CN106093418A - 一种测定肌钙蛋白i的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种测定肌钙蛋白i的试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种测定肌钙蛋白I的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分：试剂R1：Tris缓冲液、氯化钠、聚乙二醇‑6000、叠氮钠，试剂R2：Tris缓冲液、牛血清白蛋白、叠氮钠、吐温‑80、甘油、胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的肌钙蛋白I的浓度。本发明具有测定准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定肌钙蛋白I的试剂盒及其制备方法。
背景技术
在诸多诊断急性心肌梗死（AMI）的临床生化指标中，CK-MB曾一度被认为是诊断AMI的“金标准”，已广泛应用多年，但随着对心肌肌钙蛋白（cTn）的深入研究，无论是对心肌的特异性还是诊断敏感性，CK-MB的地位都受到了严重挑战，肌钙蛋白（cTn）被认为是目前最好的确定标志物，正逐步取代CK-MB成为AMI的诊断“金标准”。
患有各种冠状动脉疾患的病人必然会发生心肌细胞损伤，有些病人的临床表现可能不完全符合WHO关于AMI诊断标准，例如不稳定心绞痛，但却伴有某些心肌损伤标志物升高，例如肌钙蛋白（cTn），cTnI在AMI后（3-6h）血中浓度很快升高，和CK-MB（3~8h）相当或稍早，它们测定的特异性和灵敏度明显高于CK-MB。cTn具有相当长的诊断窗口期，cTnI为7~9天。cTn对急性胸痛病人（无论有无骨骼肌损伤）的诊断均优于CK-MB。对心肌炎的诊断与CK活性相比，心肌炎时cTnT因其相对较高的血清检测值和较长的上升时间而具有较高的检测敏感性，血清cTnT可作为急性心肌炎的诊断标志物。
目前，主要采取化学发光、酶联荧光分析法对肌钙蛋白I（cTnI）进行检测，化学发光和酶联荧光分析法成本较高，且酶联荧光分析法操作繁琐，因此都不适合临床大量标本的检测，而且上述检测方法的测定准确度低，需要作出进一步的改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术成本高、操作复杂以及测定准确度低的缺陷，而提供一种测定肌钙蛋白I的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定肌钙蛋白I的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Tris缓冲液 30~210 mmol/L
氯化钠 150~300 mmol/L
聚乙二醇-6000 10~30 g/L
叠氮钠 0.2~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 30~210 mmol/L
牛血清白蛋白 6~24 g/L
叠氮钠 0.5~1.0 g/L
吐温-80 0.5~1.5 mL/L
甘油 20~45 mmol/L
胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体 1~8g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定肌钙蛋白I的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Tris缓冲液 120 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
聚乙二醇-6000 20 g/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 120 mmol/L
牛血清白蛋白 15 g/L
叠氮钠 0.8 g/L
吐温-80 1.0 mL/L
甘油 30 mmol/L
胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体 4 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的Tris缓冲液的pH值为8~10。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的Tris缓冲液的pH值为8~10。
作为优选，所述的的试剂R2中，所述的胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体的制备方法如下：
用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在20-37℃的条件下反应1小时，然后加入猝灭剂，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液继续稀释，在超声分散仪上超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，再将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为2.0%，超声分散，然后边搅拌边加入等体积的抗人肌钙蛋白I抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%，再加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的最终浓度为20 g/L为止，在4℃的条件下封闭8小时，即可制备得到胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体。
作为优选，所述的猝灭剂采用2,2’-硫代双镍、2-甲基-1,3-丁二烯、反-1,3-戊二烯中的一种。
作为优选，本发明还公开了上述测定肌钙蛋白I的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Tris缓冲液 30~210 mmol/L
氯化钠 150~300 mmol/L
聚乙二醇-6000 10~30 g/L
叠氮钠 0.2~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 30~210 mmol/L
牛血清白蛋白 6~24 g/L
叠氮钠 0.5~1.0 g/L
吐温-80 0.5~1.5 mL/L
甘油 20~45 mmol/L
胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体 1~8g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的肌钙蛋白I的浓度。
作为优选，步骤（b）中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为3：1。
作为优选，步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:20之间。
本发明的检测原理是：本发明所采用的原理为抗原抗体反应原理，样品中肌钙蛋白I可与试剂中相应的特异性抗-cTnI抗体结合形成抗原-抗体复合物，产生一定浊度，该浊度高低在一定抗体存在时与抗原的含量成正比，在一定波长下测定浊度并通过多点定标曲线可进行肌钙蛋白I的定量测定。
样本中肌钙蛋白I（cTnI）的活性（ng/mL）= CS × （ng/mL）
式中：ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS校准液中cTnI的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：
在牛血清白蛋白作为稳定剂的前提价下，添加了表面活性剂吐温-80，使得甘油作为助悬剂的溶解度增加，大大增加了胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体悬浮稳定性的增加，试剂的稳定性也就随之增加，也就有效的提高了对肌钙蛋白I测定的准确度的提高，再加上防腐剂叠氮钠使得整个试剂保存时间更长。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
Tris缓冲液 120 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
聚乙二醇-6000 20 g/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 120 mmol/L
牛血清白蛋白 15 g/L
叠氮钠 0.8 g/L
吐温-80 1.0 mL/L
甘油 30 mmol/L
胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体 4 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
Tris缓冲液 30 mmol/L
氯化钠 300 mmol/L
聚乙二醇-6000 30 g/L
叠氮钠 0.2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 30 mmol/L
牛血清白蛋白 24 g/L
叠氮钠 1.0 g/L
吐温-80 1.5 mL/L
甘油 45 mmol/L
胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体 8g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体的制备：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为3%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在26℃的条件下反应1小时，然后加入2,2’-硫代双镍，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液继续稀释，在超声分散仪上超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，再将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为2.0%，超声分散，然后边搅拌边加入等体积的抗人肌钙蛋白I抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%，再加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的最终浓度为20 g/L为止，在4℃的条件下封闭8小时，即可制备得到胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Tris缓冲液 120 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
聚乙二醇-6000 20 g/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 120 mmol/L
牛血清白蛋白 15 g/L
叠氮钠 0.8 g/L
吐温-80 1.0 mL/L
甘油 30 mmol/L
胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体 4 g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长520nm，副波长700nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取180μl试剂R1与24μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入60μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中肌钙蛋白I（cTnI）的活性（ng/mL）= CS × （ng/mL）计算出样本中的肌钙蛋白I的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体的制备：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为4%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在25℃的条件下反应1小时，然后加入2-甲基-1,3-丁二烯，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液继续稀释，在超声分散仪上超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，再将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为2.0%，超声分散，然后边搅拌边加入等体积的抗人肌钙蛋白I抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%，再加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的最终浓度为20 g/L为止，在4℃的条件下封闭8小时，即可制备得到胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体；
2、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Tris缓冲液 30 mmol/L
氯化钠 300 mmol/L
聚乙二醇-6000 30 g/L
叠氮钠 0.2 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 30 mmol/L
牛血清白蛋白 24 g/L
叠氮钠 1.0 g/L
吐温-80 1.5 mL/L
甘油 45 mmol/L
胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体 8g/L
其溶剂为纯化水；
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长520nm，副波长700nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取180μl试剂R1与24μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入60μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据样本中肌钙蛋白I（cTnI）的活性（ng/mL）= CS × （ng/mL）计算出样本中的肌钙蛋白I的浓度。
表1为实施例1所制得的测定肌钙蛋白I的试剂盒以及实施例2所制得的测定肌钙蛋白I的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的肌钙蛋白I的浓度为2.44 ng/mL，测定结果见表1：
表1
由表1可知，本发明所制得的测定肌钙蛋白I的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定肌钙蛋白I的试剂盒以及实施例2所制得的测定肌钙蛋白I的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的肌钙蛋白I的浓度为 4.71 ng/mL，测定结果见表2：
表2
| 第1次（ng/mL） | 第2次（ng/mL） | 第3次（ng/mL） | 均值（ng/mL） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 4.81 | 4.71 | 4.74 | 4.75 | 0.85 |
| 实施例2 | 4.77 | 4.78 | 4.75 | 4.77 | 1.27 |
由表2可知，本发明所制得的测定肌钙蛋白I的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定肌钙蛋白I的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定肌钙蛋白I的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定肌钙蛋白I的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.一种测定肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Tris缓冲液 30~210 mmol/L
氯化钠 150~300 mmol/L
聚乙二醇-6000 10~30 g/L
叠氮钠 0.2~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 30~210 mmol/L
牛血清白蛋白 6~24 g/L
叠氮钠 0.5~1.0 g/L
吐温-80 0.5~1.5 mL/L
甘油 20~45 mmol/L
胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体 1~8g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Tris缓冲液 120 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
聚乙二醇-6000 20 g/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 120 mmol/L
牛血清白蛋白 15 g/L
叠氮钠 0.8 g/L
吐温-80 1.0 mL/L
甘油 30 mmol/L
胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体 4 g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的Tris缓冲液的pH值为8~10。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的Tris缓冲液的pH值为8~10。
5.根据权利要求1或2所述的一种测定肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于：所述的的试剂R2中，所述的胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体的制备方法如下：用50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1%-5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐，在20-37℃的条件下反应1小时，然后加入猝灭剂，使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，去上清，再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液继续稀释，在超声分散仪上超声分散，再使用离心机，在25000 rpm/min的转速下离心30分钟，弃上清，再将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为2.0%，超声分散，然后边搅拌边加入等体积的抗人肌钙蛋白I抗体，直至聚苯乙烯微球的质量浓度为1%，再加入牛血清白蛋白，直至牛血清白蛋白的最终浓度为20 g/L为止，在4℃的条件下封闭8小时，即可制备得到胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体。
6.根据权利要求5所述的一种测定肌钙蛋白I的试剂盒，其特征在于：所述的猝灭剂采用2,2’-硫代双镍、2-甲基-1,3-丁二烯、反-1,3-戊二烯中的一种。
7.根据权利要求1或2所述的一种测定肌钙蛋白I的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Tris缓冲液 30~210 mmol/L
氯化钠 150~300 mmol/L
聚乙二醇-6000 10~30 g/L
叠氮钠 0.2~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Tris缓冲液 30~210 mmol/L
牛血清白蛋白 6~24 g/L
叠氮钠 0.5~1.0 g/L
吐温-80 0.5~1.5 mL/L
甘油 20~45 mmol/L
胶乳包被抗人肌钙蛋白I抗体 1~8g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的肌钙蛋白I的浓度。
8.根据权利要求7所述的一种测定肌钙蛋白I的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的试剂R1和试剂R2的体积比为3：1。
9.根据权利要求7所述的一种测定肌钙蛋白I的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:20之间。
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