CN109212207A - 用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂及其制备方法和检测方法 - Google Patents

用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂及其制备方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，尤其是涉及一种用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂及其制备方法和检测方法。所述荧光试剂包括化合物A、溶剂B和溶液C；所述溶剂B包括二甲基亚砜、乙腈和二甲基甲酰胺中的一种或多种；所述溶液C包括水、口腔拭子溶液或含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子溶液。将化合物A溶解于溶剂B中，加入溶液C，混合均匀，即得所述用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂。本发明的荧光试剂，可对口腔中H5N1血凝素蛋白进行检测，不受口腔中的成分的干扰；并且，本发明所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检测灵敏度高，可以对浓度≥81.5ng/mL的H5N1血凝素蛋白进行定量检测。

Description

用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂及其制备方 法和检测方法
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，尤其是涉及一种用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂及其制备方法和检测方法。
背景技术
禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属。禽甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白抗原性不同分为不同的亚型。其除感染禽外，还可感染人、猪、马等哺乳动物。甲型流感主要病毒类型：H7N9、H1N1、H5N1，H3、H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。
禽流感诊断试剂是禽流感防控的重要武器，在禽流感防控中发挥着重要作用。通过检测抗原抗体以掌握该疫病的流行状况，为防控做好充分准备。由于技术力量不足和缺乏快速、准确的诊断监测方法，目前我国在禽流感的监测环节仍然比较薄弱，主要依靠政府主导的实验室检测。流感确诊通常有以下几项：1.病毒核酸检测。以RT-PCR法检测呼吸道标本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或气管抽取物、痰)中的流感病毒核酸。2.病毒分离培养。从呼吸道标本中分离出流感病毒。在流感流行季节，流感样病例快速抗原诊断和免疫荧光法检测阴性的患者建议也作病毒分离。3.病毒抗原检测(快速诊断试剂检测)。快速抗原检测方法可采用免疫荧光的方法，检测呼吸道标本，使用单克隆抗体来区分甲、乙型流感，一般可在数小时以内获得结果。4.血清学诊断检测。流感病毒特异性IgM和IgG抗体水平。动态检测的IgG抗体水平恢复期比急性期有4倍或以上升高有回顾性诊断意义。
实验室检测虽然准确度高，但是成本高昂，操作较为繁琐，检测不够及时，无法满足广大养殖户的禽流感监测需求。国内禽流感诊断试剂的产业化和商业化发展相对滞后，标准化的禽流感诊断试剂具有广阔的市场空间。
人感染H5N1符合禽-人传播，可能存在环境-人传播。病毒抗原及基因检测可检测甲型流感病毒核蛋白抗原(NP)或基质蛋白(M1)、禽流感病毒H亚型抗原。还可用RT-PCR法检测禽流感病毒亚型特异性H抗原基因。可从患者呼吸道标本中，特别是上呼吸道标本中分离出禽流感病毒。感染禽流感病毒后，除了对症治疗以外，需要尽早(在发病48小时内)口服奥司他韦，因此快速检测显得尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，所述荧光试剂可以通过口腔拭子定量检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的浓度，检测灵敏度高且快捷，可以实现实时检测，检测成本低。
本发明的第二目的在于提供一种所述用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂的制备方法，所述制备方法工艺简单，重复性好，操作方便。
本发明的第三目的在于提供一种所述的荧光试剂对口腔中流感病毒血凝素蛋白的检测方法，所述荧光试剂可用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的含量，以口腔拭子作为采样方法，在口腔中检测流感病毒，可以实现对流感的实时监测，检测方法简单，灵敏度高，检测成本低。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，包括化合物A、溶剂B和溶液C；
所述化合物A的结构式如下：
其中，X包括碘和溴中的任一种，R选自烷基中的任一种；
所述溶剂B包括二甲基亚砜、乙腈和二甲基甲酰胺中的一种或多种；
所述溶液C包括水、口腔拭子溶液或含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子溶液。
优选的，所述X为碘。所述R为甲基或乙基，优选为甲基。
本发明采用化合物A制备得到的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白具有实时的荧光“点亮”效果，且检测快速；对于H5N1血凝素蛋白的检测，不受口腔中的成分的干扰，对H5N1血凝素蛋白具有特异性检测；并且，本发明所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检测灵敏度高，可以对浓度≥81.5ng/mL的H5N1血凝素蛋白进行定量检测。口腔中的病毒含量通常可达105.2EID50/mL，换算后约为1μg/mL，因而本发明的化合物A制备得到的荧光试剂可对口腔中的流感病毒血凝素蛋白含量进行精确检测。
上述检测限的计算方式是基于荧光滴定法计算检测限的。首先测试空白测量的标准偏差，采用纯溶液的发射强度重复测试10次，在血凝素蛋白质存在下，溶液的发射强度独立地重复测量三次，并且将强度的平均值与对应的浓度作图，用于确定直线斜率，使用以下公式计算检测限：
检测限＝3δ/k
其中，δ是纯化合物A的发射强度的标准偏差，k是发射强度与血凝素蛋白浓度之间的斜率。
并且，本发明所述的荧光试剂的荧光稳定性好，检测灵敏度高，并且易于保存。
本发明所述的荧光试剂能够用于检测流感病毒血凝素蛋白，通过对机理探究，发现，化合物A中小粒径的部分能够在特定位点之间的静电相互作用的驱动下进入血凝素蛋白中的孔隙，从而实现对血凝素蛋白的检测。
优选的，所述荧光试剂中，化合物A的浓度为10-6mol/L-10-4mol/L，优选为10-6mol/L-9.0×10-5mol/L，进一步优选为10-6mol/L。
优选的，所述溶剂B与所述溶液C的体积比为1﹕(99-9999)，进一步优选为1﹕9999。
优选的，所述溶剂B为二甲基亚砜。所述水优选为去离子水。
优选的，所述口腔拭子溶液的制备方法包括：用采集拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，浸入采样液中，即得。更优选的，浸入3-4mL的采样液中。进一步优选的，所述采样液包括去离子水。
优选的，所述含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子采样液中H5N1血凝素蛋白的浓度为0-1.8μg/mL。
本发明还提供了一种所述用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂的制备方法，包括如下步骤：
将化合物A溶解于溶剂B中，加入溶液C，混合均匀，即得所述用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂。
本发明所述的荧光试剂的制备方法工艺简单，重复性好，操作方便。
本发明还提供了一种所述的荧光试剂检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的方法，包括如下步骤：
(a)绘制标准工作曲线；
(b)采集口腔拭子，浸入采样液，得到待测口腔拭子采样液；
(c)测试荧光试剂荧光强度，向荧光试剂中加入1-30μL的待测口腔拭子采样液，测试荧光强度。
口腔拭子取样方法是最简单、无痛、无创的采样方法。该方法适用于采集任何年龄段的人群样本，整个采样过程方便、迅速、隐私。特别是感染初期，口腔中的浓度最高。本检测方法使用口腔咽拭子，在口腔中检测流感病毒。人感染H5N1后发病的1～16天，都可从患者鼻咽部分离物中检出病毒。
口腔中成分较复杂，含有多种蛋白质、糖类等物质，而本发明的荧光试剂可采用口腔拭子溶液作为分散的溶液，口腔中的各种成分不会影响荧光试剂中的化合物A对血凝素蛋白的响应。这主要也是因为化合物A结构中的N+和I-或者Br-对血凝素蛋白的特异性响应。
本发明所述的荧光试剂不受口腔中其它成分的影响，对口腔中流感病毒血凝素蛋白具有特异性响应，并且能够对血凝素蛋白实现实时检测，实现快速检测，克服了现有技术中检测方法复杂以及周期长的问题。
优选的，所述步骤(c)中，测试荧光强度后，对照标准工作曲线，得到口腔拭子中流感病毒血凝素蛋白的含量。
优选的，所述采样液包括去离子水。
优选的，所述步骤(b)中，用采集拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，浸入3-4mL采样液中。
优选的，所述标准工作曲线的绘制方法包括：
测试荧光试剂的初始强度I0，向荧光试剂中逐步加入流感病毒血凝素蛋白，并依次测试荧光强度Ii，绘制(Ii-I0)/I0与流感病毒血凝素蛋白加入量的标准工作曲线。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明采用化合物A制备得到的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白具有实时的荧光“点亮”效果，且检测快速；对于H5N1血凝素蛋白的检测，不受口腔中的成分的干扰，对H5N1血凝素蛋白具有特异性检测；并且，本发明所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检测灵敏度高，可以对浓度≥81.5ng/mL的H5N1血凝素蛋白进行定量检测；
(2)本发明所述的荧光试剂的制备方法工艺简单，重复性好，操作方便；
(3)本发明所述的荧光试剂对口腔中流感病毒血凝素蛋白的检测方法，以口腔拭子作为采样方法，在口腔中检测流感病毒，可以实现对流感的实时监测，检测方法简单，灵敏度高，检测成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为向本发明实施例1制备的荧光试剂中加入不同蛋白质后的荧光强度变化率对比图；
图2为向本发明实施例1制备的荧光试剂中加入不同氨基酸以及H5N1血凝素蛋白后的荧光强度变化率对比图；
图3为向本发明实施例1制备的荧光试剂中加入不同血凝素蛋白后的荧光强度变化率对比图；
图4为向本发明实施例1制备的荧光试剂中加入不同浓度的H5N1血凝素蛋白后的荧光强度变化率随时间变化图；
图5为本发明实施例1制备得到的荧光试剂在不同浓度的H5N1血凝素蛋白下的荧光图谱；
图6为图5中的荧光试剂的荧光强度变化率随H5N1血凝素蛋白浓度的变化曲线及其拟合直线图；
图7为本发明实施例4制备得到的荧光试剂的荧光强度变化率随H5N1血凝素蛋白浓度的变化曲线及其拟合直线图；
图8为本发明实施例5制备得到的荧光试剂在的荧光强度变化率随H5N1血凝素蛋白的浓度的变化曲线图；
图9为本发明实施例1制备得到的荧光试剂在不同保存条件下的荧光变化率随时间变化曲线图；
图10为本发明实施例1制备得到的荧光试剂中分别加入N1蛋白、H5蛋白、依次加入N1蛋白和H5蛋白以及依次加入H5蛋白和N1蛋白后的荧光强度变化率对比图；
图11为血凝素H5、化合物A、以及血凝素H5和化合物A复合的粒度分布图；
图12为血凝素、血凝素与化合物A复合的Zeta电位图；
图13为模拟计算结果，其中，(A)为靶蛋白的结合位点，(B)为使用AutoDock vina软件进行分子对接结果图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
主要原料和试剂
H5N1血凝素蛋白，试剂纯度＞97％，北京义翘神州生物科技有限公司；
二甲基亚砜(DMSO)，A.R.，天津光复精细化工研究所；
生理盐水，生物级别，石家庄四药有限公司。
本发明提供了一种用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，包括化合物A、溶剂B和溶液C；
所述化合物A的结构式如下：
其中，X包括碘和溴中的任一种，R选自烷基中的任一种；
所述溶剂B包括二甲基亚砜、乙腈和二甲基甲酰胺中的一种或多种；
所述溶液C包括水、口腔拭子溶液或含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子溶液。
本发明采用化合物A制备得到的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白具有实时的荧光“点亮”效果，且检测快速；对于H5N1血凝素蛋白的检测，不受口腔中的成分的干扰，对H5N1血凝素蛋白具有特异性检测；并且，本发明所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检测灵敏度高，可以对浓度≥81.5ng/mL的H5N1血凝素蛋白进行定量检测。
在本发明一优选实施方式中，所述荧光试剂中，化合物A的浓度为10-6mol/L-10- 4mol/L，优选为10-6mol/L-9.0×10-5mol/L，进一步优选为10-6mol/L。
如在不同实施例中，所述荧光试剂中，化合物A的浓度可以为10-6mol/L、10-5mol/L、2.0×10-5mol/L、3.0×10-5mol/L、4.0×10-5mol/L、5.0×10-5mol/L、6.0×10-5mol/L、7.0×10-5mol/L、8.0×10-5mol/L、9.0×10-5mol/L、10-4mol/L等等。
在本发明一优选实施方式中，所述溶剂B为二甲基亚砜。所述水优选为去离子水。
在本发明一优选实施方式中，所述口腔拭子采样液的制备方法包括：用采集拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，浸入采样液中，即得。更优选的，浸入3-4mL的采样液中。进一步优选的，所述采样液包括去离子水。
在本发明一优选实施方式中，所述含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子采样液中H5N1血凝素蛋白的浓度为0-1.8μg/mL。
本发明还提供了一种所述用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂的制备方法，包括如下步骤：
将化合物A溶解于溶剂B中，加入溶液C，混合均匀，即得所述用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂。
本发明所述的荧光试剂的制备方法工艺简单，重复性好，操作方便。
本发明还提供了一种所述的荧光试剂检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的方法，包括如下步骤：
(a)绘制标准工作曲线；
(b)采集口腔拭子，浸入采样液，得到待测口腔拭子采样液；
(c)测试荧光试剂荧光强度，向荧光试剂中加入1-30μL的待测口腔拭子采样液，测试荧光强度。
口腔拭子取样方法是最简单、无痛、无创的采样方法。该方法适用于采集任何年龄段的人群样本，整个采样过程方便、迅速、隐私。特别是感染初期，口腔中的浓度最高。本检测方法使用口腔咽拭子，在口腔中检测流感病毒。人感染H5N1后发病的1～16天，都可从患者鼻咽部分离物中检出病毒。
本发明所述的荧光试剂不受口腔中其它成分的影响，对口腔中流感病毒血凝素蛋白具有特异性响应，并且能够对血凝素蛋白实现实时检测，实现快速检测，克服了现有技术中检测方法复杂以及周期长的问题。
在本发明一优选实施方式中，所述步骤(c)中，测试荧光强度后，对照标准工作曲线，得到口腔拭子中流感病毒血凝素蛋白的含量。
在本发明一优选实施方式中，所述采样液包括去离子水。
在本发明一优选实施方式中，所述步骤(b)中，用采集拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，浸入3-4mL采样液中。
在本发明一优选实施方式中，所述标准工作曲线的绘制方法包括：
测试荧光试剂的初始强度I0，向荧光试剂中逐步加入流感病毒血凝素蛋白，并依次测试荧光强度Ii，绘制(Ii-I0)/I0与流感病毒血凝素蛋白加入量的标准工作曲线。
下述实施例中以结构式为
的化合物A进行详细描述。
实施例1
本实施例所述的荧光试剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将化合物A溶解于DMSO中，得到浓度为1×10-2mol/L的溶液a；
(2)取30μL步骤(1)得到的溶液a，加入2700μL的去离子水，得到DMSO的体积分数为1％、化合物A的浓度为1×10-4mol/L的溶液b1；
(3)用去离子水将步骤(2)得到的溶液b稀释100倍，得到DMSO的体积分数为0.01％、化合物A的浓度为1×10-6mol/L的溶液c1，即为所述荧光试剂。
实施例2
本实施例所述的荧光试剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将化合物A溶解于DMSO中，得到浓度为0.1mol/L的溶液a；
(2)取30μL步骤(1)得到的溶液a，加入2700μL的去离子水，得到DMSO的体积分数为1％、化合物A的浓度为1×10-3mol/L的溶液b1；
(3)用去离子水将步骤(2)得到的溶液b稀释100倍，得到DMSO的体积分数为0.01％、化合物A的浓度为1×10-5mol/L的溶液c1，即为所述荧光试剂。
实施例3
本实施例所述的荧光试剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将化合物A溶解于DMSO中，得到浓度为1mol/L的溶液a；
(2)取30μL步骤(1)得到的溶液a，加入2700μL的去离子水，得到DMSO的体积分数为1％、化合物A的浓度为1×10-2mol/L的溶液b1；
(3)用去离子水将步骤(2)得到的溶液b稀释100倍，得到DMSO的体积分数为0.01％、化合物A的浓度为1×10-4mol/L的溶液c1，即为所述荧光试剂。
实施例4
本实施例所述的荧光试剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将化合物A溶解于DMSO中，得到浓度为1×10-2mol/L的溶液a；
(2)取30μL步骤(1)得到的溶液a，加入2700μL的口腔拭子采样液，得到DMSO的体积分数为1％、化合物A的浓度为1×10-4mol/L的溶液b2；
(3)用口腔拭子采样液将步骤(2)得到的溶液b稀释100倍，得到DMSO的体积分数为0.01％、化合物A的浓度为1×10-6mol/L的溶液c2，即为所述荧光试剂。
其中，所述口腔拭子采样液的制备方法为：用采集拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，浸入3mL的去离子水中，将拭子反复挤压以得到高浓度的蛋白质溶液，得到所述口腔拭子采样液。
实施例5
本实施例所述的荧光试剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将化合物A溶解于DMSO中，得到浓度为1×10-2mol/L的溶液a；
(2)取30μL步骤(1)得到的溶液a，加入2700μL的口腔拭子采样液或含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子采样液，得到一系列DMSO的体积分数为1％、化合物A的浓度为1×10-4mol/L、H5N1血凝素蛋白的浓度分别为0mg/L、100/3mg/L、200/3mg/L、100mg/L、400/3mg/L和500/3mg/L的溶液b3；
(3)用口腔拭子采样液将步骤(2)得到的溶液b稀释100倍，得到DMSO的体积分数为0.01％、化合物A的浓度为1×10-6mol/L、H5N1血凝素蛋白的浓度分别为0mg/L、1/3mg/L、2/3mg/L、1mg/L、4/3mg/L和5/3mg/L的溶液c3，即为所述荧光试剂。
其中，所述口腔拭子采样液的制备方法为：用采集拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，浸入3mL的去离子水中，将拭子反复挤压以得到高浓度的蛋白质溶液，得到所述口腔拭子采样液；
所述含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子采样液是向口腔拭子采样液中加入不同浓度的H5N1血凝素蛋白配制得到的。
本实施例是模拟在口腔环境中进行检测，在拭子中提前将一定含量的H5N1血凝素蛋白混入，以对比此检测情况是否与在实施例4的荧光试剂中加入H5N1血凝素蛋白的检测相吻合。
比较例1
比较例1的荧光试剂与实施例1的制备方法类似，其区别仅在于采用化合物B替换化合物A，化合物B的结构式如下：
比较例2
比较例2的荧光试剂与实施例1的制备方法类似，其区别仅在于采用化合物C替换化合物A，化合物C的结构式如下：
比较例3
比较例3的荧光试剂与实施例1的制备方法类似，其区别仅在于采用化合物D替换化合物A，化合物D的结构式如下：
实验例1
特异性识别
为了说明本发明所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检测特异性，以本发明实施例1制备得到的荧光试剂为例，在H5N1血凝素蛋白、牛血清白蛋白、血红蛋白、刀豆蛋白A、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原蛋白、γ球蛋白、纤维蛋白原、胆固醇中测试本发明所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的特异性识别。
具体测试方法为：取11份体积均为3mL的实施例1制备得到的荧光试剂，分别配制浓度为0.25mg/mL的H5N1血凝素蛋白、卵清白蛋白、牛血清白蛋白、血红蛋白、胸苷、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白、伴刀豆凝集素A、转铁蛋白的11种溶液，在荧光试剂中分别加入30μL的前述蛋白质的溶液，用荧光分光光度计(F-7000，日立高新技术公司)测量与不同蛋白质混合后的荧光试剂的荧光信号(激发波长为422nm)，测试结果如图1所示。
从图1中可知，所述荧光试剂对H5N1血凝素蛋白具有优异的荧光点亮响应，而对其它蛋白质的荧光响应很弱。
为了进一步说明本发明所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检测特异性，以本发明实施例1制备得到的荧光试剂为例，测试蛋白质水解后的游离氨基酸是否会影响荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检出效果。
具体测试方法为：取21份体积均为3mL的实施例1制备得到的荧光试剂，分别配制浓度为10-3mol/L的丙氨酸(a)、脯氨酸(b)、谷氨酰胺(c)、甘氨酸(d)、缬氨酸(e)、亮氨酸(f)、苯丙氨酸(g)、丝氨酸(h)、甲硫氨酸(i)、异亮氨酸(j)、组氨酸(k)、色氨酸(l)、精氨酸(m)、赖氨酸(n)、天冬氨酸(o)、苏氨酸(p)、谷氨酸(q)、天冬酰胺(r)、酪氨酸(s)以及半胱氨酸(t)20种溶液，并在另一份荧光试剂中加入30μL浓度为0.25mg/mL的H5N1血凝素蛋白溶液(u)，用荧光分光光度计(F-7000，日立高新技术公司)测量与不同氨基酸以及H5N1血凝素蛋白混合后的荧光试剂的荧光信号(激发波长为423nm)，测试结果如图2所示。
从图2中可知，所述荧光试剂对H5N1血凝素蛋白具有优异的荧光点亮响应，而对氨基酸均无明显变化，即血凝素蛋白及其他蛋白质水解后的游离氨基酸不会影响荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检出效果。
为了进一步说明本发明所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检测特异性，以本发明实施例1制备得到的荧光试剂为例，取4份体积均为3mL的实施例1制备得到的荧光试剂，分别配制浓度为0.25mg/mL的H1血凝素蛋白、H3血凝素蛋白、H5血凝素蛋白、H7血凝素蛋白的4种溶液，测试4份荧光试剂的初始荧光强度，然后在荧光试剂中分别加入30μL的前述的蛋白质的溶液，测试与不同蛋白质混合后的荧光试剂的荧光信号(激发波长为422nm)，测试结果如图3所示。
从图3中可知，本发明所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白具有优异的荧光点亮响应，而对其他血凝素蛋白的响应较弱。
实验例2
检出时间测试
为了测试本发明所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检出时间，以本发明实施例1制备得到的荧光试剂为例，将H5N1血凝素蛋白稀释于去离子水中，得到浓度为0.25mg/mL的H5N1血凝素蛋白溶液。取3mL实施例1中得到的荧光试剂，先用荧光分光光度计测量空白荧光试剂的荧光强度(激发波长为423nm)，然后向荧光试剂中加入4μL的前述配制好的H5N1血凝素蛋白溶液(此时混合溶液中H5N1血凝素蛋白的总浓度为1/3μg/mL)，立刻测试其荧光强度，1min后再次测试其荧光强度，重复以上操作，每次再向荧光试剂中加入4μL的H5N1血凝素蛋白溶液，直至加入到荧光试剂中的H5N1血凝素蛋白的总浓度为5/3μg/mL，测试结果见图3。
从图4中可知，本发明所述的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检测非常快捷，在荧光试剂与H5N1血凝素蛋白混合后立即测量的荧光强度与混合1min后测量的荧光强度几乎无差别，即荧光试剂对H5N1血凝素蛋白的检出效果为即时响应。
实验例3
定量检测实验
为了说明本发明制备得到的荧光试剂对H5N1血凝素蛋白具有定量检测能力，以实施例1、实施例4制备得到的荧光试剂为例，进行定量检测实验。
具体操作为：将H5N1血凝素蛋白稀释于去离子水中，得到浓度为0.25mg/mL的H5N1血凝素蛋白溶液；取3mL实施例1制备得到的荧光试剂，测量荧光试剂的初始荧光强度I0，然后每次向荧光试剂中加入4μL的H5N1血凝素蛋白溶液，直至加入至荧光试剂中的H5N1血凝素蛋白的总浓度为2.5μg/mL，并测量每次加入H5N1血凝素蛋白后的荧光试剂的荧光强度Ii(激发波长为423nm)，测试结果见图5和图6。
取3mL实施例4制备得到的荧光试剂，测量荧光试剂的初始荧光强度I0，然后每次向荧光试剂中加入4μL的H5N1血凝素蛋白溶液，直至加入至荧光试剂中的H5N1血凝素蛋白的总浓度为5/3μg/mL，并测量每次加入H5N1血凝素蛋白后的荧光试剂的荧光强度Ii(激发波长为423nm)，测试结果见图7。
从图5和图6中可知，随着H5N1血凝素蛋白浓度的增加，实施例1中的荧光试剂的发光强度逐渐增加。当荧光试剂中加入的H5N1血凝素蛋白溶液的体积为4μL-30μL时，即荧光试剂中H5N1血凝素蛋白的浓度为1/3μg/mL-2.5μg/mL时，荧光试剂的荧光强度变化率(Ii-I0)/I0与加入荧光试剂中的H5N1血凝素蛋白溶液的浓度存在一定的线性关系，线性方程为：(Ii-I0)/I0＝6.82564×X+0.00635，R2＝0.99991；其中，i表示1-6的正整数，R表示线性相关度，X表示加入荧光试剂中H5N1血凝素蛋白的浓度。
从图7中可知，随着H5N1血凝素蛋白浓度的增加，实施例4中的荧光试剂的发光强度逐渐增加。当荧光试剂中加入的H5N1血凝素蛋白溶液的体积为4μL-20μL时，即荧光试剂中H5N1血凝素蛋白的浓度为1/3μg/mL-5/3μg/mL时，荧光试剂的荧光强度变化率(Ii-I0)/I0与加入荧光试剂中的H5N1血凝素蛋白溶液的浓度存在一定的线性关系，线性方程为：(Ii-I0)/I0＝3.09843×X+1.16163，R2＝0.97919；其中，i表示1-5的正整数，R表示线性相关度，X表示加入荧光试剂中H5N1血凝素蛋白的浓度。
实验例4
为了说明本发明所述的荧光试剂能够在口腔环境下对H5N1血凝素蛋白的含量进行检测，将实施例5制备得到的化合物A的浓度为1×10-6mol/L、H5N1血凝素蛋白的浓度分别为0mg/L、1/3mg/L、2/3mg/L、1mg/L、4/3mg/L和5/3mg/L不同H5N1血凝素蛋白浓度的荧光试剂的荧光强度进行检测(激发波长为423nm)，测试结果见图8。
从图8中可知，随着H5N1血凝素蛋白浓度的增加，实施例5中的荧光试剂的发光强度逐渐增加。
实验例5
为了进一步说明本发明所述的荧光试剂的稳定性，以实施例1所述的荧光试剂为例，对其荧光稳定性进行测试，分为两组，一组常温储存，另一组低温冷藏(4℃)储存，测试初始荧光强度，以及在各自储存条件下储存1d、2d和3d后的荧光强度(取平均值计算方差)，其测试结果见图9。
从图9中可知，本发明所述荧光试剂的储存稳定性较好，检测灵敏度高。而化合物B-D，相对于化合物A，储存稳定性差，无法对流感病毒血凝素蛋白进行精密检测。
实验例6
为了进一步说明本发明所述的荧光试剂的对流感病毒血凝素蛋白的检测，所述的荧光试剂为例，向其中分别加入N1蛋白、H5蛋白、依次加入N1蛋白和H5蛋白以及依次加入H5蛋白和N1蛋白，然后的荧光强度进行检测，测试结果如图10所示。从图中可知，本发明所述的荧光试剂对流感病毒血凝素蛋白中的H5蛋白和N1蛋白的检测信号是叠加的关系。
实验例7
为了进一步探究本发明所述化合物A的荧光试剂对流感病毒血凝素蛋白的检测机理，对加入和未加入1.67μg/mL的H5N1血凝素的化合物A(10-6M)在水中的粒度分布进行测试，请参阅图11。从图11中可知，化合物A和血凝素H5的粒径分别为127.0和51.2nm，在化合物A中加入血凝素H5，粒径基本是化合物A和血凝素H5的粒径的叠加，血凝素H5的粒度分布仍然保留，化合物A的粒径略大，表明了化合物A和血凝素H5不形成大的聚集体，化合物A中小粒径的部分I-通过一些作用进入血凝素H5中的孔隙，从而实现对血凝素蛋白的检测。
对2.5μg/mL的血凝素以及2.5μg/mL的H5N1血凝素与化合物A(10-6M)的复合物进行了Zeta电位测试，以研究其机制，测试结果见图12。从图中可知，天然H5N1血凝素在H2O中具有ζ＝-13.8±1.7mV。通过与化合物A共同组装，表面电荷转变为中性，表明血凝素和化合物A的组装是受静电相互作用所驱动的。
为了阐明化合物A和H5血凝素蛋白之间相互作用的机制，进行了模拟计算。通过NCBI数据库的BLAST模块搜索PDB数据库中H5蛋白的同源结构。通过晶体结构的序列比较，序列相似性高于27％，因此提出5hu8用于蛋白质结构建模。通过分析靶蛋白同源结构的结合位点(PDB ID：5hu8)，靶蛋白的结合位点显示在图13(A)中。小分子和蛋白质的结合位点位于HA三聚体蛋白质的头部空腔中。此模拟使用AutoDock vina软件进行分子对接。对接结果如图所示。A链的Thr247，Asp113，Trp114和C链的ASN416分别与小分子的N+形成静电相互作用。蛋白质和小分子的对接得分为-6.38，表明两者的组合非常稳定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，其特征在于，包括化合物A、溶剂B和溶液C；
所述化合物A的结构式如下：
其中，X包括碘和溴中的任一种，R选自烷基中的任一种；
所述溶剂B包括二甲基亚砜、乙腈和二甲基甲酰胺中的一种或多种；
所述溶液C包括水、口腔拭子溶液或含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子溶液。
2.根据权利要求1所述的用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，其特征在于，所述荧光试剂中，化合物A的浓度为10-6mol/L-10-4mol/L，优选为10-6mol/L-9.0×10- 5mol/L，进一步优选为10-6mol/L。
3.根据权利要求1所述的用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，其特征在于，所述溶剂B与所述溶液C的体积比为1﹕(99-9999)，进一步优选为1﹕9999。
4.根据权利要求1所述的用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，其特征在于，所述口腔拭子溶液的制备方法包括：用采集拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，浸入采样液中，即得；
优选的，浸入3-4mL的采样液中；
优选的，所述采样液包括去离子水。
5.根据权利要求1所述的用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂，其特征在于，所述含H5N1血凝素蛋白的口腔拭子采样液中H5N1血凝素蛋白的浓度为0-1.8μg/mL。
6.权利要求1-5任一项所述的用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂的制备方法，其特征在于，将化合物A溶解于溶剂B中，加入溶液C，混合均匀，即得所述用于检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的荧光试剂。
7.权利要求1-5任一项所述的荧光试剂检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)绘制标准工作曲线；
(b)采集口腔拭子，浸入采样液，得到待测口腔拭子采样液；
(c)测试荧光试剂荧光强度，向荧光试剂中加入1-30μL的待测口腔拭子采样液，测试荧光强度；
优选的，所述荧光试剂用于检测口腔中浓度≥81.5ng/mL的H5N1血凝素蛋白。
8.根据权利要求7所述的荧光试剂检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，测试荧光强度后，对照标准工作曲线，得到口腔拭子中流感病毒血凝素蛋白的含量。
9.根据权利要求7所述的荧光试剂检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，用采集拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，浸入3-4mL采样液中；
优选的，所述采样液包括去离子水。
10.根据权利要求7所述的荧光试剂检测口腔中流感病毒血凝素蛋白的方法，其特征在于，所述标准工作曲线的绘制方法包括：
测试荧光试剂的初始强度I0，向荧光试剂中逐步加入流感病毒血凝素蛋白，并依次测试荧光强度Ii，绘制(Ii-I0)/I0与流感病毒血凝素蛋白加入量的标准工作曲线。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111474339A (zh) * 2020-04-17 2020-07-31 浙江康佰裕生物科技有限公司 一种利用荧光标记痘病毒颗粒的方法及其应用
CN112255212A (zh) * 2020-10-15 2021-01-22 天津大学 检测h5n1甲型流感病毒血凝素的方法
CN113008880A (zh) * 2021-02-26 2021-06-22 必为(上海)医疗器械有限公司 一种医疗器械残留血检测套装及其使用方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005121367A1 (en) * 2004-06-10 2005-12-22 Agency For Science, Technology And Research Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1
WO2010056744A2 (en) * 2008-11-11 2010-05-20 Vaxdesign Corp. Fluorescent neutralization and adherence inhibition assays
CN101886139A (zh) * 2009-05-11 2010-11-17 北京索奥生物技术有限公司 一种新型甲型流感病毒h1n1亚型双色荧光pcr检测方法及其试剂盒
US20130345090A1 (en) * 2009-09-22 2013-12-26 William Patterson Novel method for the selection of specific affinity binders by homogeneous noncompetitive assay
CN104844666A (zh) * 2015-03-31 2015-08-19 华东理工大学 含唾液酸糖基萘酰亚胺类化合物及其在流感病毒检测中的应用
CN107228844A (zh) * 2017-05-09 2017-10-03 北京理工大学 一种用于检测微量蛋白的实时“点亮”型荧光试剂
CN107917903A (zh) * 2016-10-09 2018-04-17 华东理工大学 糖基低维材料在甲型流感病毒荧光检测中的应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005121367A1 (en) * 2004-06-10 2005-12-22 Agency For Science, Technology And Research Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1
WO2010056744A2 (en) * 2008-11-11 2010-05-20 Vaxdesign Corp. Fluorescent neutralization and adherence inhibition assays
CN101886139A (zh) * 2009-05-11 2010-11-17 北京索奥生物技术有限公司 一种新型甲型流感病毒h1n1亚型双色荧光pcr检测方法及其试剂盒
US20130345090A1 (en) * 2009-09-22 2013-12-26 William Patterson Novel method for the selection of specific affinity binders by homogeneous noncompetitive assay
CN104844666A (zh) * 2015-03-31 2015-08-19 华东理工大学 含唾液酸糖基萘酰亚胺类化合物及其在流感病毒检测中的应用
CN107917903A (zh) * 2016-10-09 2018-04-17 华东理工大学 糖基低维材料在甲型流感病毒荧光检测中的应用
CN107228844A (zh) * 2017-05-09 2017-10-03 北京理工大学 一种用于检测微量蛋白的实时“点亮”型荧光试剂

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111474339A (zh) * 2020-04-17 2020-07-31 浙江康佰裕生物科技有限公司 一种利用荧光标记痘病毒颗粒的方法及其应用
CN112255212A (zh) * 2020-10-15 2021-01-22 天津大学 检测h5n1甲型流感病毒血凝素的方法
CN112255212B (zh) * 2020-10-15 2022-08-05 天津大学 检测h5n1甲型流感病毒血凝素的方法
CN113008880A (zh) * 2021-02-26 2021-06-22 必为(上海)医疗器械有限公司 一种医疗器械残留血检测套装及其使用方法

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