中，往活体内注射设定剂量的CFSE标记的痘病毒颗粒，取活体的在体组织切片，对细胞核进行荧光染色后，置于荧光显微镜下观察。
8.根据权利要求6所述的利用荧光标记痘病毒颗粒的方法的应用，其特征在于，若待检测样本是平面培养或悬浮培养的靶细胞样本，CFSE标记的痘病毒颗粒和靶细胞的比例为0.5以上。
9.根据权利要求5所述的利用荧光标记痘病毒颗粒的方法的应用，其特征在于，用流式分析仪对CFSE标记的痘病毒颗粒进行荧光检测，观察CFSE荧光颗粒的数量来分析痘病毒颗粒的浓度；用流式分析仪对CFSE标记痘病毒感染后的靶细胞进行荧光检测，观察CFSE荧光颗粒的数量来分析痘病毒颗粒感染靶细胞的数量。
10.根据权利要求5所述的利用荧光标记痘病毒颗粒的方法的应用，其特征在于，所述痘病毒颗粒是痘病毒科的常见种类痘病毒，包括牛痘病毒，鸡痘病毒，天花病毒，猪痘病毒的任一种。
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